高 源，鄭 剛*，齊 靖，張 鳳

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 科研科，陜西 咸陽 712046)

炎性級聯(lián)反應在心臟病發(fā)病中扮演重要角色,抑制炎性反應可有效治療心臟病[1]。炎性小體是多種蛋白質(zhì)復合物,在炎性反應中處于關鍵位置,可以募集相關炎性細胞誘發(fā)炎性級聯(lián)反應。目前發(fā)現(xiàn)的炎性小體主要有Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白(Nod-like receptor pyrin domain-containing protein,NLRP)NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、AIM2及Pyrin等。對NLRP3的研究較深入,其可以與ASC及pro-caspase-1形成炎性體,并進一步引導IL-1β和IL-18炎性介質(zhì)的成熟和分泌,誘發(fā)炎性反應。激活NLRP3炎性小體是誘發(fā)心臟病的主要因素,抑制其激活,可能是未來治療心臟病的潛在干預靶點[2]。

1 NLRP3炎性小體概述

NLRP3炎性小體由Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)、凋亡相關的斑點蛋白(apoptosis related spot protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(caspase-1)組成[3]。NLRP3包含3個結構域:C端富含亮氨酸重復序列(leucine-rich-repeats,LRRs)、中心核苷酸結合寡聚結構域(nucleotide-binding and oligomerization domain,NACHT),以及熱蛋白結構域(N-terminal pyrin domain,PYD)。正常生理條件下NACHT與 LRRs 結合使NLRP3炎性小體處于抑制狀態(tài)。NLRP3炎性小體激活后促進pro-caspase-1成熟為具有活性的caspase-1。caspase-1一方面是IL-1β、IL-18轉化酶,可將pro-IL-1β、pro-IL-18裂解為具有活性形式IL-1β、IL-18,另一方面通過促進膜穿孔蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)活化引導細胞焦亡[4]。

1.1 NLRP3炎性小體的激活

NLRP3激活的起始步驟是模式識別受體發(fā)出的“啟動”信號,通過NF-κB激活從而導致NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的過度表達?！皢印敝笫筃LRP3激活,其分子機制尚不完全清楚,目前主要有4種觀點[5]。

1.1.1 K+外流與NLRP3 炎性小體的激活:NLRP3炎性小體激活需要細胞質(zhì)中K+外流,約50%細胞內(nèi)K+外流可引起ATP激活,并通過嘌呤離子通道型7(purinergic ionotropic,P2X7)受體激活NLRP3炎性小體。尼日利亞霉素是一種K+載體,可導致膜孔形成,從而觸發(fā)K+外流激活NLRP3炎性小體。降低細胞內(nèi)K+足以在體外誘導NLRP3炎性小體激活。相反,通過K+通道抑制劑格列本脲阻斷K+外流或增加細胞外K+濃度均可抑制NLRP3炎性小體激活[5]。

1.1.2 Ca2+信號失調(diào)與 NLRP3 炎性小體激活:NLRP3激活與細胞內(nèi)Ca2+儲存和釋放有關,多種NLRP3激活劑可調(diào)控Ca2+信號調(diào)控。降低細胞內(nèi)儲存的Ca2+及抑制細胞外Ca2+內(nèi)流,從而抑制NLRP3激活[6]。

1.1.3 線粒體功能失調(diào)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)與 NLRP3 炎性小體激活:已知的NLRP3激活劑都會產(chǎn)生ROS,ROS清除劑可抑制NLRP3炎性小體激活。ROS水平增加是NLRP3激活的必要條件,線粒體是NLRP3激活的主要ROS來源,線粒體DNA和線粒體外膜蛋白電壓依賴性陰離子通道(mitochondrial outer membrane protein voltage dependent anion channel,VDAC)對于線粒體產(chǎn)生ROS都是必不可少的。VDAC表達減少的細胞對NLRP3激活劑的活化受到抑制[7]。

1.1.4 溶酶體破裂與 NLRP3 炎性小體激活:細胞吞噬結晶樣物質(zhì)而不能將其溶解時會導致溶酶體損傷和破裂,進而促使溶酶體組織蛋白酶B的釋放并激活細胞質(zhì)中NLRP3炎性小體,提示組織蛋白酶B可能作用于NLRP3炎性小體本身或者切割NLRP3炎性小體某一部分從而觸發(fā)其激活[8]。

2 NLRP3炎性小體與心力衰竭的關系

NLRP3炎性小體在心力衰竭(heart failure,HF)的發(fā)病和預后中起著重要作用[9]。有報道,隨著心肌肥厚、炎性反應和心室擴張,血清中NLRP3 mRNA水平升高?；蛳贜LRP3或給予IL-1β受體拮抗劑可以減輕心臟炎性反應并挽救心肌收縮功能障礙。雷公藤內(nèi)酯醇可通過抑制NLRP3炎性小體來減輕HF小鼠的心肌重塑和改善心功能。格列本脲抑制NLRP3炎性小體可改善心肌收縮功能障礙[10]。

HF患者血清中NLRP3、caspase-1和IL-1β水平隨心功能的嚴重程度而逐級增高。NLRP3水平與NT-proBNP水平及單核細胞計數(shù)直接相關,與左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)呈負相關。HF患者的IL-1β和IL-18升高,其活性與HF癥狀和預后相關[11]。IL-1β和IL-18抑制心肌細胞收縮和對腎上腺素能受體刺激的敏感性。通過降低IL-1β或IL-18活性或阻斷IL-1β的下游信號轉導更有利于改善HF患者臨床癥狀與預后。IL-1β抑制劑(IL-1βRa或canakinumab)在早期臨床試驗中被證明對射血分數(shù)保留性心力衰竭或射血分數(shù)減低型心力衰竭患者有效[12]。一項涉及54例HF患者的臨床試驗報告中顯示,與對照組相比,運動組的caspase-1募集域(apoptosis-associated speck-like protein with a caspase recruitment domain,ASC)甲基化增加,血漿IL-1和ASC mRNA水平降低,表明運動通過ASC的表觀遺傳調(diào)節(jié)促進HF更好的結局[13]。心臟重塑和纖維化是HF發(fā)展的主要機制,成纖維細胞在NLRP3炎性小體激活過程中也表現(xiàn)出更早和更顯著的活動,抑制NLRP3炎性小體活化可以逆轉心肌纖維化過程,從而影響HF的發(fā)病過程。

3 NLRP3炎性小體與動脈粥樣硬化的關系

炎性反應可導致動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊不穩(wěn)定和破裂,進而引發(fā)急性冠脈綜合征。慢性炎性反應可導致AS血栓形成的各個階段,包括早期斑塊形成、斑塊生長以及心肌梗死、卒中和心血管事件發(fā)生前的急性斑塊破裂[14]。

NLRP3炎性小體通過模式識別受體相關信號通路參與AS的炎性反應過程。NLRP3炎性小體在AS中的重要作用,使用低密度脂蛋白受體(LDLR-)缺陷小鼠高脂飲食8周后,NLRP3、ASC、IL-1和IL-18表達水平降低,AS病變減弱。還發(fā)現(xiàn)IL-18結合蛋白不僅可以減弱主動脈斑塊形成進程,還可以減少病變中的淋巴細胞浸潤和脂質(zhì)含量,從而對動脈粥樣硬化起到保護作用[15]。

ROS在氧化應激和AS斑塊形成過程中起著重要作用,ROS的過度生成誘導凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)的表達,LOX-1是免疫系統(tǒng)的有效調(diào)節(jié)因子,并在AS的發(fā)展中起重要作用。在培養(yǎng)的人巨噬細胞THP-1暴露于脂多糖顯著誘導LOX-1和ROS的表達,并引發(fā)線粒體DNA損傷,導致細胞自噬并激活NLRP3炎性小體。用結合抗體或siRNA抑制LOX-1可阻止隨后的一系列事件。ROS抑制劑和自噬誘導劑都降低了NLRP3炎性小體的表達。DNA酶Ⅱ siRNA轉染實驗也證實LOX-1介導的自噬和線粒體DNA損傷在多種心血管疾病發(fā)病中NLRP3炎性小體激活起著重要作用的假說[16]。

4 NLRP3炎性小體與心肌梗死的關系

炎性反應在心肌梗死后組織損傷和修復的程度方面也起著重要作用。IL-1β受體拮抗劑anakina抑制IL-1β活性可顯著降低小鼠急性心肌梗死后的心肌肥厚和心肌功能障礙[17]。

NLRP3炎性小體識別各種危險信號并誘導無菌炎性反應,在缺血性心肌病發(fā)病中可大量激活。有報道,siRNA或藥理學抑制劑抑制NLRP3和P2X7受體可防止炎性體激活并減少心肌細胞死亡,減輕小鼠冠狀動脈結扎后的心臟重塑。NLRP3炎性小體抑制劑MCC950在經(jīng)腔球囊閉塞誘導的心肌梗死豬模型中減少了梗死面積,表明抑制NLRP3炎性小體激活可能對急性心肌梗死患者具有治療潛力[18]。

在心肌缺血/再灌注損傷的大鼠模型中,NLRP3的表達上調(diào),caspase-1活性增強,IL-1β和IL-18增加,抑制NLRP3激活可減少梗死面積。心肌內(nèi)注射NLRP3 siRNA或腹腔內(nèi)注射炎性體抑制劑BAY-11-7028可減輕小鼠心臟中巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤,并減少心肌缺血/再灌注損傷[19]。

5 NLRP3炎性小體與心臟重構的關系

心臟重塑導致心臟結構和功能一系列變化,心室重構的主要原因,例如壓力超負荷(主動脈瓣狹窄和高血壓)、容量超負荷(瓣膜返流和缺血)和其他疾病(如心肌梗死、心肌炎、擴張型心肌病和瓣膜性心臟病)的適應性反應,這些疾病逐漸導致心臟進行性失代償。半胱天冬酶激活和募集結構域3(CARD3)是心肌梗死后左心室重構和功能障礙的積極調(diào)節(jié)劑,并且CARD3在調(diào)節(jié)一些細胞系中的半胱天冬酶-1活性中起著關鍵作用[20]。

盡管可以成功開通冠脈和適當?shù)乃幬镏委熞约案淖兩罘绞?但是心臟重構仍然很常見,并最終導致心力衰竭和死亡。心肌壞死會觸發(fā)炎性因子的產(chǎn)生,如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18、IL-33和C-反應蛋白,抑制這些炎性因子的產(chǎn)生可調(diào)節(jié)心肌重塑。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)調(diào)節(jié)生物活性NO的產(chǎn)生,NO是NLRP3炎性小體激活的關鍵負調(diào)節(jié)因子之一。在心衰患者中,iNOS在巨噬細胞和心肌細胞中都有高表達。在iNOS敲除的慢性心衰(chronic heart failure,CHF)小鼠,其存活率、左心室功能、肥大、纖維化和炎性反應激活方面表現(xiàn)出顯著改善,表明iNOS負責缺血性心衰的全身炎性反應和心臟重塑。線粒體參與多種細胞生命活動,如能量、信號、細胞增殖、分化和凋亡,線粒體損傷釋放的線粒體DNA可激活NLRP3炎性小體。在高脂飲食和低劑量鏈脲佐菌素誘導的T2D大鼠中,NLRP3基因沉默療法可改善心臟炎性反應、纖維化和心功能不全。在一些實驗動物模型中,NLRP3炎性小體信號干預也被證明可以減少心肌梗死面積并抑制心臟重構和改善心功能[21]。

6 NLRP3炎性小體與心律失常的關系

有報道,在野生型和NLRP3純合子敲除(NLRP3-/-)的小鼠喂養(yǎng)高脂飲食或正常飲食。與正常飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠相比,高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠更容易發(fā)生心律失常,且炎性反應越劇烈心律失常持續(xù)時間越長。相反,高脂飲食喂養(yǎng)的NLRP3-/-小鼠發(fā)生心律失常的情況較少。NLRP3 炎性小體激活可引起超快速延遲整流K+通道的上調(diào),縮短導致心肌電位不應期和動作電位持續(xù)時間,這是促進心臟電重構的兩個關鍵因素。在高脂飼料誘導的野生型小鼠中,促纖維化信號和纖維化增加以及肌漿網(wǎng)異常Ca2+釋放與心律失常發(fā)生密切相關。相反,高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中NLRP3-/-的敲除阻止了K+通道的上調(diào)和電重構的演變、促纖維化基因的上調(diào)以及高脂飼料誘導的野生型小鼠中異常的肌漿網(wǎng) Ca2+釋放,這些結果提示NLRP3炎性小體激活可能是心律失常發(fā)生發(fā)展的關鍵驅動因素[22]。

心肌梗死后常伴有室性心律失常,表明炎性反應與此密切相關。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制物1(CaMK2N1)主要在心肌細胞中表達,并抑制梗死邊緣區(qū)CaMKⅡδ的磷酸化。與野生型同窩小鼠相比,Camk2n1敲除小鼠表現(xiàn)為心肌梗死后心功能不全加重、纖維化面積增大、室性早搏發(fā)生率增高、室性心動過速或室顫易感性增高。NLRP3炎性小體的過度激活導致心肌梗死,Camk2n1小鼠的炎性反應加劇,從而導致心臟重構。更重要的是,體內(nèi)和體外實驗均證實,在,Camk2n1小鼠中NLRP3炎性小體激活通過CaMKⅡδ-p38/JNK途徑加劇心律失常的發(fā)生發(fā)展[23]。以上結果均提示NLRP3 炎性小體激活及其下游炎性因子釋放增加與心臟電活動改變密切相關,抑制炎性反應有可能成為心律失常治療的潛在靶點。

7 問題與展望

NLRP3炎性小體激活對于心臟疾病發(fā)病至關重要,抑制NLRP3炎性小體及下游炎性因子IL-1β和IL-18的激活可以阻止心臟疾病的發(fā)生發(fā)展。NLRP3炎性小體可被多種信號系統(tǒng)激活,其分子機制迄今仍不明確。目前認為抑制NLRP3炎性小體激活最有希望的治療方法是抗IL-1、抑制caspase-1和P2X7受體拮抗劑。針對NLRP3炎性小體的組裝和激活進行靶向治療可能是心臟疾病未來的一個有效新療法。