布魯菌病疫苗的研究進(jìn)展※

梁 晨,魏 偉,梁秀文,德恩金

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008;

2.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市疾病預(yù)防控制中心,內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008)

布魯菌病是由布魯菌感染引起的人獸共患傳染病。布魯菌為革蘭陰性胞內(nèi)寄生菌,以羊種布魯菌、牛種布魯菌和豬種布魯菌較為常見[1]。人感染布魯菌的臨床表現(xiàn)多樣,可見發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)肌肉疼痛等癥狀,治療不當(dāng)或治療不及時(shí)可轉(zhuǎn)為慢性,導(dǎo)致疾病遷延不愈。家畜感染布魯菌可出現(xiàn)流產(chǎn)、不孕、繁殖成活率低等,使家畜數(shù)量明顯減少,嚴(yán)重制約畜牧業(yè)發(fā)展[2]。疫苗接種是防治布魯菌病的主要手段,早期以滅活疫苗為主,后期主要選用免疫效力更好的減毒活疫苗,其中用于家畜的疫苗包括S19、Rev.1、S2、M5和RB51等,用于人類的疫苗包括104M 和19-BA 等,然而有些疫苗存在一定缺陷,限制其廣泛應(yīng)用[3]。隨著對布魯菌致病機(jī)制研究的深入,以及相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,新型疫苗、基因工程疫苗取得了一定進(jìn)展,現(xiàn)簡述如下。

1 傳統(tǒng)布魯菌疫苗

目前,臨床常用的動物布魯菌疫苗有S19、Rev.1、S2、M5和RB51,均為減毒活疫苗,為控制布魯菌病疫情、減少畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失發(fā)揮著重要作用[4]。布魯菌減毒活疫苗通過篩選毒力較低的布魯菌分離株或分離強(qiáng)毒株傳代獲得,與滅活疫苗相比,布魯菌減毒活疫苗可激發(fā)動物機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答,具有免疫保護(hù)作用更持久、接種途徑多樣、成本低廉等優(yōu)勢[5]。

1.1 牛種布魯菌S19疫苗 S19疫苗是一種廣泛應(yīng)用于奶牛布魯菌病防控的疫苗,是牛種布魯菌19的全菌制劑,被印度、阿根廷和巴西等許多國家參考使用,于1958年被引入中國[6]。S19疫苗最初是20世紀(jì)初從一頭娟姍牛的乳汁中分離出的一種毒性菌株,在室溫下自然衰減1年獲得的光滑型突變體[7]。目前臨床使用的S19疫苗是美國科學(xué)家挑選出來的一種赤蘚糖醇(Ery)敏感的S19菌株。Ery基因包含4個(gè)開放閱讀框:EryA、EryB、EryC和EryD。S19存在702bp的核苷酸序列缺失,從而影響到EryC(bab2_0370)和EryD(bab2_0369)的編碼區(qū)域,從而使S19對Ery敏感[8]。S19是光滑的布魯菌菌株表型,其脂多糖含有O-多糖,可以持續(xù)刺激動物產(chǎn)生抗脂多糖抗體,干擾已產(chǎn)生免疫動物和自然感染動物之間的常規(guī)血清學(xué)檢測,此外可導(dǎo)致懷孕奶牛流產(chǎn),引起公牛持續(xù)的睪丸炎[9]。S19的免疫效果取決于接種動物的年齡、接種途徑和劑量、感染途徑等因素。改進(jìn)和保持S19疫苗良好的免疫原性和遺傳穩(wěn)定性,有可能通過添加標(biāo)記基因提高鑒別診斷的效率和簡便性。目前,可以使用多個(gè)候選對象作為標(biāo)記基因,如BP26和p39基因[10]。此外,S19對人類具有一定程度的致病力。近年來,世界各地均有報(bào)告指出,在S19疫苗生產(chǎn)或接種過程中造成人員感染布魯菌[8]。未來可利用缺失的702bp片段區(qū)分S19和其他野毒株,并應(yīng)用重組DNA 技術(shù)開發(fā)出更好的、安全性更高的S19疫苗[11]。我國目前使用A19疫苗替代S19,A19毒力介于S2和M5疫苗之間,對牛的免疫效果較好。

1.2 羊種布魯菌Rev.1疫苗 Rev.1疫苗是一種鏈霉素耐藥的光滑型羊種布魯菌菌株。20世紀(jì)60年代在希臘、約旦、塔吉克斯坦、蒙古和西班牙等國用于預(yù)防動物布魯菌病。實(shí)驗(yàn)證實(shí)羊接種Rev.1 疫苗后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答效果與S19接近,但保護(hù)力較強(qiáng)[12],能有效降低母羊流產(chǎn)的概率。該疫苗通過黏膜產(chǎn)生免疫,主要在頭顱淋巴結(jié)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制,對常規(guī)血清學(xué)診斷影響較小。由于Rev.1帶有鏈霉素耐藥性,所以使用鏈霉素和四環(huán)素治療布魯菌病的效果不佳,應(yīng)引起注意。Rev.1疫苗的缺點(diǎn)是在某些特定條件下可完全恢復(fù)Rev.1菌株毒性而導(dǎo)致懷孕牲畜流產(chǎn),且Rev.1菌株在動物體內(nèi)具有較長的存活期,可通過分泌物和乳汁傳播。Rev.1疫苗的上述缺點(diǎn)可以通過減少劑量來克服,但在羊布魯菌已被根除的國家禁止使用[7]。

1.3 羊種布魯菌M5疫苗 M5疫苗是1962年由哈爾濱獸醫(yī)研究所研制,通過弱化強(qiáng)毒株M28得到的弱毒株。應(yīng)用M5疫苗不使用佐劑,其免疫途徑為氣霧免疫,劑量為5×109cfu。1970年我國首次大規(guī)模使用M5疫苗對綿羊和山羊進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn),效果顯著,接種動物產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力。與M28疫苗和M16相比,M5疫苗的毒力明顯降低[2,13]。M5疫苗的研發(fā)對我國動物布魯菌病的防控發(fā)揮了積極作用。然而M5疫苗毒力強(qiáng)并且可以引起高血清反應(yīng),為國產(chǎn)疫苗中毒力最強(qiáng)的菌株,且較不穩(wěn)定,基因組突變通常發(fā)生在培養(yǎng)階段,另外無法區(qū)分感染或接種后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。鑒于其存在以上缺點(diǎn),國內(nèi)布魯菌病疫區(qū)很少使用M5疫苗,2017年我國原農(nóng)業(yè)部已下發(fā)文件停止使用M5疫苗。

1.4 豬種布魯菌S2疫苗 S2疫苗是1952年中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所在豬流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離得到的豬種布魯菌毒株,經(jīng)培養(yǎng)基連續(xù)傳代后的光滑型弱毒株。應(yīng)用S2疫苗不使用佐劑,通過口服方式,可有效預(yù)防豬布魯菌感染。對于牛、綿羊、山羊等易感家畜,口服S2疫苗也能提供滿意的防護(hù)效果。與S19和Rev.1相比,S2疫苗具有較低的殘留毒性、疫苗生產(chǎn)成本低且可以口服免疫等優(yōu)點(diǎn)。然而研究顯示,在大型動物中,S2的免疫保護(hù)力低于S19和Rev.1,刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體持續(xù)時(shí)間較短。

1.5 牛種布魯菌RB51疫苗 RB51疫苗是牛種布魯菌2308 的一個(gè)自發(fā)突變株,該疫苗未使用佐劑。RB51 為粗糙型疫苗株,菌株中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的whoA 基因被IS711插入序列破壞,從而表現(xiàn)為粗糙型,用RB51免疫的動物易與自然感染區(qū)分[14]。RB51菌株比較穩(wěn)定,與S19相比毒力弱,美國、墨西哥等國家用RB51疫苗替代S19疫苗用于奶牛布魯菌病的免疫。RB51具有利福平抗性,易通過選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離鑒定,但不利于布魯菌病的常規(guī)治療。RB51可感染人類,多因針刺損傷意外暴露引起[15]。

2 基因工程疫苗

隨著同源重組技術(shù)的發(fā)展,一些基因工程減毒菌株逐漸進(jìn)入大眾視野。通過干擾參與脂多糖(LPS)生物合成途徑的必需基因如per、pgm、wboA、wbkA 等得到粗糙型突變體,其優(yōu)點(diǎn)在于不干擾常規(guī)血常規(guī)診斷而且毒力明顯降低。其他突變體如purl、purd、pure、baca、hemh、virb或pgk基因的破壞后得到了較好免疫保護(hù)力[2,7,16]。盡管前期試驗(yàn)結(jié)果較好,但是這些突變體在動物身上大規(guī)模的試驗(yàn)還有待進(jìn)行。

2.1 亞單位疫苗 亞單位疫苗的合成原料為重組布魯菌屬蛋白,疫苗的佐劑為完全氟化物佐劑或不完全氟化物[7,17]。有學(xué)者通過研究小鼠模型發(fā)現(xiàn),許多布魯菌膜和細(xì)胞溶質(zhì)蛋白可起到保護(hù)性抗原的作用,包括L7/L12核糖體蛋白、外膜蛋白(Omp)2b、Omp31、Omp16、Omp19、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、22.9-kda蛋白、二氧四氫蝶啶合成酶及核苷二磷酸。然而與S19疫苗相比,部分重組蛋白在體內(nèi)的免疫效果較差[18]。盡管Omp16和Omp19自身具有佐劑特性,但大多數(shù)重組蛋白需要協(xié)同使用佐劑以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。使用佐劑往往會引起不良反應(yīng),如注射部位的局部炎癥、肉芽腫的形成或無菌性膿腫。因此,今后應(yīng)更加廣泛地致力于開發(fā)新的重組蛋白疫苗,由多個(gè)布魯菌抗原組成,而且具有自身佐劑特性。

2.2 DNA 疫苗 DNA 疫苗即用表達(dá)特定抗原基因的質(zhì)粒進(jìn)行疫苗接種,已成為開發(fā)布魯菌病疫苗的新方向。這些疫苗含有編碼布魯菌屬基因的重組質(zhì)粒,無須佐劑。DNA 疫苗可編碼以下基因:L7/L12,BLS、BCSP31、Cu/Zn-SOD、Omp16、P39 和Bab1-0278[9,19]。有兩種方法可以提高DNA 疫苗或使免疫反應(yīng)最大化。一種方法是DNA 疫苗中表達(dá)多種抗原,另一種方法是將細(xì)胞因子作為佐劑在DNA 疫苗中共同表達(dá),以提高免疫應(yīng)答。盡管已有研究通過動物實(shí)驗(yàn)證明大多數(shù)DNA 疫苗有很好的免疫效果,但在自然宿主中還需進(jìn)一步的研究[20]。

3 新型疫苗

3.1 布魯菌菌殼疫苗 布魯菌殼疫苗通過表達(dá)裂解基因E導(dǎo)致細(xì)胞壁形成跨膜通道,從而引起菌體內(nèi)容物外流而形成菌殼[21]。疫苗的合成為布魯菌屬的全有機(jī)體,不含細(xì)胞質(zhì)成分,也無需添加佐劑。研究發(fā)現(xiàn)與滅活細(xì)菌相比,豬布魯菌S2菌殼疫苗能顯著提高免疫球蛋白G 和T 細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生[22]。這種疫苗的缺陷比較明顯,如抗生素抗性基因在野生布魯菌中的水平轉(zhuǎn)移困難等。

3.2 納米顆粒疫苗 納米顆粒疫苗是布魯菌屬抗原,通過疫苗抗原在納米載體內(nèi)或裝飾在其表面壓縮制成,常將脂多糖作為疫苗佐劑。與未結(jié)合抗原相比,納米載體提供了一種合適的抗原給藥途徑,增強(qiáng)了細(xì)胞攝取,從而提高機(jī)體免疫效果[5,23]。此外,納米載體可以作為佐劑在淋巴器官中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。納米顆粒疫苗的抗原主要來源于布魯菌Omp(19、25、31)、RL7/L12核糖體蛋白、LPS或細(xì)胞溶質(zhì)蛋白,可用于布魯菌病疫苗接種[24]。

3.3 通過逆向疫苗學(xué)方法確定候選疫苗 人用布魯菌疫苗研制困難的主要原因可能在于布魯菌存在多個(gè)種型,且保護(hù)性抗原譜復(fù)雜,單一抗原很難起到完全保護(hù)作用。隨著組學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展,逆向疫苗學(xué)逐漸成為研制新型疫苗的重要方法。逆向疫苗學(xué)(RV)以組學(xué)和生物信息學(xué)為基礎(chǔ)進(jìn)行抗原預(yù)測,并隨后對預(yù)測的候選抗原進(jìn)行驗(yàn)證評價(jià),進(jìn)而獲得有效的保護(hù)性抗原用于新型疫苗研制。RV 方法是基于基因組數(shù)據(jù)研究而成,一般分3個(gè)步驟:①通過計(jì)算工具和在線數(shù)據(jù)庫選擇基因組分析以確定可能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的免疫原表位;②合成或生產(chǎn)相關(guān)基因克隆、抗原肽或蛋白質(zhì);③在實(shí)驗(yàn)動物模型中檢測重組抗原的免疫原性和保護(hù)作用[25]。雖然研究人員在不同的實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的布魯菌基因表達(dá)譜,但是如何使用這些基因設(shè)計(jì)疫苗仍然是目前面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。

4 小結(jié)

疫苗是布魯菌病預(yù)防和控制的關(guān)鍵策略,目前仍有部分國家人畜間布魯菌病流行嚴(yán)重,未來期待更多國家的科研學(xué)者投入到布魯菌病疫苗的研制中,從而減少布魯菌病對人類、牲畜的危害。