宋 楊,楊見明

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,依據(jù)病理組織特征,甲狀腺癌有以下幾種類型:甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺髓樣癌、濾泡狀甲狀腺癌、甲狀腺未分化癌。在所有甲狀腺癌病理類型中甲狀腺乳頭狀癌是所有最為常見的一種[1]。部分甲狀腺乳頭狀癌患者會發(fā)展到侵入鄰近組織,預(yù)后較差。因此,闡明部分甲狀腺乳頭狀癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要意義[2-3]。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的進程中,新生血管生成是一個關(guān)鍵因素,也是甲狀腺乳頭狀癌局部頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要因素[4-5]。白細胞介素(interleukin,IL)-17 主要是17型T輔助細胞(Th17 細胞)表達的一種細胞因子。研究[6]顯示IL-17及其受體介導(dǎo)的信號通路參與血管生成和腫瘤的惡化。DLL4-Notch信號傳遞途徑參與誘導(dǎo)和挑選頂端細胞,在血管發(fā)生中扮演著重要角色[7-8]。然而,甲狀腺乳頭狀癌中 IL-17/白介素-17受體(interleukin-17 receptor,IL-17R)以何種方式介導(dǎo)DLL4-Notch信號通路,對甲狀腺乳頭狀癌新生血管生成產(chǎn)生影響尚不清楚。該研究構(gòu)建共培養(yǎng)體系模型模擬腫瘤微環(huán)境,觀察TPC-1對共培養(yǎng)體系中人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的影響,探討TPC-1與HUVECs 之間的作用機制,為甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌細胞(TPC-1)、HUVECs購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。TPC-1、HUVECs用含15%的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 U/ml青霉素鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長約80%融合度時進行相關(guān)實驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(美國 HyClone 公司);FBS(浙江天杭生物科技有限公司);重組人 IL-17A (美國 Peprotech 公司);抗 DLL4、抗 Notch多克隆抗體(美國 Immuno Way 公司);GAPDH 抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);抗 IL-17R多克隆抗體(英國Abcam公司);HES、HEY、VEGFR-1、VEGFR-2(美國Cell Signaling 公司);山羊抗兔二抗(美國 ABclonal 公司);PMSF、RIPA 裂解液(強)、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、胰酶、一抗稀釋液、二抗稀釋液(上海碧云天生物有限公司);Matrigel Basement Membrane Matrix、Transwell 小室(美國 Corning 公司);CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2.2主要儀器 NAPCO-8800 型恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國 SHELLAB 公司);Olympus IX-71 型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);Western blot 電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1建立腫瘤-內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)體系 將5×104個密度的TPC-1細胞接種在Transwell小室的6孔板底部,1×105個密度的HUVECs細胞接種在 Transwell 小室的上層,上、下室分別加入2 ml和3 ml含有FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液, 于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。利用Transwell將HUVECs和TPC-1細胞置于同一培養(yǎng)體系中, 構(gòu)建腫瘤細胞與腫瘤血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)模型。

1.3.2遷移實驗檢測IL-17 刺激劑對共培養(yǎng)體系中HUVECs遷移能力的影響 該研究分為2組:NC-HUVECs組(對照組)、IL-17A-HUVECs組。制備細胞懸液,使用24孔Transwell系統(tǒng)(嵌套膜孔徑8 μm)。先于下層小室接種TPC-1細胞,12 h后,于上層接種HUVECs,2種細胞接種密度均為1×105個。以50 ng/ml的重組人 IL-17A干預(yù)細胞,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)完成后,取出小室,用4%的多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察并拍照,隨機選擇3個視野進行比較,實驗重復(fù) 3 次。

1.3.3體外成管實驗檢測IL-17 刺激劑對共培養(yǎng)體系中 HUVECs成管能力的影響 該研究分為2組:NC-HUVECs組(對照組)、IL-17A-HUVECs組。HUVECs與TPC-1共培養(yǎng)24 h,鋪基質(zhì)膠,模擬體內(nèi)HUVECs遷移并形成血管的微環(huán)境。將RPMI-1640培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠以體積1 ∶9的比例均勻混合,以每孔50 μl的量加入96孔板中,96孔板在37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜備用,在基質(zhì)膠中加入HUVECs,取 3×103/ml HUVECs 接種于96孔板中,設(shè)3個平行復(fù)孔。觀察基質(zhì)膠上HUVECs形成的小管并計數(shù),3 d后觀察并照相,在倒置顯微鏡下任取10個視野計數(shù)成管數(shù)(個)。

1.3.4CCK-8 法檢測IL-17 刺激劑對共培養(yǎng)體系中HUVECs增殖的影響 選用TPC-1細胞與HUVECs共培養(yǎng),該研究分為2組:NC-HUVECs組(對照組)、IL-17A-HUVECs組。使用96孔Transwell系統(tǒng)(嵌套膜孔徑0.4 μm)。下層接種4×103個TPC-1細胞,12 h后于上層接種2×103個HUVECs。50 ng/ml重組人IL-17A干預(yù)細胞,共培養(yǎng)6 h,每種處理設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后,棄下層培養(yǎng)基,在上層每孔中加入10 μl CCK-8 溶液,在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h 后用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.3.5IL-17R基因載體構(gòu)建 本研究遵循設(shè)計原則,根據(jù)人IL-17R 基因編碼序列,設(shè)計干擾慢病毒及相關(guān)陰性對照,PCR 擴增得到目的基因IL-17R cDNA片段。純化后經(jīng)Age I酶切消化,對載體質(zhì)粒進行酶切、線性化載體片段回收獲得。酶切后連接產(chǎn)物利用 PCR 凝膠電泳鑒定,并對序列進行檢測。

1.3.6細胞轉(zhuǎn)染 選取對數(shù)生長期的TPC-1細胞,胰酶消化,接種于6 孔板中,設(shè)pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R 組、pLKO.1-EGFP-Puro 空載體組及對照組。以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)等于10的指數(shù)轉(zhuǎn)染細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將2 μl的5 μg/ml poly-brene加入轉(zhuǎn)染細胞,根據(jù)細胞狀態(tài)10 h換液1次。轉(zhuǎn)染72 h后,GFP熒光的時間和表達強度采用GFP 熒光計數(shù)法觀察來確定轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染成功后將各組細胞轉(zhuǎn)移至細胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng),得到穩(wěn)定的細胞。6 h后更換新鮮培養(yǎng)基,24～48 h后觀察IL-17R表達情況。Western blot法、RT-PCR法檢測IL-17融合基因的表達。

1.3.7RT-PCR法檢測IL-17R的表達情況 該研究分為4組:GFP-NC組(對照組)、GFP-IL-17R-sh1組、GFP-IL-17R-sh2組、GFP-IL-17R-sh3組。按試劑盒說明書步驟提取轉(zhuǎn)染后各組細胞的總 RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計引物序列,將以含有擴增序列的cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后記錄各組實驗結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)參,分析各組IL-17R的表達。

1.3.8pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染的TPC-1細胞和HUVECs體外雙層共培養(yǎng)模型的建立 將5×104個密度的HUVECs接種在Transwell小室的6孔板底部,將1×105個密度的pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染的TPC-1細胞接種在Transwell小室的上層,上、下室分別加入2 ml和3 ml含有FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液, 于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。利用Transwell 將 HUVECs 細胞和TPC-1細胞置于同一培養(yǎng)體系中, 構(gòu)建腫瘤細胞與腫瘤血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)模型。

1.3.9Western blot法檢測共培養(yǎng)體系中DLL4-Notch信號通路和血管新生蛋白表達水平 選用轉(zhuǎn)染后的TPC-1 細胞與HUVECs共培養(yǎng),加入50 ng/ml 的IL-17刺激劑。選用TPC-1 細胞與HUVECs共培養(yǎng),加入50 ng/ml的IL-17刺激劑和DLL4-Notch 通路抑制劑 DAPT。收集各組細胞,每組約5×105個,離心棄培養(yǎng)液,沉淀用PBS洗滌2次,棄上清液。按1×106個細胞加入100 μl RIPA蛋白裂解液+1 μl PMSF蛋白酶抑制劑的比例裂解細胞。4 ℃傾臥30 min 后,4 ℃、14 000 r/min離心15 min,收集上清液,-80 ℃保存?zhèn)溆?需在冰上完成以上操作。BCA 法蛋白定量,每泳道20 μl蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳,在轉(zhuǎn)移緩沖液中,以 200 mA 的電流轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。后封閉2 h,再加入抗DLL4、Notch、HES、HEY、VEGFR-1、VEGFR-2抗體,均按照 1∶1 000進行稀釋,4 ℃孵育過夜。洗滌后,以辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗按照 1 ∶5 000進行稀釋,室溫孵育2 h,ECL 試劑盒顯色。用 Image-Pro plus 圖像處理系統(tǒng)分析計算灰度值。

2 結(jié)果

2.1 IL-17刺激劑促進共培養(yǎng)系統(tǒng)中HUVECs遷移的能力遷移實驗結(jié)果顯示,IL-17A-HUVECs組細胞穿過小室底的細胞數(shù)高于NC-HUVECs組(t=5. 428,P<0.01)?？梢园l(fā)現(xiàn)與NC-HUVECs組比較,經(jīng)IL-17刺激劑誘導(dǎo)后HUVECs的遷移能力得到顯著增強,見圖1。

圖1 重組人IL-17A對共培養(yǎng)系統(tǒng)中HUVECs 遷移的影響 ×200

2.2 IL-17刺激劑促進共培養(yǎng)系統(tǒng)中HUVECs 管腔生成的能力管腔生成實驗顯示,IL-17A-HUVECs組將加入50 ng/ml IL-17刺激劑的TPC-1細胞和HUVECs共培養(yǎng)后,IL-17A-HUVECs組、NC-HUVECs組管腔生成率為(120.92±8.75)%,(30.71±6.37)%,管腔生成能力得到顯著增強,與NC-HUVECs組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=8.758,P<0.01) 。提示IL-17能夠促進HUVECs的管腔生成能力,見圖2。

圖2 重組人IL-17A對共培養(yǎng)系統(tǒng)中HUVECs 管腔生成能力的影響 ×200

2.3 IL-17刺激劑促進共培養(yǎng)體系中HUVECs的增殖能力CCK-8 法檢測顯示,IL-17刺激劑干預(yù)濃度為50 ng/ml時,與TPC-1細胞共培養(yǎng)的HUVECs 增殖能力顯著增強,IL-17A-HUVECs組與NC-HUVECs組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=6.542,P<0.01) 。IL-17刺激劑干預(yù)可顯著促進共培養(yǎng)體系中 HUVECs 的增殖能力,見圖3。

圖3 重組人IL-17A對共培養(yǎng)系統(tǒng)中HUVECs增殖的影響與NC-HUVECs組比較:**P<0.01

圖4 TPC-1細胞轉(zhuǎn)染pLKO.1-EGFP-IL-17R后IL-17R mRNA 的表達量與GFP-NC組比較:**P<0.01

2.4 RT-PCR驗證穩(wěn)定細胞株中 IL-17R的表達采用 RT-PCR實驗觀察 pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染后的甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株中IL-17R mRNA 表達水平變化情況,結(jié)果顯示: 各組中IL-17R mRNA表達水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.197,P<0.01),其中 GFP-IL-17R-sh3干擾效果最明顯(P<0.01),效率最高,見圖 4。

2.5 Western blot法驗證IL-17R蛋白的表達采用 Western blot法檢測pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染后的甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株中 IL-17R 蛋白表達變化,結(jié)果顯示: 與GFP-NC組比較,GFP-IL-17R-sh2、 GFP-IL-17R-sh3沉默組中 IL-17R蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7. 268,P<0.01),其中 GFP-IL-17R-sh3組沉默效率最高,見圖5。

圖5 Western blot檢測人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株轉(zhuǎn)染pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R后IL-17R蛋表達

2.6 調(diào)控TPC-1細胞IL-17R對甲狀腺乳頭狀癌新生血管生成的影響為了明確IL-17/IL-17R對甲狀腺乳頭狀癌血管生成的影響,該研究采用 Western blot 實驗觀察pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染后的TPC-1細胞株共培養(yǎng)體系中HUVEC的VEGFR-1、VEGFR-2和DLL4/Notch信號通路中關(guān)鍵蛋白表達水平的變化情況。該研究分為三組:TPC-1+HUVECs組(對照組)、TPC-1+HUVECs+sh-IL-17R組、TPC-1+HUVECs+sh-IL-17R+IL-17A組。結(jié)果顯示: sh-IL-17R組中 DLL4、Notch、HES、HEY和 VEGFR-1、VEGFR-2蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.758,P<0.01); sh-IL-17R+IL-17組經(jīng) 50 ng/ml重組人IL-17A干預(yù)6 h后,細胞中DLL4、Notch、HES、HEY和 VEGFR-1、VEGFR-2的表達水平得到不同程度的上調(diào),與TPC-1+HUVECs+sh-IL-17R組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=8.285,P<0.01),見圖6。

圖6 Western blot法檢測pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染后的TPC-1細胞株共培養(yǎng)HUVEC體系中的DLL4/Notch信號通路相關(guān)分子蛋白表達

2.7 IL-17/IL-17R可能通過激活DLL4/Notch信號通路促進甲狀腺乳頭狀癌的血管生成為了明確DLL4/Notch信號通路在IL-17/IL-17R促進甲狀腺乳頭狀癌的血管生成的作用,在IL-17 刺激劑下TPC-1細胞和HUVECs共培養(yǎng)體系中加入 DLL4-Notch 通路抑制劑 DAPT,分為3組:TPC-1+HUVECs組(對照組)、TPC-1+HUVECs+IL-17A組、TPC-1+HUVECs+IL-17A+DAPT組。Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,TPC-1+HUVECs+IL-17A組HUVECs中DLL4、HES、HEY和VEGFR-1、VEGFR-2蛋白表達均上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.852,P<0.01), TPC-1+HUVECs+IL-17A+DAPT組HES、HEY和 VEGFR-1、VEGFR-2蛋白表達均低于 TPC-1+HUVECs+IL-17 組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.329,P<0.01),見圖7。

圖7 Western blot檢測在IL-17刺激劑下TPC-1細胞和HUVECs共培養(yǎng)體系中加入 DLL4-Notch 通路抑制劑 DAPT相關(guān)分子蛋白表達

3 討論

研究[9]表明,血管生成在甲狀腺乳頭狀癌的生長和轉(zhuǎn)移中具有重要作用,與甲狀腺癌發(fā)病密切相關(guān)。在腫瘤進展過程中,血管及淋巴管生成是最基本的因素,也是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移需要血管生成提供必要的營養(yǎng)[10]。很多研究在胰腺癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn),在腫瘤致病和侵襲轉(zhuǎn)移中,IL-17及其受體介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮重要作用。研究[11]顯示IL-17可以誘導(dǎo)腫瘤的新生血管生成,促進腫瘤細胞增殖,抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,在TPC-1-HUVECs共培養(yǎng)系統(tǒng)中,加入50 ng/ml IL-17刺激劑的TPC-1細胞與HUVECs共培養(yǎng)6 h后,可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-17刺激劑誘導(dǎo)后HUVECs的遷移能力顯著增強。CCK-8法檢測顯示共培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細胞遷移能力顯著高于共培養(yǎng)對照組,管腔生成實驗發(fā)現(xiàn),50 ng/ml的IL-17刺激劑促進共培養(yǎng)體系中HUVECs的管腔生成能力。本研究通過細胞功能學(xué)實驗觀察到以重組人IL-17A(50 ng/ml)為刺激劑可以促進 HUVECs的遷移、增殖和管腔生成能力。多種信號通路參與調(diào)控腫瘤的血管生成,除最重要最典型的VEGF信號通路外,研究[12]顯示DLL4-Notch信號通路在這其中也發(fā)揮了重要作用。研究[13]表明IL-17刺激誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞的NOTCH1活化,導(dǎo)致炎性基因表達增強伴隨著細胞增殖和成熟受損。IL-17單克隆抗體 Secukinumab聯(lián)合IL-35可阻斷Notch信號通路,與未治療組比較,治療用 IL-17單克隆抗體 Secukinumab聯(lián)合IL-35可有效抑制Notch的下游基因信號通路(HES和HEY)的表達,同時還原肝癌細胞的侵襲性遷移能力[14]。DLL4是通過與Notch受體結(jié)合來完成腫瘤血管新生的調(diào)控。HES、HEY是 Notch 信號通路的靶基因。在人類動脈血管內(nèi)皮細胞的研究中,發(fā)現(xiàn) HES、HEY是Notch信號通路的脈管系統(tǒng)中下游效應(yīng)因子,HES、HEY的激活可以促進血管生成細胞芽生,還能誘導(dǎo)血管形成模式的改變,很多研究[15]表明調(diào)控腫瘤新生血管形成過程中HES、HEY可能發(fā)揮重要作用。為了明確IL-17/IL-17R對甲狀腺乳頭狀癌血管生成的影響,該研究通過慢病毒pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染TPC-1細胞共培養(yǎng)HUVECs,通過轉(zhuǎn)染后PCR和Western blot檢測驗證轉(zhuǎn)染是成功的,Western blot檢測pLKO.1-EGFP-Puro-IL-17R轉(zhuǎn)染后的TPC-1細胞共培養(yǎng)HUVECs體系中的DLL4-Notch信號通路和血管新生蛋白表達水平,結(jié)果顯示: sh-IL-17R+IL-17A組經(jīng)50 ng/ml重組人IL-17A干預(yù)6 h后,細胞中DLL4、Notch、HES、HEY和 VEGFR-1、VEGFR-2的表達水平得到不同程度的上調(diào),IL-17可以逆轉(zhuǎn)由于IL-17R沉默所導(dǎo)致DLL4、Notch、HES、HEY和 VEGFR-1、VEGFR-2表達水平降低。提示IL-17/IL-17R可能激活TPC-1細胞共培養(yǎng)HUVECs中DLL4/Notch信號通路,促進甲狀腺乳頭狀癌新生血管生成。為了明確DLL4/Notch信號通路在IL-17/IL-17R促進甲狀腺乳頭狀癌的血管生成的作用,本研究在IL-17刺激劑下TPC-1細胞和HUVECs共培養(yǎng)體系中加入DLL4-Notch 通路抑制劑DAPT,Western blot 檢測結(jié)果顯示: TPC-1+HUVECs+IL-17A+DAPT組HES、HEY和 VEGFR-1、VEGFR-2蛋白表達均顯著低于TPC-1+HUVECs+IL-17組。提示DLL4/Notch信號通路可能在IL-17/IL-17R促進甲狀腺乳頭狀癌新生血管生成中起到重要作用。

綜上所述,在TPC-1-HUVECs共培養(yǎng)系統(tǒng)中,IL-17/IL-17R可以激活DLL4/Notch信號通路,然后誘導(dǎo)靶基因HES、HEY和VEGFR-1、VEGFR-2表達增加。IL-17可以促進TPC-1-HUVECs共培養(yǎng)系統(tǒng)中HUVECs的遷移、增殖和管腔生成能力。所以,IL-17/IL-17R可能通過DLL4/Notch 信號通路促進甲狀腺乳頭狀癌新生血管生成。