賈丹丹 許亞平 郭志坤，△

（1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南醫(yī)用組織再生重點實驗室，新鄉(xiāng) 453003；2 鄭州第七人民醫(yī)院，鄭州 450000）

超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated cation channel 4，HCN4）主要表達(dá)于哺乳動物竇房結(jié)組織的起搏細(xì)胞[1-4]，因此HCN4 基因又被稱為心的起搏基因。Seifert 等[5-6]報道HCN4 高表達(dá)于胚胎心和人類的丘腦，竇房結(jié)細(xì)胞舒張期自動去極化與HCN4 有密切的關(guān)系，它已被確定為心率的調(diào)節(jié)器。HCN4 離子通道的突變或缺失可能導(dǎo)致心律失常、竇房結(jié)功能障礙[7]和心肌致密化不全。HCN4 對心傳導(dǎo)系統(tǒng)的功能發(fā)育非常重要，小鼠胚胎期的HCN4 功能缺失，導(dǎo)致小鼠后續(xù)的生長發(fā)育終止[8]。HCN4 作為竇房結(jié)細(xì)胞產(chǎn)生超級化激活內(nèi)向離子電流（If）的主要離子通道，在心4 期自動去極化中發(fā)揮很重要的作用[8-11]。HCN4 除在心傳導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)外，在組織水平的動脈、靜脈、心外膜、心內(nèi)膜、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少數(shù)心肌細(xì)胞均有表達(dá)[12]，但是在體外細(xì)胞水平是否與組織水平的表達(dá)一致，以及不同代次的細(xì)胞和不同年齡的心HCN4 表達(dá)規(guī)律及其一致性，目前研究甚少。本研究試圖從細(xì)胞水平和組織水平進(jìn)一步探討成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞HCN4 的表達(dá)變化規(guī)律，為進(jìn)一步深入探討HCN4 對心率調(diào)控和心發(fā)育的增齡變化奠定形態(tài)基礎(chǔ)和理論參考。

1 材料和方法

1.1 動物

SD 大鼠39 只，其中新生1～3 d 大鼠15 只用于原代細(xì)胞培養(yǎng)；新生組（1～3 d）、成年（17 個月）和老年（22 個月）SD 大鼠各8 只，每組中4 只用于冰凍切片，剩余4 只用于實時熒光定量PCR（qRTPCR）。雌雄不限，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（豫） 2010-0002。對動物的實驗處理方法遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 原代成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)

15 只新生1～3 d SD 大鼠在無菌條件下取出心，將其放入預(yù)冷的PBS 中，沖洗6 次以除去血細(xì)胞，剪去大血管、結(jié)締組織，用眼科剪將心剪成1 mm×1 mm×1 mm 小塊，加入0.1%Ⅱ型膠原酶和等體積的0.2% 胰蛋白酶，37℃消化8 min；用無菌一次性吸管吹打，使其混勻、靜置，吸取管中的上清液，加入相同體積的低糖完全培養(yǎng)基終止消化；重復(fù)上述消化，收集上清液，終止消化等步驟10～13 次，直到組織塊完全消化為止；過濾全部上清液，轉(zhuǎn)速1 200 r/min，離心5 min，棄上清液，用無菌吸管吸取4 mL 完全培養(yǎng)基，緩慢吹打，充分混勻，并接種至培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放置在CO2含量為5%的37℃培養(yǎng)箱45 min；取出培養(yǎng)瓶，吸去上清液，原培養(yǎng)瓶加入4 mL 完全培養(yǎng)基，將上清液加入新的培養(yǎng)瓶中，將其放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 min。重復(fù)上述操作，采取差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，取上清液接種到新的培養(yǎng)瓶獲得心肌細(xì)胞，原培養(yǎng)瓶加4 mL 完全培養(yǎng)基獲得成纖維細(xì)胞，24 h 后首次換液，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化2～3 d 更換1 次培養(yǎng)基。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)顯色

取4%多聚甲醛固定過的成纖維細(xì)胞爬片和心肌細(xì)胞爬片，PBS 沖洗，用0.3%的Triton X-100作用10 min，PBS 沖洗，用3% H2O2室溫15 min，PBS 沖洗，用10% 山羊血清室溫封閉20 min，分別滴加一抗：成纖維細(xì)胞爬片分別滴加小鼠抗大鼠多克隆抗體DDR2（1∶25，Santa Cruz 公司）、兔抗大鼠多克隆抗體HCN4（1∶600，Bioss 公司）。心肌細(xì)胞爬片分別滴加小鼠抗大鼠多克隆抗體cTnT（1∶200，Affinity 公司） 、兔抗大鼠多克隆抗體HCN4（1∶600，Bioss 公司）。4℃孵育過夜?？瞻讓φ沼肞BS 代替一抗，其余操作同實驗組。第2 天取出爬片，PBS 沖洗，滴加相應(yīng)的二抗工作液，室溫孵育30 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，顯色時間不超過30 s，沖去多余染液，蘇木精染色2 min，除去多余染液，用0.7%鹽酸乙醇分化12 s，沖去多余染液，脫水，透明，封片。用顯微鏡觀察，拍照，留存圖像。

1.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色

取4%多聚甲醛固定過的成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞的孔板，PBS 沖洗，用0.3%的Triton X-100 作用10 min，PBS 沖洗，山羊血清室溫封閉40 min，分別滴加一抗：成纖維細(xì)胞滴加小鼠抗大鼠多克隆抗體DDR2（1∶25，Santa Cruz 公司）和兔抗大鼠多克隆抗體HCN4（1∶200，Bioss 公司）。心肌細(xì)胞滴加小鼠抗大鼠多克隆抗體cTnT（1∶500，Abcam 公司）和兔抗大鼠多克隆抗體HCN4（1∶200，Bioss 公司）。4℃過夜，第2 天PBS 沖洗，分別滴加相應(yīng)二抗，室溫避光孵育2 h，PBS 沖洗，DAPI 室溫孵育3 min，PBS 沖洗，用抗熒光淬滅封片劑封片，對照組一抗用PBS 代替，其余步驟相同。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 心肌免疫組織化學(xué)染色

取新生、成年和老年SD 大鼠心，用恒冷箱冷凍切片機(jī)切片，片厚8 μm。室溫復(fù)溫15 min，丙酮固定10 min，PBS 沖洗，用3% H2O2室溫10 min，PBS 沖洗，用10% 山羊血清室溫封閉40 min，滴加兔抗大鼠多克隆抗體HCN4（1∶600，Bioss 公司）。第2 天取出切片，PBS 沖洗，滴加相應(yīng)的二抗工作液，室溫孵育30 min，PBS 沖洗，滴加DAB 顯色30 s，自來水沖洗10 min，蘇木精染色2 min，除去多余染液，用0.7%鹽酸乙醇分化2 s，用自來水沖洗1 min，經(jīng)脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察拍照。

1.6 心肌組織免疫熒光染色

取新生、成年和老年SD大鼠心冷凍切片，PBS沖洗，用0.3%的Triton X-100作用15 min，PBS沖洗，山羊血清室溫封閉40 min，分別滴加一抗，組織切片滴加小鼠抗大鼠多克隆抗體DDR2（1∶25，Santa Cruz 公司）和兔抗大鼠多克隆抗體HCN4（1∶200，Bioss 公司），或滴加小鼠抗大鼠多克隆抗體cTnT（1∶500，Abcam 公司）和兔抗大鼠多克隆抗體HCN4（1∶200，Bioss 公司）。第2 天PBS 沖洗，分別滴加相應(yīng)二抗，室溫避光孵育2 h，PBS 沖洗，DAPI 室溫孵育3 min，PBS 沖洗，用抗熒光淬滅封片劑封片，對照組一抗用PBS 代替，其余步驟相同。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 免疫印跡檢測HCN4 蛋白表達(dá)

用 RIPA 裂解液分別提取新生、成年和老年大鼠左心室蛋白，提取P1～P4 代成纖維細(xì)胞蛋白。放冰上30 min 以保證充分裂解，待離心機(jī)溫度降至4℃，14 000 r/min 離心5 min，離心后吸出上清液至新的離心管中，量取上清液體積，并加入上清液體積4/5 的5×上樣緩沖液，95℃變性5 min 保存。蛋白樣品于10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，一抗（兔抗大鼠HCN4 多克隆抗體，1∶500，Affinity 公司；兔抗小鼠β-tubulin 單克隆抗體，1∶10 000，Affinify公司） 孵育過夜。TBST 洗滌，二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗滌，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.8 qRT-PCR 檢測HCN4 mRNA 表達(dá)

常規(guī)抽提新生、成年和老年大鼠左心室總RNA、P1～P4 代成纖維細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行qRT-PCR。β-tubulin 作為內(nèi)參，配制PCR 反應(yīng)液，其中目的基因為HCN4。反應(yīng)條件設(shè)置為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，63℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40 個循環(huán)。目的基因和β-tubulin 產(chǎn)物倍數(shù)按2-ΔΔCT計算。上海生工參與引物設(shè)計與合成。引物序列見表1

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0、Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，多個樣本均值比較采用單因素方差分析，組別之間兩兩比較用LSD 方法進(jìn)行比較分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCN4 在成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)顯色結(jié)果顯示，在P1～P4 代的成纖維細(xì)胞（圖1A、圖1B，見封二）中HCN4 呈陽性表達(dá)，表達(dá)率達(dá)100%；在原代心肌細(xì)胞（圖1C，見封二）中也存在HCN4 表達(dá)，但由于原代心肌細(xì)胞中混雜有成纖維細(xì)胞，原代心肌細(xì)胞表達(dá)數(shù)量不易統(tǒng)計。為了排除細(xì)胞混雜，分別采用了成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物DDR2 和cTnT 與HCN4 進(jìn)行了免疫雙標(biāo)，免疫熒光的結(jié)果顯示，DDR2 和HCN4 在P1～P4 代成纖維細(xì)胞（圖1D～圖1G，見封二）中同樣呈共表達(dá)，共表達(dá)率幾乎100%；cTnT 和HCN4 在原代心肌細(xì)胞（圖1H，見封二）中也呈現(xiàn)共表達(dá)，共表達(dá)率達(dá)100%，不表達(dá)的細(xì)胞為心肌以外的細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致。

2.2 HCN4 在新生、成年和老年大鼠心肌組織的表達(dá)

免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示，新生、成年和老年（圖2A，見封三）大鼠心肌組織中均可見HCN4陽性表達(dá)的細(xì)胞，其中包括成纖維細(xì)胞、血管平滑肌，心肌細(xì)胞中均有表達(dá)。隨著大鼠月齡的增加，心肌組織HCN4 的表達(dá)水平呈明顯下降趨勢。免疫熒光組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示，新生、成年和老年大鼠心組織中的成纖維細(xì)胞均表達(dá)HCN4（圖2B～圖2D，見封三），新生大鼠心組織中的成纖維細(xì)胞HCN4的表達(dá)量高于成年和老年大鼠；在新生、成年和老年大鼠心組織中的心肌細(xì)胞均可見HCN4的表達(dá)（圖2E～圖2G，見封三），新生大鼠心組織中的心肌細(xì)胞HCN4的表達(dá)量高于成年和老年大鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)。

2.3 心肌成纖維細(xì)胞HCN4 蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，HCN4 蛋白在P1～P4 代成纖維細(xì)胞表達(dá)規(guī)律為P1 代成纖維細(xì)胞表達(dá)最高，P2 代后成纖維細(xì)胞表達(dá)量明顯下降，P1～P4 代成纖維細(xì)胞中HCN4 表達(dá)量隨代次增加表達(dá)水平逐漸下降。與P1 代比較，P2、P3 代和P4 代成纖維細(xì)胞比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）（圖3）。

圖3 P1-P4 代成纖維細(xì)胞HCN4 蛋白表達(dá)變化

2.4 P1～P4 代成纖維細(xì)胞和新生、成年和老年大鼠左心室心肌組織HCN4 mRNA 定量分析

P1～P4 代成纖維細(xì)胞mRNA 的定量結(jié)果顯示，P1 代成纖維細(xì)胞中HCN4 的mRNA 表達(dá)高于P2 代、P3 代和P4 代的mRNA 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。P1～P4 代成纖維細(xì)胞的HCN4 的mRNA的總體變化趨勢是隨著代次增加，表達(dá)水平逐漸減低。新生、成年和老年大鼠左心室心肌組織mRNA定量結(jié)果顯示，新生大鼠心肌HCN4 的mRNA 表達(dá)高于成年、老年大鼠HCN4 的mRNA 表達(dá)（P＜0.01，P＜0.001），新生、成年和老年大鼠左心室心肌組織HCN4 的mRNA 的總體變化趨勢為隨著大鼠月齡的增加，其表達(dá)量逐漸下降（圖4）。

圖4 不同代次成纖維細(xì)胞（A）和不同月齡大鼠左心室心肌組織（B）HCN4 的mRNA 表達(dá)比較

3 討論

超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（HCN）基因家族包括HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 這4個成員，在心組織中有HCN1、HCN2 及HCN4 3種亞型[13]，其中與心起搏有密切關(guān)系的HCN4 被稱為起搏基因[14-16]。HCN4 是具有6 個跨膜片段的蛋白，已證實表達(dá)在心房肌組織、竇房結(jié)細(xì)胞[17]，在幼年、成年、老年大鼠竇房結(jié)部位隨著年齡的增加表達(dá)量逐漸降低[18-20]。目前的研究表明HCN4 除在傳導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)外，在心的其他細(xì)胞也有表達(dá)，但HCN4 在幼年、成年、老年大鼠心傳導(dǎo)組織以外的成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞的表達(dá)變化尚未見報道。本研究從細(xì)胞和組織水平證明隨大鼠月齡和成纖維細(xì)胞代次的增加，HCN4 表達(dá)量逐漸減少，這一結(jié)果提示體外和體內(nèi)表達(dá)規(guī)律基本一致。但新生大鼠原代成纖維細(xì)胞、原代心肌細(xì)胞HCN4 的表達(dá)率較高，幾乎達(dá)100%。與心肌組織表達(dá)比較，體外的原代心肌細(xì)胞幾乎全部表達(dá)HCN4，但在組織水平只能見到部分心肌細(xì)胞表達(dá)，說明心肌細(xì)胞的表達(dá)存在體內(nèi)和體外的表達(dá)差異。為了保證心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的純度，本研究對培養(yǎng)的細(xì)胞分別進(jìn)行了DDR2 和cTnT 特異性標(biāo)記，并與HCN4 陽性表達(dá)進(jìn)行了疊加標(biāo)識，以證明本研究所顯示結(jié)果的可靠性。

在組織水平除成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞表達(dá)HCN4之外，血管平滑肌細(xì)胞也表達(dá)HCN4，而且隨年齡的增加其表達(dá)逐漸減少，這與筆者先前的研究結(jié)果[12]及程功等[18]研究的HCN4在幼年、成年、老年大鼠竇房結(jié)組織的增齡變化規(guī)律一致。本研究結(jié)果提示HCN4在心傳導(dǎo)系統(tǒng)以外的其他細(xì)胞廣泛存在，不只是胚胎時期或竇房結(jié)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。

本研究免疫印跡結(jié)果顯示，P1～P4 代成纖維細(xì)胞HCN4 蛋白的表達(dá)量隨著培養(yǎng)代次的增加而降低，qRT-PCR 結(jié)果與免疫印跡結(jié)果基本一致，顯示HCN4 的mRNA 的總體變化趨勢隨著代次增加，表達(dá)有降低趨勢，說明HCN4 的轉(zhuǎn)錄和翻譯具有一致性。另外，本研究體內(nèi)和體外均發(fā)現(xiàn)所有HCN4 陽性細(xì)胞均隨增齡的增長，其表達(dá)數(shù)量逐漸下降，其發(fā)生機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

圖版說明（圖見封二、封三）

圖1 HCN4 在體外培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的表達(dá)，標(biāo)尺=100 μm。A1、A2、A3、A4：依次為P1、P2、P3、P4 代的心肌成纖維細(xì)胞DDR2 的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。B1、B2、B3、B4：依次為P1、P2、P3、P4 代的心肌成纖維細(xì)胞HCN4 的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。C1、C2：依次為原代心肌細(xì)胞cTnT、HCN4 的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。D1～D3、E1～E3、F1～F3、G1～G3：依次為P1 代、P2 代、P3 代、P4 代心肌成纖維細(xì)胞的DDR2、HCN4 免疫細(xì)胞熒光染色，DAPI 復(fù)染；D4、E4、F4、G4：依次為D1～D3、E1～E3、F1～F3、G1～G3 圖的融合圖；H1～H4：依次為新生大鼠原代心肌細(xì)胞cTnT、HCN4、DAPI 及融合圖.

圖2 HCN4 在新生、成年和老年大鼠心肌組織的表達(dá)，標(biāo)尺=100 μm。A1、A2、A3：依次為新生、成年和老年大鼠心肌組織HCN4 的免疫組織化學(xué)染色。B1～B3、C1～C3、D1～D3：依次為新生、成年、老年大鼠心肌成纖維細(xì)胞DDR2、HCN4免疫細(xì)胞熒光染色，DAPI 復(fù)染。B4、C4、D4：依次為B1～B3、C1～C3、D1～D3 圖的融合圖。E1～E3、F1～F3、G1～G3：依次為新生、成年、老年大鼠心肌細(xì)胞cTnT、HCN4 免疫細(xì)胞熒光染色，DAPI 復(fù)染；E4、F4、G4：依次為E1～E3、F1～F3、G1～G3 圖的融合圖.