李福森 黃媛恒 黃曉亮 李映新

摘要 ［目的］建立石蟬草總木脂素含量測定的方法并通過正交試驗優(yōu)選石蟬草總木脂素的最佳提取工藝。［方法］以五味子乙素為對照品繪制標準曲線，采用變色酸－硫酸顯色體系，紫外-可見分光光度法測定石蟬草乙醇提取物中總木脂素含量；采用L9（34）正交試驗法，以總木脂素含量為考察指標，優(yōu)選石蟬草總木脂素的提取工藝。［結果］五味子乙素在4.00～24.00 μg/mL線性關系良好（R2=0.996 1），平均回收率為97.68%，RSD為1.11%，石蟬草總木脂素優(yōu)化的提取工藝為8倍量80%乙醇回流提取3次，每次2 h。［結論］該含量測定方法準確、簡便、經濟，適用于石蟬草總木脂素的含量測定，優(yōu)選得到的提取工藝可為石蟬草總木脂素的提取提供參考。

關鍵詞 石蟬草；總木脂素；含量測定；提取工藝；正交試驗

中圖分類號 R284? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0183-02

作者簡介 李福森（1973—），男，廣西百色人，副教授，碩士，從事植物化學研究。*通信作者，正高級實驗師，博士，從事天然產物藥理活性研究。

收稿日期 2022-09-06；修回日期 2022-10-13

石蟬草（Peperomia dindygulensis Miq）為胡椒科草胡椒屬（Peperomia Ruiz et Pavon）植物，分布于我國南方的各省區(qū)，以全草入藥，味辛，性涼，具有清熱解毒、化疲散結、利水消腫的功效，主治肺熱咳嗽、麻疹、瘡毒、癌腫等癥［1］?！对颇现胁菟庍x》中記載用其治療胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌、肺癌。石蟬草主要含木脂素類、黃酮類、聚酮類等化學成分，其中木脂素類含量較高［2-6］，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，草胡椒屬木脂素類具有抗腫瘤、抗炎、抗病原微生物、除草活性等藥理活性［2，7-10］。目前，對石蟬草開展的研究很少，其木脂素類成分的含量測定以及提取工藝研究鮮見報道。石蟬草主要木脂素成分草胡椒素A～E（peperomin A～E）多含亞甲二氧基［7］，該研究采用變色酸-硫酸顯色體系以及紫外分光光度法測定石蟬草總木脂素含量，并采用L9（34）正交試驗對石蟬草總木脂素提取條件進行優(yōu)化。

1 材料與儀器

1.1 試材 石蟬草購于本地藥材市場，經廣西醫(yī)科大學生藥學教研室朱丹博士鑒定為胡椒科草胡椒屬植物石蟬草（Peperomia dindygulensis Miq）的全草，藥材粉碎后過3號篩，60 ℃干燥后備用。

1.2 試劑 五味子乙素對照品（HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號 P29J8F38066）；無水乙醇、甲醇、變色酸、硫酸均為分析純，水為純化水。

1.3 儀器 UV-1240型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；204型電子分析天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；HH-2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇友聯(lián)儀器研究所）；R1010 型旋轉蒸發(fā)器（鄭州長城科工貿有限公司）；KWY-102 型電熱干燥箱（武漢市武昌實驗儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取五味子乙素對照品 2 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為 0.2 mg/mL 的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取石蟬草約10 g，加80 mL 80%乙醇回流提取3次，每次3 h，合并提取液并過濾，濾液減壓蒸干，取提取物10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾。

2.3 測定波長的選擇 各取對照品溶液和供試品溶液于10 mL 刻度試管中，按照變色酸-硫酸顯色法，于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入0.5 mL 10% 變色酸水溶液、3 mL 濃硫酸， 1.5 mL蒸餾水，沸水浴中放置30 min，流水冷卻，試劑空白同法操作。于400～800 nm掃描吸收光譜，經顯色后，對照品溶液和供試品溶液均在560 nm處有最大吸收，故選擇在560 nm作為測定波長。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察。各取對照品溶液 100、200、300、400、500、600 μL 于 10 mL刻度試管中，按照“2.3”條件顯色后，于560 nm 處測吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，考察線性關系。 得到回歸方程Y=33.298X+0.048 1（R2=0.996 1），表明五味子乙素在4.00～24.00 μg/mL 線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗。取對照品溶液 400 μL，按照“2.3”條件顯色后，連續(xù) 6 次測定吸光度，計算得到吸光度的 RSD為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液 400 μL，按照“2.3”條件顯色，分別在 0、5、10、15、20、25、30 min 測定吸光度，計算得到吸光度的RSD為2.38%，表明在30 min內樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗。按照“2.2”操作方法制備6份供試品溶液，各精密量取400 μL，顯色并測定吸光度，帶入標準曲線計算總木脂素含量，計算得到總木脂素含量的RSD為1.77%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗。精密量取6份已知總木脂素質量的供試品溶液，精密加入五味子乙素對照品溶液300 μL，按照標準曲線制備方法操作顯色并測定吸光度，計算樣品平均回收率及 RSD，結果見表1。

2.5 石蟬草總木脂素提取工藝優(yōu)化

2.5.1 正交試驗設計。以乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）作為考察因素，每個因素取3個水平（表2）。稱取石蟬草粗粉50 g，共稱9份，分別按照L9（34） 正交試驗法進行提取，各組提取液過濾，回收溶劑并真空冷凍干燥至恒重。

2.5.2 正交試驗結果。分別精密稱取“2.5.1”獲得的提取物10 mg于10 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾后各取400 μL續(xù)濾液，按照“2.3”操作，將吸光度代入標準曲線，以總木脂素含量為考察指標，對試驗結果進行分析。根據(jù)直觀極差（R）分析結果（表3）可知，影響石蟬草總木脂素提取效果的因素從大到小依次為D＞C＞B＞A，最佳提取工藝為A1B3C2D3，即80%乙醇以1∶8（g∶mL）的料液比回流提取2 h，共提取3次。經過方差分析（表4）可知，提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度、提取時間對提取效果無顯著影響。

2.5.3 驗證試驗及結果。稱取石蟬草粗粉50 g，按優(yōu)選的提取工藝進行3次平行提取，得到總木脂素的平均含量為22.18 mg/g，RSD為1.72%。

3 討論

目前，中藥中總木脂素的含量測定多采用分光光度法，因天然產物中的木脂素類成分中多含亞甲二氧基，該基團于濃硫酸作用下水解生成甲醛，甲醛與含酚羥基的變色酸反應生成紫紅色產物，可以利用此特征采用分光光度法測定總木脂素含量［11］。據(jù)報道，石蟬草主要化學成分為草胡椒素A （peperomin A），具有亞甲二氧基的特征結構，五味子乙素也含有亞甲二氧基，兩者均可以在變色酸-硫酸體系中顯色，且均在560 nm處有最大吸光度［7］，因草胡椒素A標準品難獲得，故用五味子乙素作為對照品，采用分光光度法對石蟬草總木脂素類進行含量測定。方法學研究結果表明，精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率均符合規(guī)定的要求，說明該方法可用于石蟬草中總木脂素含量的測定。

通過4因素3水平正交試驗，以乙醇提取液中總木脂素含量為考察指標，優(yōu)選石蟬草總木脂素的最佳提取工藝。通過試驗及數(shù)據(jù)分析，得出石蟬草總木脂素最佳提取工藝為：80%乙醇為提取試劑，以石蟬草粉末的8倍量提取3次，每次提取2 h。該研究可為石蟬草木脂素的提取和含量測定提供試驗依據(jù)。

參考文獻

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