劉 青，郭 玲，仉 偉，趙國策，朱云蕓，尹占龍，謝緒昌

（1.濟(jì)南市公園發(fā)展服務(wù)中心（動物園工作部），濟(jì)南，250031；2.北京動物園管理處，北京，100044）

動物籠舍環(huán)境中存在多種來自外界入侵或者內(nèi)環(huán)境繁殖的細(xì)菌，不僅污染動物的生活環(huán)境，對動物健康產(chǎn)生潛在的威脅，還可能釋放到籠舍外部，通過傳播對周圍環(huán)境產(chǎn)生影響，這一過程也成為耐藥菌株在不同動物及不同生態(tài)系統(tǒng)間傳遞的重要途徑。因此，做好動物飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、消毒等生物安全措施至關(guān)重要。消毒劑作為控制微生物感染和傳播的重要方式被廣泛應(yīng)用［1］，然而消毒劑的長期不合理使用，也會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性從而降低殺菌效果［2］，抗生素和消毒劑之間的交叉耐藥性也成為一個被廣泛關(guān)注的問題［3］。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）廣泛存在于動物籠舍的地面、墻面及棲架等處，是流行病學(xué)調(diào)查和研究的重要指示菌。本研究從4 種野生動物籠舍（猛獸館、大象館、猿猴館和鳴禽館）環(huán)境中分離大腸埃希氏菌作為受試菌，測定受試菌對常用7 種抗生素的敏感性和4 種消毒劑的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并對菌株攜帶的抗性基因進(jìn)行篩選，以期為圈養(yǎng)野生動物抗生素、消毒劑的使用提供數(shù)據(jù)支持，為野生動物耐藥性來源的探析提供參考，對改善籠舍環(huán)境衛(wèi)生、保障動物健康及維護(hù)公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌的分離鑒定

2022 年4—7 月，對濟(jì)南動物園大象館、猛獸館、鳴禽館和猿猴館4 個館舍內(nèi)的環(huán)境樣本進(jìn)行采樣，用無菌棉簽擦拭籠舍墻壁、棲架和水槽等處，放入含PBS 的1.5 mL EP 管中帶回實(shí)驗(yàn)室，調(diào)整濃度涂布在大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（ECC）上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取藍(lán)綠色單菌落純化，提取細(xì)菌基因組DNA 送至北京賽默百合生物科技有限公司測序分析。

1.2 抗生素藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法檢測分離菌株對臨床常用7 種抗生素的敏感性，結(jié)果按照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判定（表1）。

表1 大腸埃希氏菌抑菌圈直徑折點(diǎn)Tab.1 Diameter break point of inhibition zone of Escherichia coli

1.3 消毒劑最低抑菌濃度測定

參照CLSI 2017和Zou等［4］推薦的微量肉湯稀釋法，測定過硫酸氫鉀復(fù)合粉、二氯異氰尿酸鈉粉、過氧乙酸溶液和戊二醛癸甲溴銨溶液4 種消毒劑對分離菌株的MIC。將篩選出的菌株制備成菌懸液加入到96 孔板中，并將消毒劑進(jìn)行梯度稀釋，最高濃度為1∶50，最低濃度為1∶25 600，每個樣本重復(fù)測定 3次，以抑制細(xì)菌生長的最高稀釋度作為測試消毒劑的MIC。

1.4 抗性基因篩選

利用Illumina 測序平臺完成樣品的基因組二代建庫及測序，將服務(wù)器里的數(shù)據(jù)上傳至集群并運(yùn)行序列拼接，獲得菌株抗性基因等信息。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌的分離鑒定

大腸埃希氏菌在ECC 培養(yǎng)基中形成邊緣整齊、藍(lán)綠色的光滑菌落，直徑1～2 mm。將通過特異性培養(yǎng)基篩選出的菌株純化后提取細(xì)菌基因組DNA，經(jīng)16S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在1 400 bp 處有明亮的目的條帶（圖1）。PCR 產(chǎn)物測序后與GenBank 中的大腸埃希氏菌序列進(jìn)行比對分析，若同源性達(dá)到99%以上，則判定菌株為大腸 埃希氏菌。通過鑒定，每個館舍分別篩選出10 株 大腸埃希氏菌，共計(jì)40 株進(jìn)行后續(xù)檢測，其中空氣中分離3 株（7.5%），墻壁隔離網(wǎng)8 株（20.0%）、棲架臥床11 株（27.5）、地面15 株（37.5%）和水槽食盆 3株（7.5%）。

圖1 大腸埃希氏菌16S rRNA PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification result of 16S rRNA of Escherichia coli

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

40 株大腸埃希氏菌的耐藥表型見表2。分離菌株對復(fù)方新諾明和氨芐西林的耐藥率較高，分別為50.0%和40.0%，其次為頭孢噻肟7.5%，諾氟沙星和慶大霉素的耐藥率均為5.0%，對美羅培南敏感。菌株的主要耐藥譜型為氨芐西林加復(fù)方新諾明。大象館環(huán)境中菌株耐藥范圍最廣，對4 種藥物表現(xiàn)出耐藥性，其次是猛獸館和猿猴館，鳴禽館僅對2 種藥物表現(xiàn)出耐藥性。猛獸館菌株對氨芐西林、復(fù)方新諾明和頭孢噻肟的耐藥率均最高，分別為70%、70%和30%。

表2 不同館舍環(huán)境中大腸埃希氏菌耐藥率Tab.2 Drug resistance rate of Escherichia coli at different cages

2.3 消毒劑最低抑菌濃度

4 種消毒劑對不同館舍大腸埃希氏菌的MIC 值分布情況見表3。分離菌株對過氧乙酸較敏感，MIC 值為1∶1 600～1∶6 400，低于推薦使用濃度（1∶1 000）；過硫酸氫鉀復(fù)合粉MIC 值為1∶400～ 1∶1 600，等于或低于推薦使用濃度（1∶400）；二氯異氰尿酸鈉粉廠家推薦使用的濃度范圍較大，35.0%的菌株MIC值達(dá)到1∶800，高于推薦的最低使用濃度（1∶2 000），60%的菌株MIC 值為1∶1 600，均低于推薦的最高使用濃度（1∶200）；戊二醛癸甲溴銨溶液MIC 值為1∶1 600～1∶6 400，其中17.5%的菌株MIC值為1∶1 600，接近推薦使用的最高濃度（1∶2 000）。鳴禽館菌株對消毒劑的敏感性高于其他館舍，二氯異氰尿酸鈉粉、過硫酸氫鉀復(fù)合粉和戊二醛癸甲溴銨溶液的最高M(jìn)IC 值均低于大象館、猛獸館和猿猴館。

表3 消毒劑MIC值分布情況Tab.3 MIC value distribution of disinfectant

2.4 抗性基因檢測結(jié)果

抗性基因篩選結(jié)果顯示，40 株大腸埃希氏菌共檢測到29 種耐藥基因，其中抗生素耐藥基因有β-內(nèi)酰胺類（blaTEM、blaCTX、blaACT、blaCMY和blaDHA）、喹諾酮類（qnrB、qnrS）、氨基糖苷類（aadA、aph、aac）、四環(huán)素類（tet（A）、tet（D））、磺胺及其增效劑類（sul1、sul2、sul3和dfrA）、氯霉素類（cmlA、floR）、磷霉素（fosA）、利福平（ARR）和大環(huán)內(nèi)酯類（mph（A））；消毒劑抗性基因篩選出sugE、emrE、qacE、qacEΔ1、qacF、qacH和qacI；還有多藥排外泵mdfA（圖2）。所有菌株都攜帶至少1 種抗性基因，猛獸館分離菌株攜帶的抗性基因最多，有28 種，其次是大象館和猿猴館，分別有19、11種抗性基因，鳴禽館分離菌株攜帶的抗性基因最少，僅檢測到5 種。所有抗性基因中mdfA的檢出率最高，為92.5%，其次是tet（A）（45.0%）和sugE（42.5%）。猛獸館分離菌株有90.0%攜帶消毒劑抗性基因，其他3 個館舍消毒劑抗性基因攜帶率為40.0%～50.0%。

圖2 不同館舍環(huán)境中大腸埃希氏菌抗性基因篩選結(jié)果Fig.2 Resistance gene screening of Escherichia coli at different cages

3 討論

圈養(yǎng)野生動物存在不同程度的耐藥性，Zhu等［5］對我國13 家動物園50 種圈養(yǎng)非人靈長類動物中獲得的995 種大腸埃希氏菌的耐藥性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示83.62%的菌株對至少一種抗生素具有耐藥性，多重耐藥性占47.94%；陸曉健等［6］從動物園中分離出69 株大腸埃希氏菌，發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌對頭孢唑林、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為41.42%、61.13%和48.28%；薛原等［7］對東北虎（Panthera tigris altaica）源大腸埃希氏菌的耐藥性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌對氨芐西林、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率高達(dá)100.00%、85.12%和80.24%?？咕幬锏牟缓侠硎褂檬羌?xì)菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因，圈養(yǎng)野生動物管理單位對抗菌藥物的管理和使用存在差異，這些情況未見相關(guān)統(tǒng)計(jì)報告。在樣本采集單位抗菌藥物的使用主要是針對個體動物的抗感染治療，部分用于小群體細(xì)菌性疾病的預(yù)防，沒有作為促生長劑添加使用，因此推測圈養(yǎng)野生動物細(xì)菌耐藥菌的產(chǎn)生還存在其他相關(guān)因素。Mao 等［8］對北京市環(huán)境空氣中可培養(yǎng)細(xì)菌的細(xì)菌組成和耐藥性進(jìn)行研究，表明環(huán)境空氣中大約1/4的細(xì)菌都是多重耐藥菌，并指出這可能成為細(xì)菌間抗生素耐藥性轉(zhuǎn)移的潛在途徑。本研究中，從圈養(yǎng)野生動物館舍環(huán)境中分離的菌株對復(fù)方新諾明和氨芐西林的耐藥率最高，分別為50.0%和40.0%，有研究人員從同一環(huán)境下的野生動物糞便中分離大腸埃希氏菌，并對其耐藥率進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)耐藥率最高的是磺胺類，為41.1%，其次是β-內(nèi)酰胺類，為31.8%［9］，這提示耐藥細(xì)菌的環(huán)境傳播與圈養(yǎng)野生動物細(xì)菌耐藥性之間存在潛在的相關(guān)性，動物的飼養(yǎng)環(huán)境可能對圈養(yǎng)野生動物耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展具有很大的影響，因此開展圈養(yǎng)野生動物環(huán)境菌株相關(guān)監(jiān)測工作是十分必要的。

細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的遺傳學(xué)機(jī)制分為染色體介導(dǎo)和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性。染色體介導(dǎo)耐藥性是基因突變產(chǎn)生的［10］，也叫作固有耐藥性，可遺傳且較為穩(wěn)定；質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性即獲得性耐藥性，是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。對現(xiàn)代環(huán)境細(xì)菌菌群的基因組學(xué)研究顯示，各種環(huán)境下存在大量的抗生素耐藥基因［11］，本研究中篩選出了29 種耐藥基因，攜帶率較高的是mdfA及四環(huán)素類、磺胺類和β-內(nèi)酰胺類。

耐藥基因mdfA屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（MFS）成員，不會產(chǎn)生高水平的耐藥［12］，但在過量表達(dá)時可能會引起多重耐藥［13］，該基因在生物化學(xué)方面有廣泛的研究，但臨床相關(guān)性還缺乏佐證，與本研究結(jié)果相同的是從美國零售肉中分離的大腸埃希氏菌也有較高的攜帶率（96.5%）［4］。四環(huán)素類藥物近5 年在本研究園區(qū)沒有使用記錄，因此未做藥敏試驗(yàn)。本研究中有19 株菌株攜帶tet基因，并在4 個館舍均有檢出，該基因在環(huán)境中廣泛分布，推測與其傳播方式密切相關(guān)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)tet基因都與結(jié)合或移動元素相連，可以在細(xì)菌種間或?qū)匍g轉(zhuǎn)移。目前發(fā)現(xiàn)的磺胺類耐藥基因主要有sul1、sul2和sul3［14］，dfrA是編碼甲氧芐啶耐藥二氫葉酸還原酶的抗性基因，在革蘭氏陰性菌中已知有30 多種［15］，是引起磺胺及其增效劑耐藥的主要因素。超廣譜內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機(jī)制，可以滅活青霉素、窄譜和廣譜頭孢菌素等。近年來，臨床分離得到的細(xì)菌主要攜帶blaTEM和blaCTX等，在大腸埃希氏菌和肺炎菌中發(fā)現(xiàn)的較多，其中blaTEM型檢出率總體較高，并具有諸多亞型［16］，該類基因型在本研究園區(qū)環(huán)境菌株中攜帶率同樣較高。值得注意的是，檢測到5 株頭孢菌素酶耐藥菌株，其中猛獸館 4 株（blaCMY2 株，blaDHA2 株），大象館1 株（blaACT）。頭孢菌素酶是革蘭氏陰性菌對頭孢三代抗生素產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制，應(yīng)該引起重視。

消毒是控制感染的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)，可有效阻斷病原微生物的傳播，這是做好生物安全，預(yù)防疾病的關(guān)鍵。但長期使用亞致死濃度的消毒劑易導(dǎo)致細(xì)菌對該濃度的消毒劑產(chǎn)生適應(yīng)效應(yīng)，逐漸產(chǎn)生染色體或質(zhì)粒的變異，最終獲得遺傳物質(zhì)編碼的耐藥性并穩(wěn)定遺傳，表現(xiàn)出對消毒劑的抗性。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些菌株對消毒劑的敏感性降低［17］，同時還發(fā)現(xiàn)一些與消毒劑相關(guān)的抗性基因，如位于質(zhì)粒上的QAC基因家族，可以通過結(jié)合轉(zhuǎn)移傳遞耐藥性，是消毒劑抗性基因研究中最常見的基因［18］，包括qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacI和sugE（p）等［19］，染色體編碼基因sugE（c）、emrE、ydgE和ydgF等也特異地介導(dǎo)對QAC 的抗藥性，并可在大腸埃希氏菌中垂直傳播。本研究園區(qū)季銨鹽類消毒劑沒有在環(huán)境消毒中廣泛使用，但在各館舍的分離菌株中共檢測到 7種相關(guān)耐藥基因，來源有待進(jìn)一步研究。消毒劑的規(guī)范使用至關(guān)重要，本研究中消毒劑的MIC 檢測結(jié)果可作為參考，在實(shí)際應(yīng)用過程中會受有機(jī)物、溫度和污染物等多種因素的影響［20-21］，因此需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整使用濃度，以達(dá)到較好的消毒效果。