基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討癲癇寧片治療癲癇的潛在作用機制研究

閆文浩，李晨豪，李尚穎，左莉華，李澤運*

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

2.遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110036

癲癇是一種由于大腦神經(jīng)元異常同步化放電引起的長期、慢性、反復(fù)、多病因、多臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。其病因復(fù)雜，危害巨大，可造成不可逆的腦功能障礙甚至死亡。目前癲癇臨床治療主要包括化學(xué)藥物治療、中藥治療、生酮飲食、神經(jīng)調(diào)控、外科手術(shù)治療等，其中化學(xué)藥物治療依賴卡馬西平、丙戊酸鈉等抗癲癇藥物，可能導(dǎo)致維生素D 水平降低、肝腎損傷等風(fēng)險[2]。中醫(yī)藥治療為癲癇控制提供了安全有效的補充手段[3]。癲癇寧片是由石菖蒲、纈草、蜘蛛香、鉤藤、甘松、薄荷腦、牽牛子、千金子組成，具芳香之氣，行散之力較強，為宣氣通竅之佳品，既能芳香化濕、醒脾健胃，又可化濁祛痰、滌痰開竅之藥，具有化痰開竅、化濕和胃、醒神益智、理氣活血、散風(fēng)祛濕等功效[4]。近年來，癲癇寧片已被廣泛應(yīng)用于原發(fā)性、繼發(fā)性癲癇治療中，常與化學(xué)藥物協(xié)同發(fā)揮作用，揚長避短，增強療效[5]。然而，由于成分復(fù)雜，其作用機制至今仍不明確，有待進一步研究。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，藥物成分、靶點、通路的復(fù)雜多層次可被現(xiàn)代研究手段所識別展現(xiàn)，為中醫(yī)藥現(xiàn)代藥理研究提供了強有力的工具。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接相結(jié)合的研究方法則逐漸系統(tǒng)化，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜作用機制的探索[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過公共數(shù)據(jù)庫搜集或化學(xué)鑒別等手段，明確中藥的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、與疾病相對應(yīng)的潛在靶點、可能形成的代謝通路等依次展開復(fù)方中藥的多成分、多靶點、多通路生物學(xué)特征[7]；分子對接技術(shù)則對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究揭示的核心靶點、核心成分進行親和力評估，進而驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的結(jié)果的準確性[8]。二者相結(jié)合產(chǎn)生了重要影響，成為中藥復(fù)雜作用機制研究的系統(tǒng)策略。

本研究以癲癇寧片為研究對象，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探討癲癇寧片治療癲癇的作用機制，構(gòu)建了藥物的活性成分、靶點與癲癇相關(guān)疾病基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進行分子生物學(xué)補充驗證。本研究契合中醫(yī)理論系統(tǒng)性、整體性的研究理念，為癲癇寧片治療癲癇的臨床合理應(yīng)用和進一步科學(xué)研究提供了理論依據(jù)。

1 方法和方法

1.1 癲癇寧片中藥活性成分篩選、靶點預(yù)測

通過TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫對鉤藤、石菖蒲、千金子進行活性成分的收集。在TCMSP 中的“herb name”輸入中藥名稱，以化合物口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 作為篩選條件，并且將無靶點的成分篩選掉。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，點擊“related targets”獲得各活性成分的靶蛋白名。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）的UniprotKB 檢索功能將靶蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名，篩選條件為“organism：homo sapiens”。

通過Herb 數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）搜集薄荷腦、甘松、牽牛子、纈草、蜘蛛香有效成分，同時運用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得化合物其SMILES，導(dǎo)入到結(jié)構(gòu)相似度預(yù)測靶點數(shù)據(jù)庫 SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget prediction.ch）預(yù)測其有效靶點。

1.2 癲癇相關(guān)靶點的獲取

通過在 GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、DisGent（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“epilepsy”進行檢索，以“relevance score”≥1 作為標準進行疾病相關(guān)的基因篩選，剔除重復(fù)基因，并經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行校正。

1.3 藥物–疾病靶點預(yù)測結(jié)果

將獲得的藥物作用靶點與癲癇靶點相互映射，然后作Venn 圖，從而獲得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“藥物活性成分–靶點”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)化合物與靶點的連接情況篩選出藥物作用于癲癇的關(guān)鍵化合物。

1.4 靶蛋白相互作用及核心靶點篩選

為了進一步研究藥物治療癲癇的蛋白之間的相互作用，將藥物–交集基因上傳至相互作用數(shù)據(jù)庫String（https://string-db.org/）進行蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫；物種設(shè)置為“homo sapiens”，最低相互作用評分設(shè)置為0.9，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，結(jié)果儲存為TSV 格式，將TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 中，并對網(wǎng)絡(luò)進行分析，保存網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，使用Cytoscape 中的Generate style from statistics 工具，用節(jié)點大小和顏色反應(yīng)反映degree的大小，節(jié)點越大degree 值越大；邊的粗細用于反映combine score 的大小，邊越粗combine score 越大，挑選核心的靶點做出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將藥物–疾病交集基因上傳至利用生物信息學(xué)開源軟件Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）在R 語言內(nèi)安裝運行clusterProfiler、Stringin、DOSE 和Pathview 程序，對其進行生物學(xué)過程的GO、KEGG 功能富集分析，并通過微生信平臺進行可視化顯示。利用微生信平臺GO 基因功能從生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）3 個方面注釋藥物治療癲癇的作用靶蛋白在基因功能中的作用。為闡明藥物治療癲癇的靶點在信號通路中進行KEGG 通路富集分析。選取GO 功能條目和KEGG 通路條目的前幾位作為藥物治療癲癇的主要基因功能富集過程和信號通路，預(yù)測癲癇寧片治療癲癇的潛在作用機制。

1.6 分子對接

將拓撲學(xué)參數(shù)排名靠前的大分子和小分子進行分子對接。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)由alphafold 數(shù)據(jù)（https://alphafold.ebi.ac.uk/）。對接小分子庫由TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）通過搜索中藥獲取并建立。使用AutodockTools1.2對蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)進行去水、加氫操作，并進行受體結(jié)構(gòu)準備工作。使用Open Babel 及Autodock 程序?qū)π》肿訋爝M行拆分等準備工作。對接使用Autodock 程序進行，最終結(jié)果導(dǎo)入pymol 進行對接結(jié)果的可視化。

2 結(jié)果

2.1 癲癇寧片活性成分篩選及靶點預(yù)測

通過TCMSP 和Herb 數(shù)據(jù)庫檢索收集到鉤藤20 個、石菖蒲6 個、千金子10 個、薄荷腦3 個、甘松5 個、牽牛子16 個、纈草20 個、蜘蛛香6 個有效成分；TCMSP 以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件篩選后，去除沒有靶點的化合物后，最終共得到鉤藤18 個、石菖蒲4 個、千金子8 個、薄荷腦1 個、甘松4 個、牽牛子13 個、纈草18 個、蜘蛛香4 個化學(xué)成分和308 個有效靶點，見表1。

表1 活性成分信息Table 1 Active ingredient information

2.2 癲癇相關(guān)靶點

通過在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“epilepsy”進行檢索，以“relevance score”≥1 作為標準進行篩選，共獲得了2 317 條癲癇相關(guān)的靶點，從OMIM 數(shù)據(jù)庫中共獲得325 條關(guān)于癲癇相關(guān)靶點信息，在DisGent 數(shù)據(jù)庫得到1 216 個靶點；合并3 個數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，剔除重復(fù)基因共得到2 837 個疾病靶點。

2.3 藥物活性成分–靶點預(yù)測結(jié)果

共獲得癲癇寧片治療癲癇的潛在作用靶點160個（圖1）。將上述所得的活性成分和有效交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.8 進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，獲得藥物活性成分–靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共包含582個節(jié)點，1 831 條邊。圖中倒三角代表癲癇寧片所含中藥，六邊形節(jié)點代表中藥成分，菱形節(jié)點代表靶點蛋白，其中黑線代表節(jié)點間的連接數(shù)量。對藥物活性成分–靶點網(wǎng)絡(luò)進行分析，其中degree 前9 位的活性成分分別為毛鉤藤堿（hirsutine）、山柰酚（kaempferol）、狼尾草麥角堿（penniclavin）、薄荷醇（menthol）、蒙花苷異戊酸酯（linarin isovalerate）、刺槐苷（acaciin）、廣藿香烯（patchoulene）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol），推測可能是復(fù)方的重要成分，見表2。采用CytoHubba 插件的degree 算法再次驗證得到關(guān)鍵化合物，分別為毛鉤藤堿、山柰酚、狼尾草麥角堿、β-谷甾醇。

圖1 癲癇寧片化學(xué)成分靶點與癲癇疾病靶點Venn 圖Fig.1 Venn diagram of chemical component targets of Dianxianning Tablets and epileptic disease targets

圖2 癲癇寧片藥物活性成分–靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Dianxianning Tablets active ingredients-target network diagram

表2 核心化學(xué)成分拓撲學(xué)參數(shù)Table 2 Topology parameter of key chemical components

2.4 核心靶點及網(wǎng)絡(luò)相互作用

將藥物成分靶點與癲癇相關(guān)的160 個共有靶點導(dǎo)入String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中進行蛋白相互作用預(yù)測，物種設(shè)置為homo sapiens，為確保研究的可信度，置信度設(shè)置為0.9，其余參數(shù)默認設(shè)置；將網(wǎng)絡(luò)文件保存為TSV 格式，將TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)共有82 個結(jié)點和252 條邊。計算靶點相應(yīng)屬性信息，并以自由度（degree）、中介中心度（BC）、接近中心度（CC）、鄰里連通性（NC）分別大于其相應(yīng)中位數(shù)為篩選條件，進一步篩選核心靶點，最終得到癲癇寧片治療癲癇的核心靶點共10 個，分別為V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、有絲分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、腫瘤蛋白p53（TP53）、蛋白激酶B1（Akt1）、雌激素受體α（ESR1）、腫瘤壞死因子（TNF）、有絲分裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。

圖3 核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（A）及核心靶點degree 值（B）Fig.3 Interaction network (A) and degrees of key targets (B)

2.5 生物功能富集分析

2.5.1GO 富集分析 取交集基因，利用R 軟件進行GO 基因功能富集分析，共篩選出GO 條目5 195條，其中BP 相關(guān)的有4 314 條，CC 相關(guān)的334 條，MF 相關(guān)的547 條；以P＜0.05 作為標準篩選藥物治療疾病的顯著富集的生物功能主要條目30 條，見圖4。BP 主要涉及對藥物的反應(yīng)、活性氧代謝過程、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)；CC 涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、質(zhì)膜筏、小窩、突觸前膜的組成部分、突觸前膜的內(nèi)在成分、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、突觸后膜、囊泡腔等；MF 涉及碳酸鹽脫水酶活性、藥物結(jié)合、水解酶活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、碳氧裂解酶活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等。

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

2.5.2KEGG 通路富集分析 利用R 軟件進行通路富集分析，富集到259 條與藥物治療癲癇相關(guān)的通路，根據(jù)P＜0.05 篩選出藥物治療癲癇相關(guān)的通路，見圖5，分別是晚期糖基化終末化產(chǎn)物（AGE）–晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、乙型肝炎信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路、TNF 信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路。

圖5 KEGG 通路分析Fig.5 KEGG channel analysis

2.6 分子對接

分子對接結(jié)合能＜?1 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）表示具有結(jié)合活性，結(jié)合能＜?5 kcal/mol 表示結(jié)合活性較好。因此，由AutodockTools 1.5.6 軟件分子對接結(jié)果可知，拓撲學(xué)參數(shù)靠前的中藥化合物小分子毛鉤藤堿、山柰酚、狼尾草麥角堿、β-谷甾醇與PPI 核心蛋白拓撲學(xué)參數(shù)前8 位的大分子受體均具有良好的結(jié)合活性。其中毛鉤藤堿、山柰酚、狼尾草麥角堿、β-谷甾醇的結(jié)合能較低，結(jié)合活性較好，見圖6。

圖6 核心化合物與核心靶點結(jié)合示意圖（A）與分子對接結(jié)合熱能熱圖（B）Fig.6 Molecular docking diagram of key compounds to targets (A) and heatmap of binding energy (B)

3 討論

癲癇寧片由石菖蒲、鉤藤、牽牛子、千金子、甘松、薄荷腦、纈草、蜘蛛香組成，具豁痰開竅、息風(fēng)安神之功，用于風(fēng)痰上擾癲癇病控制，療效確切，應(yīng)用廣泛。其作用機制至今尚不明確。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接等手段相結(jié)合，探討其藥效成分、潛在靶點、通路機制，對臨床合理應(yīng)用及后續(xù)研究具有重要參考價值。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)毛鉤藤堿、山柰酚、狼尾草麥角堿、β-谷甾醇為癲癇寧片中的重要化學(xué)成分。其中毛鉤藤堿、狼尾草麥角堿為生物堿成分，研究報道生物堿類成分對阿爾茨海默病、帕金森病、驚厥、癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥具有治療及神經(jīng)保護作用[9]。文獻報道鉤藤提取物對癲癇模型具有神經(jīng)保護及改善作用[10]。毛鉤藤堿為鉤藤中主要生物堿成分，可能是治療癲癇藥物的重要實體，其具體機制有待進一步的研究[11]。狼尾草麥角堿為牽牛子中化學(xué)成分[12]，文獻報道牽牛子對癲癇具有一定改善作用[13]。低劑量牽牛子提取物對東莨菪堿所致小鼠記憶獲得性障礙有比較明顯的改善作用[14]，本研究推測狼尾草麥角堿可能為牽牛子抗癲癇的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)之一。黃酮類化合物具有抗氧化、神經(jīng)保護等生物學(xué)作用，多種單體展現(xiàn)出對癲癇具有改善作用[15-16]。本研究中山柰酚為廣泛存在的黃酮成分，文獻報道其通過核因子-κB（NF-κB）和STAT3 信號通路發(fā)揮缺血性腦卒中的保護作用[17-18]。此外，文獻報道其具有抗抑郁[19]、抗氧化[20]、記憶改善[21]等作用。考慮到癲癇的發(fā)作和氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)[22]，研究者推測癲癇寧片中山柰酚等黃酮類物質(zhì)可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、神經(jīng)保護等發(fā)揮其治療癲癇的作用。炎癥反應(yīng)亦在癲癇的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[23]。β-谷甾醇為草藥中廣泛存在的甾體結(jié)構(gòu)，其具有抗炎、抗氧化等多重生物學(xué)功能[24-25]。文獻報道β-谷甾醇等成分在復(fù)方中藥中可能發(fā)揮抗癲癇的治療作用[26]。本研究推測β-谷甾醇可能為癲癇寧片重要潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

活性成分–靶點網(wǎng)絡(luò)及PPI 網(wǎng)絡(luò)綜合分析的結(jié)果顯示，RelA、JUN、MAPK1、STAT3、TP53 等靶點可能是癲癇寧片治療癲癇的核心作用靶點。RELA 是NF-κB 家族重要成員，其翻譯后修飾可精準調(diào)控NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，進而通過調(diào)節(jié)炎癥、神經(jīng)及免疫應(yīng)答等介導(dǎo)疾病進展[27]。JUN 為應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）通路下游轉(zhuǎn)錄因子，具有神經(jīng)元凋亡調(diào)控作用，且參與細胞的增殖、存活、神經(jīng)元細胞再生等系列生命過程[28]。JNK 為哺乳類細胞中MAPK 信號通路的另一亞類，研究報道其為神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點[29]。JNK/c-JUN 通路在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用，阻斷該通路可能是癲癇治療的重要靶點[30]。MAPK1 為MAKP 家族的成員，可參與細胞運動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[29]。STAT3為STAT 家族成員，調(diào)控多種細胞因子和生長因子，參與炎癥、癲癇等過程[31]。Xu 等[32]發(fā)現(xiàn)STAT3 在腦損傷后星形膠質(zhì)細胞增生、分化方面有重要作用，為STAT3 參與癲癇模型星形膠質(zhì)細胞增生提供了可靠的證據(jù)。TP53 是一種抑癌基因，有研究報道TP53 與海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)，其上調(diào)促進斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞存活，保護海馬神經(jīng)元損傷[33-34]。基于以上研究，癲癇寧片核心靶點相互作用所涉及的RELA、JUN、MAPK1、STAT3、TP53 等靶點可能是癲癇寧片治療癲癇的潛在核心靶點。

GO 富集分析BP 涉及活性氧代謝過程、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)等；CC 涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等；MF 涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、碳氧裂解酶活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等；以上內(nèi)容均報道與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)聯(lián)[35-36]。KEGG 分析主要涉及AGE-RAGE 信號通路、乙型肝炎信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路、HIF-1 信號通路等；以上通路與癲癇發(fā)病機制既往研究吻合[37]，可能為癲癇寧片治療癲癇疾病的潛在通路。AGE-RAGE 通路與NF-κB 激活有關(guān)，可影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而產(chǎn)生促炎性細胞因子和炎癥，進而與癲癇發(fā)生發(fā)展有關(guān)[38]。IL-17 在藥物難治性顳葉外側(cè)型癲癇病灶中高表達和分布，為癲癇發(fā)生發(fā)展中可能的作用信號通路[39]。TNF 信號通路與自身免疫密切相關(guān)，調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和炎性細胞因子對大腦的影響，在癲癇發(fā)生中起重要作用[40]。血清低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達與卒中后繼發(fā)性癲癇的關(guān)聯(lián)密切，血清HIF-1α 可能預(yù)測卒中繼發(fā)癲癇的風(fēng)險[38]。基于以上報道，癲癇寧片網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究所揭示的信號通路可能為本制劑在癲癇治療作用中的潛在作用機制。

研究進一步通過分子對接技術(shù)手段對核心靶點與核心配體的分子親和力進行補充驗證。分子對接結(jié)果表明毛鉤藤堿、山柰酚、狼尾草麥角堿、β-谷甾醇配體等與核心靶蛋白JUN、RELA、MAPK3、TP53、STAT3 等具有很強的結(jié)合活性，提示癲癇寧片可能是通過以上成分調(diào)節(jié)核心靶點進而發(fā)揮其治療癲癇的藥理作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對癲癇寧片治療癲癇作用機制進行挖掘并分析，結(jié)果表明，癲癇寧的活性成分毛鉤藤堿、山柰酚、狼尾草麥角堿、β-谷甾醇等可通過RELA、JUN、MAPK1、STAT3、TP53 等靶蛋白介導(dǎo)AGE-RAGE 信號通路、乙型肝炎信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路發(fā)揮抗癲癇作用。本研究闡明了癲癇寧片干預(yù)調(diào)控治療癲癇的分子機制，既體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路的療效方式，也驗證了中醫(yī)學(xué)的整體醫(yī)學(xué)觀，為后期的臨床及研究提供了理論支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突