陳宇彬，林潔，蔡媛媛，程亞偉，李冠慧，蔡敏

1.廣州中醫(yī)藥大學附屬海南中醫(yī)院，海南 ?？?570203；2.海南省中醫(yī)院，海南 ?？?570203

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指肝臟細胞外基質(zhì)的彌漫性過度沉積，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的關(guān)鍵階段，對慢性肝病的預后起著決定性作用[1-2]。慢性肝病包括肝炎病毒、代謝和遺傳、膽汁淤積、免疫異常、乙醇、藥物與毒物、寄生蟲等病因所致的病程超過半年的各種肝病[3]。HF病情持續(xù)進展可引起肝硬化、肝衰竭、肝性腦病等嚴重并發(fā)癥，威脅患者健康和生命。

肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是HF形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]，HSC 的激活是由大量的炎性細胞因子和生長因子介導的，其中，轉(zhuǎn)運生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是肝損傷、炎癥、肝再生、肝纖維化和肝細胞癌的中樞調(diào)節(jié)因子[5]。在HF過程中，TGF-β能夠促進肝祖細胞的形態(tài)學改變和遷移，而進一步進行信號通路分析發(fā)現(xiàn)，此過程涉及多種信號通路[6]。HSC激活并增殖，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)，因此抑制HSC的激活和增殖是預防和治療HF的重要方法，對相關(guān)靶蛋白和信號通路進行深入研究是HF新藥研發(fā)工作的重點。

目前，臨床上尚無特異有效的抗HF的治療方案，HF目前最重要的是病因治療，但療效仍存在一定的局限性。由于HF 病理機制復雜，針對單一靶標的藥物研發(fā)很難在臨床上奏效，中藥復方具有多成分、多靶點、不良反應少等優(yōu)點，中醫(yī)藥近年來已成為防治HF的研究熱點，廣泛開展的實驗研究與應用實踐證實了其在HF防治領(lǐng)域中醫(yī)的特色優(yōu)勢與突出療效[7]。

海南省名中醫(yī)蔡敏教授基于“初病濕熱在經(jīng)”提出以清熱利濕為法，治療HF初期濕熱階段，將治療關(guān)口前移，以提前干預HF 的持續(xù)發(fā)展過程和不良結(jié)局[8]。因此，蔡敏教授根據(jù)數(shù)十載臨證及用藥經(jīng)驗創(chuàng)制了治療本病的經(jīng)驗方：解毒通利方。本方源自《傷寒論》清熱利濕退黃經(jīng)典方劑茵陳蒿湯，諸藥加減兼顧清熱解毒、調(diào)氣行血、健脾扶正。此外，方中運用了多種海南特色南藥、黎藥，使本方具有一定的地域特色與民族特色，如地耳草，又名田基黃，黎醫(yī)用于治療黃疸，體現(xiàn)了黎醫(yī)“以黃治黃”的用藥特點[9]。解毒通利方臨證中屢獲良效，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法探討解毒通利方治療HF 可能的作用機制，并通過分子對接技術(shù)在計算機層面模擬驗證，旨在為將來進一步開展解毒通利方治療HF的藥效學機制體內(nèi)外實驗研究提供初步科學假說與依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 獲取解毒通利方的活性化合物及有效活性成分靶點 以茵陳、大黃、梔子、雞骨草、地耳草、鳳尾草、白花蛇舌草、丹參、葉下珠、雞內(nèi)金、神曲、甘草分別作為關(guān)鍵詞,在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、HERB 數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)中進行化合物成分檢索，設置口服生物利用度(OB)過濾條件≥30%，類藥性(DL)過濾條件≥0.18。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫將上述活性化合物進行成分靶點檢索。運用UniProt 數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)下載人類靶蛋白，最后，使用處理文本文件的Perl語言對篩選出的活性成分的靶點信息與之匹配和規(guī)范。

1.2 檢索HF 的疾病靶點 在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、藥物遺傳學和藥物基因組織學數(shù)據(jù)庫(PharmGkb，https://www.pharmgkb.org/)、藥物靶點數(shù)據(jù)庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，https://omim.org/)、Drugbank 數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)中檢索關(guān)鍵詞“Hepatic fibrosis”、“Liver fibrosis”以獲得HF的疾病相關(guān)靶點。

1.3 確定解毒通利方治療HF的作用靶點 將篩選出的解毒通利方有效活性成分靶點數(shù)據(jù)與HF疾病靶點數(shù)據(jù)使用R 語言4.1.2 程序取交集，并繪制韋恩圖。從而確定解毒通利方治療HF的作用靶點。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建與關(guān)鍵靶點 將解毒通利方有效活性成分與HF 疾病交集靶點數(shù)據(jù)，即1.3中得到的結(jié)果上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)進行PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建，物種參數(shù)選定為“Homosapines”，自定義可信度＞0.95 和隱藏游離點，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡。將PPI 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.0中，應用“CytoNCA”插件篩選核心靶點，通過打分對節(jié)點賦值，選中分值高的節(jié)點構(gòu)建新的網(wǎng)絡，重復進行以上“打分—選中—構(gòu)建”這一過程以獲得核心靶點。

1.5 “中藥—關(guān)鍵化合物—核心靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建 將1.4中獲得的核心靶點名稱和其對應的關(guān)鍵化學成分整理成表格文件，導入Cytoscape 3.8.0軟件中，并構(gòu)建“中藥—關(guān)鍵化合物—核心靶點”網(wǎng)絡。應用“Networkanalyzer”插件獲得節(jié)點的度值。通?？磥?，節(jié)點度值高，將被視作有意義的活性化合物或作用靶點，能夠在自身所處的生物網(wǎng)絡中發(fā)揮樞紐性的作用[10]。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 基于R 語言4.1.2 程序Bioconductor、Pathview 等數(shù)據(jù)包，設定P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，對交集靶點數(shù)據(jù)進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，選取GO 富集分析前10 名BP、CC、MF 結(jié)果和KEGG 通路富集分析前10 名結(jié)果進行可視化。

1.7 分子對接模擬驗證 首先，從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載所選擇的活性化合物即小分子配體的2D 結(jié)構(gòu)，并使用Chem Office 軟件轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)，運行energyminimize 后保存。第二，通過PDB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)下載大分子蛋白受體的3D結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件對蛋白受體和化合物配體進行去除水分子等操作。第三，利用Auto Dock Tools 軟件對受體進行加氫，確定配體與受體結(jié)合的活性口袋[11]。最后，運用Auto Dock vina 軟件將兩者進行對接，計算配體和受體結(jié)合的最低結(jié)合效能，據(jù)此進行排序，并在Pymol軟件中對分子對接結(jié)果進行展示。

2 結(jié)果

2.1 解毒通利方活性化合物與有效活性成分靶點 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和HERB數(shù)據(jù)庫，篩選出活性化合物172種，其中茵陳10種、大黃4種、山梔子6種、雞骨草1種、地耳草2種、葉下珠1種、白花蛇舌草1種、雞內(nèi)金1 種、神曲1 種、丹參54 種、甘草81 種。運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫預測獲得的活性化合物靶點信息，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫、Perl語言對應與規(guī)范靶點基因名匯總刪重后，共預測靶點4 068 個，其中茵陳306 個、大黃27個、山梔子276個、雞骨草59個、地耳草248個、葉下珠271個、白花蛇舌草190個、雞內(nèi)金4個、神曲204個、丹參799個、甘草1 494個。

2.2 HF的疾病靶點 在Gencards數(shù)據(jù)庫里檢索獲得到HF 疾病相關(guān)基因4 855 條，PharmGkb 數(shù)據(jù)庫獲得31個基因，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得63個基因，TTD數(shù)據(jù)庫獲得21個基因，Drugbank數(shù)據(jù)庫獲得13個基因，將以上5 個數(shù)據(jù)庫檢索獲得的基因數(shù)據(jù)整合去重，共獲得HF疾病相關(guān)基因4 877個，見圖1。

圖1 HF疾病靶點提取Figure 1 Extraction of HF disease targets

2.3 解毒通利方治療HF的核心靶點 將篩選出的解毒通利方的有效活性成分靶點數(shù)據(jù)與HF疾病靶點數(shù)據(jù)使用R 語言4.1.2 程序(bioconductor 等數(shù)據(jù)包)取交集，獲得解毒通利方治療HF 的核心靶點199 個，并繪制韋恩圖，見圖2。

圖2 HF與解毒通利方交集靶點的韋恩圖Figure 2 Wayne diagram of the intersecting target of HF and Jiedu Tongli Decoction

2.4 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建與關(guān)鍵靶點 如圖3 所示，PPI網(wǎng)絡中共有156個節(jié)點，1 088條邊。應用“CytoNCA”插件篩選核心蛋白，通過打分對節(jié)點賦值，選中分值高的節(jié)點構(gòu)建新的網(wǎng)絡，重復進行以上“打分—選中—構(gòu)建”這一過程，篩選出19 個核心蛋白，分別為CDKN1A、IL6、MAPK14、AKT1、HSP90AA1、TNF、ESR1、MAPK3、STAT1、RELA、RB1、MYC、FOS、STAT3、MDM2、MAPK1、HIF1A、TP53、CCND1，見圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建Figure 3 PPI network construction

圖4 解毒通利方與HF交集靶點的PPI網(wǎng)絡Figure 4 PPI network of intersecting targets of Jiedu Tongli Decoction and HF

2.5 “中藥—關(guān)鍵化合物—核心靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建“中藥—關(guān)鍵化合物—核心靶點”網(wǎng)絡共由156個節(jié)點和304 條邊組成(圖5)。網(wǎng)絡中的邊表示相互作用，“中藥—關(guān)鍵化合物—核心靶點”網(wǎng)絡圖展示了關(guān)鍵化合物與核心靶點兩者之間并非一一對應的關(guān)系。一個化合物可以同時作用于多個靶點發(fā)揮活性作用，反過來說，一個靶點可以同時受多個化合物調(diào)節(jié)產(chǎn)生不同影響[10]，這種相互的、復雜的、多元的作用模式反映了中藥多成分、多靶點、多途徑的作用潛能與優(yōu)勢。根據(jù)網(wǎng)絡的節(jié)點度值參數(shù)排序，排名前5 的化合物分別為甘草查爾酮(licochalcone a，MOL000497)、柚皮素(naringenin，MOL004328)、異鼠李素(isorhamnetin，MOL000354)、去甲氧基茵陳色原酮(demethoxycapillarisin，MOL008046)、5-hydroxy-7-methoxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)chromone(MOL003095)，從靶點來看，排名前5的分別是HSP90AA1、ESR1、MAPK14、RELA和MAPK1。

2.6 GO富集 GO富集分析共得到2 612條生物過程(BP)相關(guān)條目、234 條分子功能(MF)相關(guān)條目、89條細胞組分(CC)相關(guān)條目。基于R 4.1.2程序，根據(jù)參與的分子數(shù)量，對前10 位的BP、CC、MF 進行可視化，以條形圖展示(圖6)。生物過程主要涉及氧化應激、化學應激、氧水平感知等。分子功能主要涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性和細胞因子受體結(jié)合等。細胞組分主要涉及膜閥、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合物、蛋白激酶復合物等。

圖6 GO注釋分析的前10名BP、CC和MF結(jié)果Figure 6 Top 10 BP,CC,and MF results in GO analysis

2.7 KEGG通路富集 通過KEGG富集結(jié)果篩選出181條通路(P＜0.05)，提示解毒通利方可能通過調(diào)控多條通路起到治療HF 的作用。根據(jù)P值篩選KEGG結(jié)果前30名通路使用R 4.1.2程序進行可視化，繪制氣泡圖(圖7)。通路富集以病毒感染、炎癥反應、細胞凋亡、脂質(zhì)代謝、腫瘤等相關(guān)的信號通路為主，具體涉及PI3K/AKT信號通路、白細胞介素17(IL17)信號通路、T輔助細胞17(Th17)細胞分化、乙型肝炎、丙型肝炎、腫瘤壞死因子信號通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、流體切應力與動脈粥祥硬化、愛潑斯坦—巴爾病毒感染、癌癥中的蛋白多糖、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗等通路。進一步利用R語言4.1.2程序基于Pathview數(shù)據(jù)包提取信息，繪制與HF疾病的通路圖。從通路圖中可以看出AKT、STAT3 等在HF 發(fā)病過程中起到重要作用，HF的靶點是多路徑協(xié)調(diào)控制的(圖8)。

圖7 前30名KEGG通路富集圖Figure 7 Top 30 pathways in KEGG pathway enrichment analysis

圖8 靶點在HF疾病中的通路圖Figure 8 Pathway map of targets in HF disease

2.8 分子對接驗證 基于以上結(jié)果，AKT1 和STAT3 為PPI 網(wǎng)絡核心中的關(guān)鍵蛋白，甘草查爾酮(licochalcone a，MOL000497)、柚皮素(naringenin，MOL004328)均為網(wǎng)絡中排名前5 位的化合物，即關(guān)鍵有效活性成分。故選擇AKT1 和柚皮素、STAT3 和甘草查爾酮分別作為大分子蛋白受體和小分子化合物配體，進行分子對接。使用Autodockvina 進行分子對接，結(jié)果顯示AKT1 和柚皮素的結(jié)合自由能為-6.0 kJ/mol(圖9)，STAT3 和甘草查爾酮的結(jié)合自由能為-6.8 kJ/mol (圖10)，說明關(guān)鍵化合物與核心蛋白的結(jié)合構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

圖9 甘草查爾酮與AKT1分子對接Figure 9 Docking of licorice chalcone with AKT1 molecule

圖10 柚皮素與STAT3分子對接Figure 10 Docking of Naringenin with STAT3 molecules

3 討論

HF屬于中醫(yī)學“肝積”、“積聚”、“脅痛”、“黃疸”等范疇，中醫(yī)學認為本病是由感染疫毒或外感濕熱，邪毒羈留不去，以致氣血津液搏結(jié)，肝絡瘀阻，而發(fā)為本病。由于濕邪其性黏滯，與熱邪相合則出現(xiàn)濕熱膠著難解、肝病纏綿難愈之象，日久正氣為之所傷，逐漸由實而虛、由表及里，由氣入血形成“濕、熱、毒、瘀、虛”互結(jié)的復雜局面。治療上，不同醫(yī)家各有側(cè)重，但大多從瘀、虛論治。由于HF 往往存在病情持續(xù)進展的不良病程和結(jié)局，蔡敏教授從中醫(yī)治未病“既病防變”的理念出發(fā)，認為提前干預與及時治療更為重要。根據(jù)葉天士《臨證指南醫(yī)案》“初病濕熱在經(jīng)，久則瘀熱入絡”的理論，蔡敏教授認為濕熱邪氣導致肝臟炎癥反應，是肝纖維化的始動因素[8]。在我國，特別是外感濕熱之邪而致的慢性乙型病毒性肝炎，肥人脾虛、痰濕內(nèi)生、日久蘊熱為核心病機的非酒精性脂肪肝，均為常見慢性肝病的主要原因。濕熱日久，化瘀化熱，入里入絡，慢性肝炎活動的過程即HF 不斷發(fā)展的過程[12]。因此，蔡敏教授創(chuàng)造性地提出以清熱利濕為法治療本病，并總結(jié)出經(jīng)驗方—解毒通利方。方中茵陳為君藥，清熱利濕，解毒退黃；大黃為臣藥，既入氣分，又入血分，可瀉下攻積，清熱解毒，利膽保肝，使?jié)駸釓拇蟊愣觯送?，功兼活血行瘀；山桅子有清熱涼血之功，不僅可入胃蕩滌熱邪下行，還配伍茵陳走表利便，以助消解瘀熱，與大黃共為臣藥。蔡敏教授善用南藥、黎藥，在方中運用了雞骨草、田基黃、鳳尾草、葉下珠、白花蛇舌草等藥物，增強清熱利濕解毒之力，“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”，故方中酌加神曲、雞內(nèi)金以健運脾胃，先安未受邪之地，丹參化瘀涼血，甘草調(diào)和諸藥，全方清熱利濕、化瘀解毒、通利二便及血脈。

研究發(fā)現(xiàn)，解毒通利方中含有甘草查爾酮、柚皮素、異鼠李素、去甲氧基茵陳色原酮等活性成分對應的作用靶點較多，或在治療HF 中發(fā)揮重要作用。柚皮素可通過抑制氧化應激、炎癥等相關(guān)通路，如TGF-β/Smad3、JNK/Smad3 信號通路實現(xiàn)抗肝纖維化的效果[13]。動物研究還證實，柚皮素可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與細胞凋亡減輕四氯化碳誘導的大鼠肝細胞損傷從而緩解HF[14]。異鼠李素可通過下調(diào)p38MAPK 信號通路、TGF-β/Smads 信號通路、TLR 信號通路減輕氧化應激、抑制細胞外基質(zhì)生成等以減少膠原合成，進而改善HF[15-17]。

在PPI網(wǎng)絡中，IL-6、AKT1、ESR1、MAPK3、STAT1、RELA、MYC、FOS、STAT3、MAPK1、CCND1等19個靶點為解毒通利方治療肝纖維化的核心蛋白。AKTl是PI3K的下游信號蛋白，參與調(diào)節(jié)HSC的活化、增殖、分化和凋亡等過程[18]。此外，TGF-β能夠促進肝祖細胞的形態(tài)學改變和遷移，PI3K/AKT 信號為高富集信號通路[6]。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)可受Janus激活激酶2(JAK2)表達和活性增加而促進其生成，進而誘導IL-6及TGF-β1表達[19]，其中，IL-6能介導肝損傷的急性期反應[15]，還可以通過MAPK、JAK2/STAT3通路直接誘導HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞，導致細胞外基質(zhì)沉積[20]，促進肝纖維化。肝細胞中的MYC基因過度表達可促進HSC的活化[21]；肝實質(zhì)細胞屬于靜止期細胞，在肝發(fā)育和再生過程中，RELA參與了關(guān)鍵的生物化學過程，RELA 缺乏會導致小鼠肝細胞變性和胚胎發(fā)育停止[22]。CCND1 可調(diào)控細胞增殖、DNA 修復及細胞遷移等[23]。

GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，解毒通利方治療HF作用的靶點主要體現(xiàn)在氧化應激、細胞凋亡、炎癥、病毒感染、脂質(zhì)代謝等生物學過程及調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路、TNF 信號通路、肝炎病毒感染、Th17 細胞分化、HIF-1 信號通路、腫瘤信號通路等方面。許多研究表明，下調(diào)TGF-β1[24]、lincRNA-p21[25]、炎癥介質(zhì)等調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路，可以通過抑制HSC活化、肝實質(zhì)細胞自噬[26]、減少肝實質(zhì)細胞上皮細胞—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[27]等途徑實現(xiàn)抗肝纖維化的作用。Varela-Rey 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝星狀細胞內(nèi)MAPK磷酸化可受TNF-α減少影響，從而調(diào)節(jié)I型膠原蛋白表達，使其產(chǎn)生的膠原更易降解。HF患者體內(nèi)T淋巴細胞亞群發(fā)生改變，發(fā)揮抗炎效用的T 輔助細胞(T helper cells 17，Th17)和調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells，Treg)，前者比例升高，后者較正常水平降低[29]，而Th17/Treg 平衡受JAK2/STAT3 調(diào)控[30]。除此之外，JAK2/STAT3信號通路可能通過HSC與纖維母細胞轉(zhuǎn)分化[31]、肝組織和膽總管纖維化相關(guān)蛋白表達[32]、巨噬細胞功能[33]等有關(guān)。HIF-1α是誘導細胞缺氧適應的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)因子，相關(guān)報道稱MAPK也與HIF-1α活性調(diào)節(jié)有關(guān)，兩者均參與了缺氧條件下HSC的激活[34]。

在分子對接過程中，配體和受體分別選擇AKT1和柚皮素、STAT3和甘草查爾酮，結(jié)果顯示結(jié)合能為負值，構(gòu)象能量低提示模擬對接雙方結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、結(jié)合活性好，表明解毒通利方中關(guān)鍵化合物成分可能通過作用于靶蛋白AKT1、STAT3，調(diào)節(jié)PI3K/AKT、JAK2/STAT3信號通路，干預肝纖維化進程，促進機體修復，其作用機制可能與抑制HSC活化與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)初步預測與驗證了解毒通利方治療HF的關(guān)鍵活性成分、核心作用靶點及主要的信號通路，解毒通利方治療HF 的作用可能是通過柚皮素、異鼠李素等多種活性成分作用于IL-6、AKT1、STAT3、MAPK 等多靶點，通過PI3K/AKT、TGF-β/Smads、JAK2/STAT3 等多條信號通路來實現(xiàn)的，但仍需進一步體內(nèi)外實驗研究驗證。本研究揭示了解毒通利方具有多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的分子機制，可為臨床治療HF及下一階段的深入研究提供參考。