夏慕超 梁 超 繆長虹

丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥,多用于兒童麻醉的誘導(dǎo)和維持,其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)間的相互作用機(jī)制,主要為γ-氨基丁酸(GABA)的相關(guān)分子機(jī)制。盡管,美國FDA早在1989年即批準(zhǔn)丙泊酚在臨床使用,但其說明的適用范圍中仍不包含3歲以下兒童的麻醉誘導(dǎo)。目前,針對全身麻醉藥物的動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆顯示,該類麻醉藥物可引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良事件,包括廣泛的神經(jīng)元凋亡、長期的學(xué)習(xí)記憶障礙和行為異常等。丙泊酚是否并如何引起發(fā)育中大腦的神經(jīng)毒性作用尚不明確,這亦是當(dāng)前麻醉學(xué)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。明確丙泊酚對發(fā)育大腦的影響,對今后兒童合理麻醉用藥的研究和方案的制訂具有重要意義。本文總結(jié)將現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的丙泊酚致發(fā)育神經(jīng)毒性的相關(guān)分子機(jī)制,并形成綜述。

1 突觸生長期GABA受體可影響神經(jīng)元發(fā)育成熟

突觸是神經(jīng)元連接的關(guān)鍵,哺乳動(dòng)物的大腦在出生后最重要的一個(gè)階段是經(jīng)歷腦突觸生長期(即突觸發(fā)生)。在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)(出生后20～21 d),發(fā)育中的人類大腦的重量即可達(dá)到成人腦重量的90%～95%。突觸生長期包含了許多關(guān)鍵的發(fā)育環(huán)節(jié),如神經(jīng)元遷移、突觸形成、血腦屏障建立和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的成熟等[1]。哺乳動(dòng)物的神經(jīng)元在出生后首先大量增殖樹突的分支并互相接觸,以增加突觸密度;隨后,在神經(jīng)活動(dòng)下選擇性地修剪多余突觸;在正常的突觸形成過程中,無法形成突觸接觸的神經(jīng)元將經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡;這種在突觸形成和細(xì)化期間發(fā)生的突觸選擇性消除稱為突觸修飾[2]。大腦發(fā)育中的這種突觸特性被認(rèn)為是突觸可塑性的生物基礎(chǔ)及皮層放電環(huán)路形成的基本過程。依賴于神經(jīng)活動(dòng)的突觸可塑性對于皮層回路的細(xì)致發(fā)育分化至關(guān)重要,而麻醉和睡眠會(huì)抑制突觸前和突觸后的尖峰活動(dòng),從而影響突觸穩(wěn)定性[3]。

在神經(jīng)元的發(fā)育成熟、遷移分化和突觸形成過程中,興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)參與了上述所有的調(diào)控。在成熟的大腦中,最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)是GABA,而在早期發(fā)育階段,由于細(xì)胞內(nèi)的氯離子(Cl-)濃度較高,GABA受體是興奮性的,不成熟的鈉離子/鉀離子/2氯離子(Na+/K+/2Cl-)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Na-K-Cl cotransporter 1, NKCC1)產(chǎn)生Cl-內(nèi)流,導(dǎo)致未成熟神經(jīng)元的去極化。在發(fā)育過程中,GABA不會(huì)一直保持興奮性,一旦成熟的Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白K+-Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型2(potassium-chloride cotransporter 2, KCC2)表達(dá),此時(shí)GABA受體就會(huì)將Cl-主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)出神經(jīng)細(xì)胞,成熟大腦細(xì)胞內(nèi)的Cl-濃度降低,GABA受體從興奮性作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种菩宰饔肹4]。GABA受體的這種電生理性質(zhì)的轉(zhuǎn)換與神經(jīng)元的成熟偶聯(lián)。人類幼兒的這種轉(zhuǎn)換從足月出生后約15周開始,至1周歲左右完成。生長因子是另一種與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的重要因素,例如神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)[5]。這些因素皆調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、軸突和樹突的生成,以及神經(jīng)元細(xì)胞的存活。

2 丙泊酚致發(fā)育神經(jīng)毒性的相關(guān)分子機(jī)制

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)增殖障礙 NSC在神經(jīng)發(fā)生過程中至關(guān)重要,其源于胚胎時(shí)期的神經(jīng)組織,具有很強(qiáng)的自我更新及分化潛能,可分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各類細(xì)胞。研究[6]結(jié)果表明,丙泊酚通過對NSC的作用影響神經(jīng)發(fā)生。核糖核酸(RNA)測序分析結(jié)果顯示,丙泊酚干預(yù)可導(dǎo)致一系列鈣依賴性基因表達(dá)的下調(diào),同時(shí)丙泊酚可顯著降低鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)的水平,表明CaMKⅡ/AMPK/ATF5信號(hào)通路可能參與了丙泊酚對NSC的抑制作用。有學(xué)者在大鼠妊娠第14天提取其胎兒中的NSC,加入麻醉劑量的丙泊酚共培養(yǎng)24 h后,組蛋白相關(guān)DNA片段的ELISA結(jié)果顯示,丙泊酚可引起NSC的DNA氧化損傷,使細(xì)胞停止增殖并抑制其線粒體活性,足量的抗氧化劑可在一定程度上緩解這種氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。該研究結(jié)果提示,丙泊酚的毒性作用可直接作用于胚胎發(fā)育階段,氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是丙泊酚毒性作用的潛在機(jī)制。在超臨床麻醉劑量的條件下,丙泊酚劑量依賴性地增加了神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cell,NPC)乳酸脫氫酶的釋放,丙泊酚誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶釋放不會(huì)被GABA A型受體阻斷劑或鈣內(nèi)流抑制,也不受半胱氨酸蛋白酶(caspase)3或7的影響。但使用化合物配體對GABA A型受體的直接激活不會(huì)增加NPC的乳酸脫氫酶釋放,同時(shí)以上現(xiàn)象亦未在低濃度的丙泊酚作用下被觀察到[8]。在人類NSC衍生模型中,長期接觸丙泊酚會(huì)導(dǎo)致TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加,以及β-微管蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少,表明丙泊酚可誘導(dǎo)NSC的凋亡[9]。臨床麻醉劑量的丙泊酚可能對發(fā)育大腦中處于不同分化階段的細(xì)胞產(chǎn)生多種影響。由此可見,未來的研究需關(guān)注丙泊酚對不同的腦細(xì)胞類型和不同的大腦區(qū)域的麻醉效應(yīng)。

2.2 樹突發(fā)育障礙 樹突是形成突觸連接的重要結(jié)構(gòu)。信息依賴性的大腦活動(dòng)可促進(jìn)神經(jīng)環(huán)路的形成,而外界信息減少或神經(jīng)元損傷可干擾神經(jīng)環(huán)路的穩(wěn)定,這種可塑性存在于樹突棘(即形成突觸的主要部位)中。丙泊酚可通過破壞細(xì)胞完整性或突觸連接性進(jìn)而影響大腦正常的功能性連接[10]。有學(xué)者通過高爾基染色觀察到產(chǎn)前暴露于丙泊酚的大鼠腦中海馬的阿蒙角1區(qū)(cornu Ammonis 1,CA1)和阿蒙角3區(qū)(cornu Ammonis 3,CA3)處的錐體神經(jīng)元的樹突分支較少,且長度明顯短于對照組[11]。這一結(jié)果與2011年Briner等[12]的研究結(jié)果一致,該研究發(fā)現(xiàn)麻醉劑在大腦發(fā)育過程中可顯著影響樹突棘(即突觸)的形成。Briner等對Wistar大鼠在出生后早期的特定發(fā)育階段予以丙泊酚麻醉,將丙泊酚注射到內(nèi)側(cè)前額葉皮層的第5層錐體神經(jīng)元后,應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察并評(píng)估丙泊酚對神經(jīng)元突觸發(fā)育的短期和長期影響。出生后第5、10天接觸丙泊酚的幼鼠樹突棘密度顯著降低,而在其出生后第15、20或30天給藥時(shí),丙泊酚的干預(yù)卻可顯著增高幼鼠樹突棘密度,并伴隨著突觸數(shù)量的增多。重要的是,丙泊酚誘導(dǎo)的樹突棘密度的改變會(huì)一直持續(xù)至幼鼠出生后的第90天。該研究結(jié)果表明,丙泊酚麻醉可迅速引起幼鼠樹突棘密度的變化,這種作用與幼鼠的發(fā)育階段密切相關(guān),持續(xù)至其成年期,并伴有突觸數(shù)量的改變;提示產(chǎn)后早期的麻醉干預(yù)可能會(huì)永久性地?fù)p害發(fā)育大腦神經(jīng)回路的形成。Wan等[13]應(yīng)用電生理測量長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)評(píng)估出生后60 d大鼠的海馬突觸功能,并加入莫里斯水迷宮(MWM)實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別測試(NORT)和物體定位測試(OLT)評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力;結(jié)果表明,丙泊酚麻醉后,除大鼠海馬神經(jīng)元的樹突分支數(shù)顯著減少、總樹突長度顯著延長和樹突棘密度顯著降低外,反復(fù)接觸丙泊酚可顯著延長大鼠逃逸潛伏期,縮短其在目標(biāo)象限內(nèi)停留的時(shí)間并減少跨平臺(tái)次數(shù)。這些數(shù)據(jù)提示新生兒期反復(fù)接觸丙泊酚可顯著縮短大鼠對新環(huán)境物體或位置的調(diào)查時(shí)間,反映了丙泊酚會(huì)損害大鼠海馬的突觸可塑性和成年后的識(shí)別功能。

2.3 神經(jīng)炎癥 關(guān)于丙泊酚暴露后神經(jīng)炎癥的相關(guān)研究的結(jié)果存在一定差異。有研究[14]對出生后第10天或第20天時(shí)的大鼠進(jìn)行6 h的丙泊酚麻醉,出生第10天組的大鼠前額葉皮層中TNF的mRNA表達(dá)水平短暫地增高了1.8倍左右,并且該組中兩種趨化因子(CCL2和CCL3)的mRNA表達(dá)水平也短暫增高;而大鼠海馬中的TNF水平無顯著變化。出生第20天組的大鼠TNF的mRNA表達(dá)水平無變化;同時(shí),兩組大鼠IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平均未產(chǎn)生顯著的變化。采用丙泊酚麻醉不足以對大腦突觸生長期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥因子表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。因此,上述研究和部分研究結(jié)果并不支持神經(jīng)炎癥通路參與丙泊酚相關(guān)神經(jīng)毒性作用的觀點(diǎn)。Han等[15]研究結(jié)果表明,重復(fù)使用低劑量丙泊酚5 d未對小鼠認(rèn)知功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生顯著影響,而重復(fù)使用中、高劑量丙泊酚可顯著增高凋亡因子(caspase-3和Bax)及炎癥因子(IL-1β、IL-6 和 TNF-α)的表達(dá)水平,并損害小鼠的認(rèn)知功能。此外,也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以劑量依賴性地降低小鼠海馬HT-22細(xì)胞的增殖能力并增加細(xì)胞凋亡。丙泊酚處理的HT-22細(xì)胞中鈣通道電壓依賴型L型α1S亞基(Cav-1)表達(dá)增加,Cav-1促進(jìn)小GTP酶(rat sarcoma, Ras)/成纖維細(xì)胞生長因子受體激酶(fibroblast growth factor receptor kinase, Raf)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK),即Ras/Raf/ERK通路的激活,這是參與細(xì)胞增殖和凋亡的重要通路[16]。當(dāng)前,丙泊酚神經(jīng)毒性與神經(jīng)炎癥之間的相關(guān)性尚未得到完全證實(shí),且相當(dāng)一部分研究認(rèn)為丙泊酚對神經(jīng)系統(tǒng)存在一定的抗炎作用。因此,這方面的結(jié)論及其機(jī)制需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

2.4 線粒體裂變 線粒體維持著細(xì)胞的許多重要功能,包括能量生成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等。不平衡的線粒體融合和裂變會(huì)導(dǎo)致包括神經(jīng)變性在內(nèi)的各種病理狀態(tài)。近年來,學(xué)者開始關(guān)注線粒體動(dòng)力學(xué)在丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用。動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)是線粒體裂變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。有學(xué)者評(píng)估了人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell, hESC)衍生神經(jīng)元暴露于丙泊酚后的線粒體動(dòng)力學(xué)的變化,以及這些變化在丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用。hESC衍生的神經(jīng)元暴露于20 μg/mL丙泊酚6 h會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞死亡、線粒體裂變增加和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)提前開放,以及線粒體膜電位降低。此外,丙泊酚還改變了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)和Drp1的表達(dá),但未顯著改變線粒體融合相關(guān)蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果提示,丙泊酚可通過CDK1/Drp1誘導(dǎo)線粒體裂變和mPTP開放影響下神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[17]。Liang等[18]研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚可誘導(dǎo)NSC線粒體變形、空泡化和腫脹,并通過PTEN誘導(dǎo)的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)介導(dǎo)的線粒體途徑調(diào)節(jié)NSC的增殖、分化和凋亡。而高劑量的丙泊酚(100～200 μmol/L)會(huì)明顯增強(qiáng)神經(jīng)元的線粒體裂變,降低細(xì)胞存活率[19];這提示丙泊酚對線粒體的影響具有一定的劑量依賴性。Iqbal等[20]使用P110肽[一種無毒的、7個(gè)氨基酸長的Drp1/線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1, Fis1)的選擇性抑制劑]不僅可減輕麻醉劑誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,還可減輕皮層細(xì)胞因地呋喃、丙泊酚和氯胺酮誘導(dǎo)的線粒體斷裂產(chǎn)生的損傷,這也是第1項(xiàng)關(guān)于Fis1受體介導(dǎo)的裂變與麻醉藥物引起的畸變相關(guān)聯(lián)的研究。這與Zhao等[21]的研究結(jié)果一致,其應(yīng)用免疫熒光檢測方法發(fā)現(xiàn),在脊髓損傷期間丙泊酚可以顯著抑制Drp1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體。因此,丙泊酚可通過降低Drp1和Fis1的水平抑制Drp1與線粒體的共定位。這也從側(cè)面提示,丙泊酚可通過線粒體能量代謝途徑誘導(dǎo)神經(jīng)損傷。

2.5 微核糖核酸(microRNA) microRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA,通過負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程,包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等。目前,已鑒定出數(shù)百種在大腦富集的microRNA,部分microRNA與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。研究[22]結(jié)果表明,丙泊酚麻醉處理小鼠后,其腦組織中microRNA34a表達(dá)增高,microRNA34a抑制劑改善了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因丙泊酚麻醉所致的神經(jīng)損傷誘發(fā)的學(xué)習(xí)和記憶功能減退,并抑制了海馬的細(xì)胞凋亡。經(jīng)丙泊酚處理的大鼠海馬神經(jīng)元中microRNA215的表達(dá)水平顯著減低。應(yīng)用microRNA215類似物可增強(qiáng)丙泊酚處理的新生大鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活性并抑制細(xì)胞凋亡[23]。Jiang等[24]則發(fā)現(xiàn)丙泊酚抑制NSC的增殖、神經(jīng)元分化和遷移,同時(shí)上調(diào)microRNA141-3p表達(dá);沉默microRNA141-3p可消除丙泊酚抑制NSC神經(jīng)增殖、神經(jīng)元分化和遷移的影響;而microRNA141-3p的直接靶向調(diào)控胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2, IGF2BP2)的過表達(dá),削弱了丙泊酚和microRNA141-3p對NSC神經(jīng)發(fā)生的影響;提示丙泊酚通過microRNA141-3p/IGF2BP2軸抑制NSC的神經(jīng)發(fā)生。上述研究結(jié)果表明,microRNA相關(guān)機(jī)制參與了丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,從而引起模型動(dòng)物認(rèn)知功能下降和記憶障礙。然而,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果在細(xì)胞水平仍存在諸多差異。故microRNA可作為認(rèn)知障礙或神經(jīng)系統(tǒng)毒性的潛在生物標(biāo)志物。未來基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的整合有助于研究者進(jìn)一步了解microRNA對特定基因靶標(biāo)的調(diào)控機(jī)制。

2.6 神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)失調(diào) 神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是一類在大腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用的分泌蛋白家族,通常在神經(jīng)末梢以受體介導(dǎo)入細(xì)胞的方式進(jìn)入神經(jīng)末梢,再經(jīng)逆向軸漿運(yùn)輸?shù)诌_(dá)細(xì)胞體,促進(jìn)細(xì)胞體合成有關(guān)的蛋白質(zhì)從而支持神經(jīng)元的生長發(fā)育,調(diào)節(jié)突觸的可塑性等。BDNF在突觸小泡內(nèi)以前體腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(pro-BDNF)的形式儲(chǔ)存,并在突觸間隙中被蛋白質(zhì)水解為成熟的BDNF。BDNF在大腦中高水平表達(dá),其轉(zhuǎn)錄、加工和分泌都受突觸活動(dòng)的調(diào)節(jié)。pro-BDNF可與p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)結(jié)合并激活RhoA,后者在細(xì)胞凋亡前調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聚合作用[25]。在腦損傷時(shí),p75NTR表達(dá)水平增高,這與促凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。丙泊酚對p75NTR的超誘導(dǎo)作用和伴隨的神經(jīng)營養(yǎng)因子加工抑制可進(jìn)一步加劇p75NTR介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[26]。研究[27]顯示,丙泊酚麻醉后的大鼠會(huì)表現(xiàn)出長期的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙,海馬中蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)、環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)(cAMP response element-binding protein, CREB)和BDNF的蛋白質(zhì)表達(dá)長期下調(diào)。這種早期的丙泊酚暴露可導(dǎo)致成年后的長期學(xué)習(xí)和記憶障礙,其機(jī)制與PKA-CREB-BDNF信號(hào)通路的抑制相關(guān)。

3 總結(jié)與展望

綜上所述,丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用涉及一系列復(fù)雜的分子效應(yīng)機(jī)制。但在大腦發(fā)育關(guān)鍵期,丙泊酚所致毒性作用的主要機(jī)制及其與各種分子機(jī)制之間的因果關(guān)系尚不明確。迄今為止,尚無令人信服的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明丙泊酚在幼年期大腦引起的毒性效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致長期的認(rèn)知行為障礙,因此丙泊酚應(yīng)用于兒童是否安全可靠,仍有待進(jìn)一步研究。目前來說,尋找合適的模型將動(dòng)物行為學(xué)研究結(jié)果與臨床應(yīng)用相聯(lián)系,也是未來探索丙泊酚毒性作用與劑量效應(yīng)關(guān)系的重要方向。故在找到更多確切的證據(jù)前,不建議輕易更改兒童麻醉用藥的臨床管理方案。