丹參酚酸B對Hela細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的研究

王文瑾,張曉雨,劉保安,李 振

(臨沂大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,山東 臨沂 276000)

宮頸癌是全球危害女性健康的第二大癌癥,我國每年約有100 000新發(fā)病例[1]。目前,臨床上治療宮頸癌的主要方法有手術(shù)、放療、化療、免疫及靶向治療等。但傳統(tǒng)的化療藥物不良反應(yīng)較多,腫瘤細(xì)胞會不同程度地產(chǎn)生耐藥性,嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用及療效,故而從天然產(chǎn)物中尋求不良反應(yīng)少、毒性較低的防治藥物已成為研究熱點。

丹參酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)是從丹參植物根莖中提取的縮酚酸類多羥基化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化,改善腎功能,促進(jìn)纖維蛋白溶解,抗凝血、抗血栓及抗缺血損傷,防治心血管系統(tǒng)疾病,保護(hù)肝臟損傷,防治神經(jīng)毒性等功能。近幾年,藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),丹參酚酸B對大腸癌細(xì)胞[2-3]、肝癌細(xì)胞[4]等具有較好的抑制效果,可有效逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥,發(fā)揮減毒增效作用[5-6]。目前,關(guān)于SalB對宮頸癌Hela細(xì)胞抑制作用的研究未見報道。本研究探討了丹參酚酸B對Hela細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響,為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

丹參酚酸B(成都儀捷睿生物科技有限公司生產(chǎn))、人宮頸癌Hela細(xì)胞株(臨沂大學(xué)藥理學(xué)實驗室生產(chǎn))、DMEM高糖(含丙酮酸鈉)(北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn))、胎牛血清(Ausbian公司生產(chǎn))、PBS緩沖液(Merck公司生產(chǎn))、青霉素-鏈霉素溶液(Merck公司生產(chǎn))、胰酶消化液(杭州浦泰生物科技有限公司生產(chǎn))、噻唑藍(lán)(MTT)(Merck公司生產(chǎn))、RPMI1640培養(yǎng)基(杭州銘特生物科技有限公司生產(chǎn))、二甲基亞砜(細(xì)胞培養(yǎng)級)(新睿生物科技有限公司生產(chǎn))、細(xì)胞培養(yǎng)板(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn))、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn))。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(萊特科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化生產(chǎn)設(shè)備有限公司生產(chǎn))、離心機(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn))、倒置顯微鏡(奧林巴斯株式會社生產(chǎn))、超低溫冰箱(濟(jì)南好來寶醫(yī)療器材有限公司生產(chǎn))、電子天平(梅特勒托利公司生產(chǎn))、DHG-9035A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?！憧萍加邢薰旧a(chǎn))、流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司生產(chǎn))、凋亡檢測試劑盒(美國BD Biosciences公司生產(chǎn))、全波長酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司生產(chǎn))、LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn))。

2 實驗方法

2.1 Hela細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)

取凍存的宮頸癌Hela細(xì)胞株,用常規(guī)方法復(fù)蘇后,將Hela細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基(含90%DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素)中,于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d,細(xì)胞生長到對數(shù)期,采用胰蛋白酶消化液(0.25%)處理,制成Hela細(xì)胞懸液。

2.2 SalB對Hela細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法,測定Hela細(xì)胞增殖情況。將對數(shù)期Hela細(xì)胞(2×104/mL)按100 μL/孔接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h,分別加入SalB,使其濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL,每組設(shè)置5個重復(fù),并保留空白對照組,培養(yǎng)Hela細(xì)胞72 h后,加入20 μL濃度為5g/L的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)Hela細(xì)胞4 h,棄去上清液,以每孔150 μL加入DMSO溶液,搖床振蕩10 min,用全波長酶標(biāo)儀測定Hela細(xì)胞培養(yǎng)液在490 nm波長處的吸光度值(A)[7]。計算Hela細(xì)胞增殖抑制率,Hela細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(A空白對照組-A實驗組)/A空白對照組]×100%。

2.3 SalB對Hela細(xì)胞遷移抑制率的影響

取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h,貼壁,細(xì)胞生長至100%,每孔用滅菌槍頭做3條平行劃痕,PBS清洗3遍,除去劃下的懸浮Hela細(xì)胞,用倒置顯微鏡對劃痕拍照,以含2%胎牛血清培養(yǎng)基配制不同濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL)SalB,培養(yǎng)細(xì)胞24 h,對劃痕進(jìn)行拍照,采用Image J軟件,計算細(xì)胞培養(yǎng)板各組劃痕面積S,并計算Hela細(xì)胞遷移抑制率[8]。Hela細(xì)胞遷移抑制率(%)=[1-(S0h-S24h)/S0h]×100%。

2.4 SalB對Hela細(xì)胞凋亡率的影響

取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,過夜培養(yǎng),貼壁。分別加入0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL SalB作用48 h,收集Hela細(xì)胞。采用凋亡試劑盒進(jìn)行染色,以流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率[9]。

3 實驗結(jié)果

3.1 MTT法檢測SalB對Hela細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測SalB對Hela細(xì)胞增殖的影響,實驗結(jié)果見表1。當(dāng)SalB濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL時,對Hela細(xì)胞增殖均具有抑制作用,細(xì)胞增殖抑制率分別為56.56%、66.84%、70.98%、75.90%、83.40%、91.31%、95.70%,且隨SalB濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制率不斷升高。

表1 SalB對Hela細(xì)胞增殖的影響

3.2 SalB對Hela細(xì)胞遷移抑制率的影響

劃痕實驗測定SalB對Hela細(xì)胞遷移抑制率的影響,實驗結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,分別用0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mLSalB處理Hela細(xì)胞24 h后,SalB對Hela細(xì)胞遷移的抑制率分別為51.20%、67.00%、73.00%、79.10%、89.50%、96.10%、98.70%,0.15 mg/mL的SalB處理Hela細(xì)胞,能明顯抑制細(xì)胞的遷移能力。但當(dāng)SalB濃度增加到0.15 mg/mL后,SalB對Hela細(xì)胞遷移抑制作用增加不明顯。

表2 SalB對Hela細(xì)胞遷移抑制率的影響

3.3 SalB對Hela細(xì)胞凋亡率的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測Hela細(xì)胞凋亡率,實驗結(jié)果見表3。分別用0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL SalB作用Hela細(xì)胞48 h后,細(xì)胞凋亡率分別為1.06%、3.79%、9.64%、14.47%、23.23%、30.18%、37.25%、41.32%。說明SalB可促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡,且隨著SalB濃度的增加而不斷增強。

表3 SalB對Hela細(xì)胞凋亡率的影響

4 討論

丹參是常用的傳統(tǒng)中藥,含有二萜醌類、酚酸類及其他類化合物,具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等作用。研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA可抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、遷移、誘導(dǎo)凋亡及分化[10]。王冬[11]等采用細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,取0～8.0 μg/mL濃度的丹參酮ⅡA作用Hela細(xì)胞72 h,可明顯抑制并誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。沈雋[12]等報道,丹參酮ⅡA能加快HeLa細(xì)胞凋亡,用藥48h后,可使Bcl-2基因mRNA的表達(dá)水平明顯降低,CX43表達(dá)上調(diào),SKP2表達(dá)減少[13]。

丹參素是丹參的主要有效成分。唐艷[14]等報道,丹參素濃度在20～100 μg/mL時,能抑制Hela細(xì)胞增殖,降低Hela細(xì)胞遷移能力。湯中杰[2]等在前期體、內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn),丹參酚酸B具有明確的抗癌作用。這與本研究結(jié)果一致。在一定濃度范圍內(nèi),丹參酚酸B量效相關(guān)性抑制大腸癌LOVO細(xì)胞生長,濃度依賴性抑制LOVO細(xì)胞SOX2OT表達(dá),抑制LOVO細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[2]。郭飄婷[15]等研究發(fā)現(xiàn),SalB能促進(jìn)大腸癌HCT-116細(xì)胞內(nèi)ROS水平,阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期,進(jìn)而量效相關(guān)性抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。丹參酚酸B可作為自噬誘導(dǎo)劑,通過PI3K/Akt通路抑制,抗結(jié)直腸癌細(xì)胞[16],使肝癌SMMC7721和HepG2細(xì)胞的AT1R表達(dá)下調(diào),VEGF的分泌減少,以旁分泌的形式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而影響腫瘤血管的生成[17]。Yang[18]等報道,丹參酚酸B對口腔鱗狀癌細(xì)胞生長抑制作用機制可能與腫瘤血管的生成過程中某些關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)減少有關(guān)。但關(guān)于SalB抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的作用機制未見報道,有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

實驗結(jié)果表明,SalB對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用,并影響Hela細(xì)胞遷移率,誘導(dǎo)其凋亡。該研究可為進(jìn)一步探討其抗腫瘤作用機制及臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。