張崇海 秦倩

【摘 要】目的 探索PKP1在皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）中相關(guān)生物學(xué)功能。方法 通過實(shí)時(shí)TIME 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析PKP1在不同的腫瘤以及正常組織中的相對(duì)表達(dá)量；通過GEPIA以及UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析PKP1在皮膚黑色素瘤組織以及正常組織的表達(dá)量以及探究PKP1的表達(dá)水平和腫瘤病人預(yù)后的關(guān)系；在SK-MEL-1細(xì)胞系中，過表達(dá)PKP1探究對(duì)于腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)果 TIME 2.0分析顯示，多種腫瘤組織中PKP1表達(dá)水平低于正常組織（P<0.05）；而膽管癌、肝癌以及腎透明細(xì)胞癌等腫瘤中PKP1表達(dá)水平高于正常組織（P<0.05）；GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，正常組織中PKP1表達(dá)水平高于皮膚黑色素瘤組織（P<0.05）；PKP1過表達(dá)組PKP1的蛋白水平高于NC組（P<0.05）；PKP1高表達(dá)組OS指標(biāo)優(yōu)于低表達(dá)組（P<0.05）；CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，PKP1過表達(dá)組與空質(zhì)粒組細(xì)胞OD值比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）。結(jié)論 PKP1在皮膚黑色素瘤中低表達(dá)，其表達(dá)水平下調(diào)和預(yù)后不良有關(guān)，PKP1可以抑制皮膚黑色素瘤細(xì)胞的增殖，PKP1有成為靶向治療的關(guān)鍵基因的潛力。

【關(guān)鍵詞】皮膚黑色素瘤；PKP1；生存時(shí)間；細(xì)胞增殖；靶向治療

中圖分類號(hào)：R739.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-4949（2023）13-0044-04

The Biological Role of Plakophilin-1 （PKP1） in Cutaneous Melanoma Based on Bioinformatics Methods Combined with Cell Experiments

ZHANG Chong-hai， QIN Qian

（Department of Dermatology， Xuecheng District Peoples Hospital， Zaozhuang 277099， Shandong， China）

【Abstract】Objective To explore the biological function of PKP1 in skin cutaneous melanoma （SKCM）. Methods The relative expression of PKP1 in different tumors and normal tissues was analyzed by real-time TIME 2.0 database. The expression of PKP1 in cutaneous melanoma tissues and normal tissues was analyzed by GEPIA and UALCAN databases， and the relationship between the expression level of PKP1 and the prognosis of tumor patients was explored. In SK-MEL-1 cell line， the effect of overexpression of PKP1 on tumor cells was explored. Results TIME 2.0 analysis showed that the expression level of PKP1 in various tumor tissues was lower than that in normal tissues （P<0.05）， while the expression level of PKP1 in cholangiocarcinoma， liver cancer and renal clear cell carcinoma was higher than that in normal tissues （P<0.05）. The GEPIA database showed that the expression level of PKP1 in normal tissues was higher than that in skin melanoma tissues （P<0.05）. The protein level of PKP1 in PKP1 overexpression group was higher than that in NC group （P<0.05）. The OS index of PKP1 high expression group was better than that of low expression group （P<0.05）. CCK8 assay showed that the OD value of PKP1 overexpression group was statistically significant compared with that of empty plasmid group （P<0.01）. Conclusion PKP1 is lowly expressed in cutaneous melanoma， and its down-regulation is related to poor prognosis. Meanwhile， PKP1 can inhibit the proliferation of cutaneous melanoma cells， and has the potential to become a key gene for targeted therapy.

【Key words】Skin cutaneous melanoma； PKP1； Survival time； Cell proliferation； Targeted therapy

皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）作為一種常見的皮膚惡性腫瘤，其發(fā)生于表皮基底層的黑色素細(xì)胞，具有極易侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點(diǎn)[1，2]。正是由于癌細(xì)胞惡性程度較高，使得癌癥的進(jìn)程發(fā)展迅速，很多患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。因此，針對(duì)皮膚黑色素瘤有著較高的發(fā)病率以及致死率這些問題，臨床需要去發(fā)現(xiàn)一些有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物以及有效的治療靶點(diǎn)用于癌癥的診斷以及治療。Plakophilin-1（PKP1）是armrepeat（armadillo）和plakophilin基因家族的成員，它是橋粒的重要組成部分。從既往的研究發(fā)現(xiàn)[3]PKP1的異常表達(dá)和許多癌癥的進(jìn)程有關(guān)，比如，在肺癌中，PKP1 發(fā)揮了腫瘤抑制因子的角色，其蛋白表達(dá)可作為晚期肺癌患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物；在乳腺癌中，miR-328a/Pkp1信號(hào)通路參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲過程[4]；PKP1在食管癌中，其表達(dá)水平與癌癥分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，它有作為腫瘤標(biāo)志物的潛力預(yù)測(cè)病人的預(yù)后[5]。但是PKP1在皮膚黑色素瘤中的相關(guān)作用并未見明確報(bào)道，本研究旨在利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于PKP1在皮膚黑色素瘤的是否涉及相應(yīng)的生物學(xué)作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 不同腫瘤中PKP1表達(dá)水平的探究 利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)在不同的腫瘤組織和正常組織中PKP1的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，旨在初步探究PKP1在不同癌種中的表達(dá)情況。

1.2 方法

1.2.1皮膚黑色素瘤組織和正常組織中的PKP1的表達(dá)差異 首先利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（數(shù)據(jù)源于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)），單獨(dú)探究PKP1在皮膚黑色素瘤和正常組織中的表達(dá)水平是否具有差異，其中分析時(shí)參數(shù)|Log2FC|Cutoff值為1，p-value Cutoff值小于0.01；為了更全面探究PKP1在組織中的表達(dá)情況，利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（多用于探究目標(biāo)基因以及確定腫瘤亞群特異性候選生物標(biāo)志物），探究在原發(fā)性癌組織以及轉(zhuǎn)移性癌組織中PKP1的表達(dá)情況，旨在分析對(duì)于PKP1在不同病理因素下皮膚黑色素瘤中 PKP1是否具有差異表達(dá)。

1.2.2 PKP1的表達(dá)水平 對(duì)于腫瘤病人預(yù)后的影響 利用GEPIA 2數(shù)據(jù)庫(kù)，探究目的基因PKP1的表達(dá)水平是否和皮膚黑色素瘤患者的預(yù)后產(chǎn)生影響，主要觀察的指標(biāo)包括總生存時(shí)間（Overall Survival）以及無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間（Recurrence free survival）。

1.2.3細(xì)胞的培育和轉(zhuǎn)染 利用SK-MEL-1細(xì)胞（人皮膚黑色素瘤細(xì)胞）進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)（培養(yǎng)液：MEM+10%FBS+1%P/S；培養(yǎng)條件：37 ℃，5%CO2）；PKP1過表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照（NC），質(zhì)粒的構(gòu)建由蘇州吉瑪基因公司完成。

1.2.4蛋白表達(dá)水平的測(cè)定 為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染的效率，應(yīng)用免疫印記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不同處理組細(xì)胞蛋白水平的檢測(cè)，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至 80% 以上，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細(xì)胞3次，用蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白并計(jì)算蛋白濃度，調(diào)整兩組細(xì)胞間總蛋白濃度均等。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、成像。

1.2.5 CCK8實(shí)驗(yàn)對(duì)于SK-MEL-1細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用 通過CCK8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，按照CCK8試劑說明書的要求，對(duì)照組和過表達(dá)組細(xì)胞均分別在12、24、36、48、60 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，CCK8試劑加樣10微升進(jìn)入每個(gè)檢測(cè)空，避光孵育2 h后上樣檢測(cè)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè) OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 不同組織之目的基因的表達(dá)量的差異使用配對(duì)t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析用mean+SD表示，患者的生存差異、生存曲線繪制分別使用log-rank檢驗(yàn)和K-M法。

2 結(jié)果

2.1 PKP1在多種腫瘤組織中異常表達(dá) TIME 2.0分析顯示，在多種腫瘤，如卵巢癌（BRCA），腎嫌色細(xì)胞癌（KICH），以及腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）等腫瘤組織中PKP1的表達(dá)水平低于正常組織（P<0.05）；而在膽管癌（CHOL），肝癌（LIHC）以及腎透明細(xì)胞癌（KIRC）等腫瘤中PKP1的表達(dá)水平高于正常組織（P<0.05），見圖1。

2.2 皮膚黑色素瘤組織中PKP1的表達(dá)差異 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，正常組織中，PKP1的表達(dá)水平高于皮膚黑色素瘤組織（P<0.05）。

2.3 PKP1高表達(dá)的患者總生存時(shí)間更長(zhǎng) 將黑色素瘤的患者分為PKP1高表達(dá)組以及PKP1低表達(dá)組，以O(shè)S作為觀察的指標(biāo)，結(jié)果顯示PKP1高表達(dá)組優(yōu)于低表達(dá)組（P=0.00031），見圖3。

2.4 PKP1過表達(dá)后蛋白水平的驗(yàn)證 過表達(dá)PKP1后，通過蛋白水平對(duì)于NC組細(xì)胞和過表達(dá)PKP1組細(xì)胞的驗(yàn)證顯示，PKP1過表達(dá)組PKP1蛋白水平高于NC組，見圖4。

2.5 PKP1抑制SK-MEL-1的增殖 CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)PKP1后，PKP1過表達(dá)組與空質(zhì)粒組細(xì)胞OD值相比，差異顯著（P<0.01），見圖5。

3 討論

皮膚黑色素瘤是皮膚腫瘤中常見的惡性腫瘤之一，目前皮膚黑色素瘤的患病率仍處于明顯的上升趨勢(shì)[6，7]。當(dāng)下對(duì)于皮膚黑色素瘤的治療，外科手術(shù)仍是使得患者獲得長(zhǎng)期生存的最有效治療手段。但是由于皮膚黑色素瘤惡性程度較高，相當(dāng)一部分患者不再具備手術(shù)切除的條件。因此，其他有效的治療方式對(duì)于癌癥患者的治療顯得尤為重要。隨著靶向治療的興起，針對(duì)特定靶基因，可以達(dá)到延緩癌癥的進(jìn)展甚至有可能達(dá)到癌癥治愈的結(jié)局[8，9]。而PKP1作為靶向治療研究的目的基因，在其他癌癥中，已經(jīng)顯示出了巨大的研究潛力。有學(xué)者在鱗狀細(xì)胞肺癌中研究發(fā)現(xiàn)[10]，通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除細(xì)胞中的PKP1，可以有效地抑制癌細(xì)胞的增殖，因此PKP1有作為肺癌中治療的一個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)研究的潛力；同時(shí)國(guó)外的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[11]，PKP1在前列腺癌中類似抑癌基因，在癌細(xì)胞中敲低PKP1的表達(dá)，降低了細(xì)胞的凋亡率，從而導(dǎo)致了癌癥的進(jìn)展；另外有研究發(fā)現(xiàn)[12]，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，PKP1的表達(dá)水平在癌癥中高表達(dá)，體現(xiàn)出致癌基因的作用；由此說明PKP1在多種癌癥中可發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，因此其作為一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)，具有很大的研究潛力。而關(guān)于PKP1在皮膚黑色素瘤中的作用并未深入探究，因此本研究主要針對(duì)PKP1是否有潛力在皮膚黑色素瘤中作為治療的靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)的探索。

本研究結(jié)果顯示，PKP1不僅在多種癌癥中表達(dá)水平異常，而且在皮膚黑色素瘤中，其癌組織中PKP1的表達(dá)水平明顯低于正常組織，這些結(jié)果說明了高表達(dá)的PKP1在皮膚黑色素瘤中，有可能扮演著抑癌基因的角色，從而抑制了癌癥的進(jìn)展。此外，TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行患者的生存分析也印證了這一點(diǎn)，高表達(dá)組PKP1的患者其生存時(shí)間長(zhǎng)于低表達(dá)組患者，提示PKP1完全有可能成為一個(gè)有效的腫標(biāo)志物指導(dǎo)皮膚黑色素瘤患者的預(yù)后[13-15]。而且通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了PKP1的異常表達(dá)和腫瘤的增殖水平密切相關(guān)。

綜上所述，PKP1在皮膚黑色素瘤中有作為腫瘤標(biāo)志物有指導(dǎo)患者預(yù)后的可能，且實(shí)驗(yàn)過程體現(xiàn)了PKP1有作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的研究?jī)r(jià)值，通過針對(duì)PKP1進(jìn)行靶向治療，對(duì)于今后皮膚黑色素瘤的治療提供了研究線索。

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編輯 柴泛宇