賀艷紅，艾仁達，黃鎮(zhèn)楊，張 洋，劉小龍，袁智勇

（1.西南林業(yè)大學，云南省高校極小種群野生動物保育重點實驗室，昆明，650224；2.西南大學生命科學學院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶，400715）

Quasipaa delacouri（Angel，1928）隸屬兩棲綱（Amphibia）無尾目（Anura）叉舌蛙科（Dicroglossidae）棘胸蛙屬（Quasipaa）［1］。該物種于1928年由Angel［2］首次報道和描述，模式產(chǎn)地為越南北干?。˙ac Kan Province，Vietnam）。目前僅分布在越南北部（老街省、北干省、山羅省、永福省、河江省、和平省、義安省、清化省、承天順化省和峴港市）及鄰近的老撾等地區(qū)，在中國境內(nèi)未發(fā)現(xiàn)分布［1］。2022 年7 月，在對中國云南省文山麻栗坡老山省級自然保護區(qū)的調(diào)查中，于保護區(qū)內(nèi)兩處地點共采集到4 號棘胸蛙屬物種標本，標本現(xiàn)保存于西南大學淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室。采集到的棘胸蛙屬物種標本經(jīng)外部形態(tài)特征對比及分子系統(tǒng)發(fā)育關系分析，鑒定為Q.delacouri，是中國兩棲動物分布新紀錄。本研究描述了采集地生境、物種形態(tài)特征、分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析，為該物種的后續(xù)深入研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 標本采集與形態(tài)學測量

2022年7月3日，在中國云南省文山麻栗坡老山省級自然保護區(qū)內(nèi)兩處地點（22°50′21.41″ N，104°40′36.16″ E，海 拔1 100 m；22°50′15.90″ N，104°43′10.91″ E，海拔1 405 m）共采集到4號棘胸蛙屬物種標本（標本號：SWU 0002320、SWU 0002321、SWU 0002322、SWU 0002323）。取肝臟、大腿肌肉和少許腳趾樣品儲存于95%乙醇中，-24 ℃保存，用于后續(xù)分子實驗驗證。整體標本固定于75%乙醇溶液中。

參考Pham 等［3］的測量方法，用電子數(shù)顯卡尺測量標本的外部形態(tài)（測量精度為0.1 mm）。測量參數(shù)主要包括頭體長（snout-vent length，SVL）、頭長（head length，HL）、頭寬（head width，HW）、吻 長（snout length，SL）、眼間距（interorbital space，IOS）、鼻眼距（nostril-eye length，NEL）、鼻間距（internasal space，INS）、眼徑（diameter of eye，ED）、上眼瞼寬（width of upper eyelid，UEW）、鼓膜徑（diameter of tympanum，TD）、前臂及手長（length of lower arm and hand，LAHL）、脛長（tibia length，TIB）、足長（foot length，F(xiàn)T）、后肢全長（hind limb length，HLL）、指長（finger length，F(xiàn)L）及趾長（toe length，TL）。同時基于Angel 對Q.delacouri的形態(tài)描述［2］與本例標本進行形態(tài)比較。

1.2 分子實驗與系統(tǒng)發(fā)育關系分析

采用Thermo Fisher Scientific 公司提供的DNA提取試劑盒對新采集的4 號標本的肌肉組織進行全基因組DNA 提取，DNA 樣品-24 ℃保存。使用PCR對線粒體細胞色素b（Cyt b）基因片段擴增，引物 為Cytbyf1（5′-TTTCCGTAGACAACGCCACCCT-3′）和Cytbyf3（5′-CTAGGTTTTGATGAGGC-3′）［4］。PCR 反應程序為94 ℃預熱5 min；94 ℃變性45 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后由北京擎科生物科技有限公司對擴增產(chǎn)物 雙向測序。使用LaserGene 7.0 軟件包中的SeqMan對所得序列質(zhì)量檢測和人工校對，生成一致序列［5］。

根據(jù)Yan 等［6］對棘胸蛙屬系統(tǒng)發(fā)育的研究結果，選取虎紋蛙［Hoplobatrachus chinensis（Osbeck，1765）］作為外群，并從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載該屬其他類群物種序列，共27 條（表1）。使用MEGA 7.0 對每個線粒體Cyt b序列進行比對和編輯［7］?；谧畲笏迫环ǎ∕L）和貝葉斯法（BI）重建系統(tǒng)發(fā)育關系。由于線粒體Cyt b基因為編碼基因，在此基礎上，使用DAMBE 軟件篩選密碼子［8］，并使用jModelTest 2 中的AIC 標準計算序列的最佳進化模型［9］。第一位密碼子和第二位密碼子的最佳模型為TPM+G，第三位密碼子的最佳模型為TrN+G。使用RAxML 8.2.4［10］構建最大似然樹，基于默認參數(shù)，自展1 000 次估算節(jié)點支持率。使用MrBayes 3.1.2［11］進行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)計算的最佳模型，在默認熱值下使用馬爾可夫鏈蒙特卡洛鏈（MCMC）執(zhí)行獨立運算4次，每1 000代抽樣1 次，執(zhí)行500 萬代，散頻率平均標準偏差小于0.01 達到穩(wěn)定?；谑諗壳闆r，拋棄前25%的樹。使用來自MrBayes 的分裂頻率平均標準差（ASDSF）和潛在尺度縮減因子（PSRF）統(tǒng)計數(shù)據(jù)評估拓撲收斂性和分支長度收斂性。然后使用Tracer v.1.5［12］檢查各運行參數(shù)值是否收斂（ESS 值＞200）。最后使用MEGA 7.0［7］中的p-distance 雙參數(shù)模型計算棘胸蛙屬物種間的遺傳距離。

表1 樣品分子分析信息Tab.1 Sample information used for the molecular analysis

2 結果

2.1 生境

云南省文山麻栗坡老山省級自然保護區(qū)屬南亞熱帶高原季風氣候［13］，本次采集到的標本發(fā)現(xiàn)于海拔1 100～1 500 m 的山澗溪流中，水流急，兩側植被豐富，主要以灌木、草本植物和季風常綠闊葉林為主。在采集地附近還發(fā)現(xiàn)了河口湍蛙（Amolops shihaitaoi）、沙巴臭蛙（Odorrana chapaensis）、長吻臭蛙（O.nasica）和大角蟾（Xenophrys major）。

2.2 形態(tài)特征

標本各部位數(shù)據(jù)見表2。共采集到4 號棘胸蛙屬標本，其中2 號為雄性成體標本（SWU 0002320，SWU 0002321），2 號為亞成體（SWU 0002322，SWU 0002323），未采集到雌性標本。新采集到的標本體型較大，成體雄性頭體長為76.2～77.3 mm。頭寬大于頭長；吻端鈍圓，突出于下唇；吻長小于眼徑；鼓膜小，不明顯。指端略膨大，指關節(jié)下瘤大，指式為Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅱ。后肢長，左右跟部重疊。趾端膨大呈圓形吸盤，趾間全蹼，趾關節(jié)下瘤大，趾式為Ⅳ＞Ⅲ≈Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅰ。

表2 麻栗坡老山省級自然保護區(qū)采集的棘胸蛙屬標本形態(tài)量度Tab.2 Morphological measurement of Quasipaa specimens collected in Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve mm

背部皮膚光滑，整體呈黑褐色，無明顯褶皺。背上部分布有圓條狀黑色斑紋；背下部、肛周圍及兩股均分布有小疣粒，肛部及周圍分布有黑色角質(zhì)刺。體側部有5或6個較大的白色圓疣。咽喉部有淺棕色斑（圖1）。

圖1 德氏棘蛙形態(tài)（麻栗坡老山省級自然保護區(qū)，SWU 0002321，雄性）Fig.1 Morphology of Quasipaa delacouri（Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve，SWU 0002321，male）

2.3 分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析

研究新獲得4 條長度為433 bp 的線粒體Cyt b序列（GenBank 序列號為OR042806，OR042807，OR042808，OR042809）（表1），結合從GenBank 下載的23 條數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)142 個簡約信息位點和165 個變異位點。基于ML 和BI 法構建的系統(tǒng)發(fā)育結果具有相似的拓撲結構，這里僅展示貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。在文山麻栗坡老山省級自然保護區(qū)內(nèi)采集到的4 號棘胸蛙屬物種標本與越南承天順化省（Thua Thien Hue，Vietnam）和越南峴港市（Danang，Vietnam）的Q.delacouri標本聚為一支（圖2）。使用p-distance 雙參數(shù)模型計算遺傳距離結果顯示，新采集的4 號標本與Q.delacouri的遺傳距離為6.5%。

圖2 基于線粒體Cyt b基因構建的棘胸蛙屬貝葉斯樹Fig.2 Bayesian inference tree of Quasipaa derived from Cyt b sequences

3 討論

本次新采集到的4 號棘胸蛙屬物種標本形態(tài)學鑒定特征與越南北干?。˙ac Kan Province，Vietnam，模式產(chǎn)地）的Q.delacouri的鑒定特征基本符合。頭寬大于頭長；鼓膜小，不明顯；指端略膨大，指關節(jié)下瘤大；第一指略長于第二指；后肢長，左右跟部重疊；趾端膨大，趾間全蹼，趾關節(jié)下瘤較大。背部呈黑棕色，皮膚光滑，無明顯褶皺；肛部及周圍有黑色角質(zhì)刺。與模式標本（頭體長120 mm）相比，新采集的成體雄性標本整體形態(tài)小（頭體長76.2～77.3 mm），吻長（9.5～9.7 mm）略小于眼徑（11.1～11.2 mm），而模式標本的吻長（17 mm）略長于眼徑（12 mm）［2］。由于描述的模式標本并未記錄性別［2］，無法判斷該形態(tài)差異是否因雌雄性別差異所致，且本次未采集到雌性標本，不能進一步比較判斷這些差異是種群間的還是雌雄間的。同時系統(tǒng)發(fā)育分析結果也支持新采集到的標本為Q.delacouri，4 號標本都與Q.delacouri標本聚為一支（圖2）。基于以上結果，認為新采集到的4 號標本為Q.delacouri，依據(jù)其英文別名Tonkin Spiny Frog（Tonkin 為越南北干省曾用名）［14］，將該物種的中文名定為“德氏棘蛙”。

Quasipaa delacour最早被發(fā)現(xiàn)于越南北部北干?。?］，之后在老撾和越南義安省、清化省及河江省 等地先后被報道過，但少有該物種的圖片記錄及 生境描述，尚不清楚該物種的具體繁殖時間［15-18］。Q.delacour于2022 年7 月在中國云南省文山麻栗 坡老山省級自然保護區(qū)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，該保護區(qū)與相鄰的越南北部地區(qū)有著相似的物種組成，對動物地 理學研究有重要意義，但在采樣過程中未觀察到O.delacour的抱對現(xiàn)象，加之考察時間較短，尚不清楚其是否進入繁殖期，因此該物種的繁殖生活史需進一步研究。

致謝：感謝文山麻栗坡老山自然保護區(qū)的工作人員對野外工作給予的幫助。