吳逐宇,何志旭

(1.遵義醫(yī)科大學 免疫學教研室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學 組織損傷修復與再生醫(yī)學省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,貴州 遵義 563099)

EVs是細胞膜衍生而成的雙層膜結構的囊泡狀小體［1],在20世紀50年代被首次發(fā)現(xiàn),當時被認為是一種源自血漿中血小板的顆粒［2]。EVs由真核、原核生物的細胞膜脫落或者由細胞主動分泌產(chǎn)生,是非復制性的膜封閉結構的異質(zhì)囊泡群體［3-4],幾乎所有(正常和病變)細胞類型都會釋放［5-6]。EVs的分泌量受多種因素的影響,如微環(huán)境、葡萄糖和細胞內(nèi)Ca2+水平等,幾乎在所有體液成分中都可檢測到它的存在,包括血液、尿液、汗液,甚至人的母乳［7]。

細胞間信息交流在人體的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持以及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用。細胞之間的信息交流可以是局部的,也可以是遠距離的,細胞的局部交流通過細胞之間的直接接觸,如相鄰細胞的間隙連接,使得信號分子在細胞之間傳遞;遠距離的細胞通訊可以由激素等分子通過血液循環(huán)系統(tǒng)將信號分子傳遞到機體的其他細胞,EVs也可以介導遠距離細胞信號傳導,EVs作為載體將各種類型的細胞信號物質(zhì)(如脂質(zhì)、mRNA、miRNAs、蛋白質(zhì)等效應分子)運送到受體細胞［8]。

EVs是一種天然的細胞間物質(zhì)運輸工具,具有作為單藥或聯(lián)合治療藥物載體的潛力,特別是溶瘤病毒和化療藥物的聯(lián)合給藥［9-10]。EVs具有細胞靶向特性,它的細胞表面結構(如四倍體蛋白和整合素)可以引導EVs被特定的細胞攝取,并保護EVs包載的治療藥物不受機體免疫系統(tǒng)的調(diào)理作用和吞噬細胞識別,使藥物具有更長的半衰期、減少對健康細胞和組織的毒副作用［11]。腫瘤來源的EVs具有包載藥物能力強、半衰期長、副作用小、無免疫原性反應等特性是一種理想的藥物載體［12-13],經(jīng)過特殊處理的腫瘤源性的EVs,能夠有機的與常規(guī)化療藥物以及溶瘤病毒等結合,形成以囊泡為載體的載藥微顆粒［14-15]。靶向性EVs受到了廣泛的關注,因其具有刺激機體再生以及可以通過機體生物屏障運載藥物到病變部位的能力,使得其有望成為治療各種疾病的新型策略［16-17]。

1 EVs的分離提取

由于EVs具有體積小、密度低等特性,導致其分離、提純難度較大,目前分離、提純EVs的方法很多,傳統(tǒng)的分離方法大多基于EVs的體積大小和密度。目前常用技術有超速離心法［18]、流式細胞術［19]、密度梯度超離心法［20]、超濾法［21]、尺寸排阻色譜法和PEG沉淀法等。超速離心法被認為是EVs分離的金標準,可用于從大量樣品中分離EVs,具有試劑用量少、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,但得到的EVs純度不高,并且較為費時費力,對人員和設備要求很高,常適用于基礎研究,不適用于臨床;適用于臨床檢測的分離檢測方法有:微流控技術、免疫生物芯片法、納米流式法等［22]。密度梯度超離心法提高了EVs分離效率和純度,但設備昂貴、時間長、人工量大,因此其臨床應用受到限制。超濾法是一種常用的節(jié)省時間、節(jié)約花費的方法,但分離得到的EVs數(shù)量有限且純度低,超濾法與超速離心法適當?shù)亟Y合使用,能夠有效地分離EVs的不同亞群,具有廣闊的應用前景［23]。

2 EVs的鑒定

根據(jù)EVs的形態(tài)學特征、體積大小、表面標志物等特征,目前對EVs的鑒定主要有以下方法:①基于EVs形態(tài)和粒徑:可以通過透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、電子冷凍顯微鏡、原子力顯微鏡［24]和結構照明超高分辨率熒光顯微鏡［25]檢測EVs的形態(tài)結構。傳統(tǒng)EVs粒徑檢測方法主要包括動態(tài)光散射［26]、納米粒子跟蹤分析技術(NTA)、可調(diào)諧電阻脈沖傳感(TRPS)等［27],新興的EVs粒徑檢測技術包括表面增強拉曼散射技術(SERS)和納米流式細胞術(nFCM)［28],這些技術通常用于快速全面地測定EVs粒徑和濃度。②基于EVs表面蛋白質(zhì):傳統(tǒng)方法包括Western blotting,酶聯(lián)免疫吸附試驗［29],液相色譜和質(zhì)譜［30]。新興的EVs蛋白分析方法主要基于微流控芯片技術(包括微流控微核磁共振、納米等離子體外泌體傳感、集成磁電化學外泌體傳感［31]、熱泳熱感應［32]等)。③基于EVs核酸:傳統(tǒng)的EVs核酸檢測技術主要包括PCR擴增和高通量測序,新興的EVs核酸檢測技術包括液滴數(shù)字PCR、微流控芯片技術［33]、離子交換納米探測器和局部表面等離子體共振檢測［34]。④基于EVs脂類:主要使用的分析技術是色譜-質(zhì)譜、核磁共振等,由于核磁共振法受到樣本量以及靈敏度等因素的影響,所以更多應用的是色譜-質(zhì)譜技術。在EVs脂質(zhì)組學分析中,應用最廣泛的液相色譜和質(zhì)譜分析技術是反相色譜-質(zhì)譜［35]。

3 EVs作為藥物載體應用于抗腫瘤研究

越來越多研究證實可以利用EVs作為藥物的遞送載體,應用于疾病治療。EVs作為載體工具具備以下優(yōu)點:包載藥物能力好、靶向性強、半衰期長、副作用小、免疫原性低等,并且EVs能夠與抗腫瘤藥物、溶瘤病毒等抗腫瘤物質(zhì)很好的結合,是一種很有前景的抗腫瘤載體工具［36-38]。

3.1 EVs運載抗腫瘤分子 受到EVs介導的細胞間通訊的啟示,Silva等［39]利用人巨噬細胞包裹氧化鐵納米顆粒和不同的治療藥物(包括一種化療藥物(阿霉素),組織纖溶酶原激活劑和2種光敏劑),所得到的雜交細胞EVs具有磁響應性,易于被磁力和MRI檢測到,通過利用囊泡中包載的光敏劑發(fā)現(xiàn)在磁場當中癌細胞對微囊泡的吸收可以被動態(tài)調(diào)節(jié),并且磁性增強了EVs對癌細胞的靶向殺傷。Tian等［40]發(fā)現(xiàn)靶向配體修飾的外泌體可用于將阿霉素(Dox)遞送至腫瘤組織,具有巨大的臨床應用價值。研究者使用免疫原性低的小鼠未成熟樹突狀細胞(imDCs)來源的外泌體,通過將 imDCs 改造為與av整合素特異性iRGD肽結合的外泌體膜蛋白,從而增強了腫瘤靶向性,imDCs通過電穿孔技術包載Dox。實驗發(fā)現(xiàn):iRGD 外泌體對av整合素陽性乳腺癌細胞具有高靶向性,可以將Dox高效的遞送至腫瘤組織,抑制腫瘤生長,并且無明顯毒副作用。

已有多篇文章報道間充質(zhì)干細胞(MSCs)衍生的EVs可以作為藥物載體。Kalimuthu等［41]將MSCs與紫杉醇(PTX) 混合,分離出包載有PTX的EVs ,并評估其對乳腺癌的抗癌作用。結果證實不同濃度的紫杉醇(25、50、100 mg/mL)與人骨髓MSCs衍生的EVs混合后,與單純?nèi)斯撬鐴Vs相比,對乳腺癌的殺傷作用更加顯著。Yang等［42]通過實驗證實了腦內(nèi)皮細胞來源的外泌體可以穿過血腦屏障(BBB)運載抗腫瘤藥物用于斑馬魚模型的腦腫瘤治療。成像實驗顯示,外泌體攜帶抗腫瘤藥物穿過BBB進入大腦,外泌體包載的抗腫瘤藥物顯著降低了異種移植癌細胞的熒光強度和腫瘤生長標志物的表達,證明了腦內(nèi)皮細胞來源的外泌體有可能作為腦腫瘤治療中抗腫瘤藥物腦轉(zhuǎn)運的載體。Quinn等［43]通過將EVs質(zhì)膜與過表達生長因子受體2(HER2)的BT-474細胞系衍生的HER2+EVs融合,成功地使三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞表面表達足量的HER2。然后使用HER2抗體結合的PTX載脂質(zhì)體進行HER2靶向給藥,結果表明這種方式的靶向給藥,在體外和體內(nèi)實驗均可以提高的治療效果。

Yong等［44]開發(fā)了一種腫瘤細胞外泌體仿生多孔硅納米顆粒(PSiNPs)作為靶向藥物載體。腫瘤細胞通過內(nèi)吞包載DOX的PSiNPs,胞吐產(chǎn)生包裹DOX和PSiNPs的外泌體(DOX@E-PSiNPs)。在體外實驗靜脈給藥后,腫瘤聚集現(xiàn)象增強,從血管外滲并滲透到腫瘤深部實質(zhì)。此外,無論什么細胞來源的DOX@E-PSiNPs,在癌細胞和癌癥干細胞(CSCs)中都具有顯著的細胞攝取和細胞毒性。這些特征使DOX@E-PSiNPs富集于具有CSCs特征的腫瘤細胞和側群細胞,從而導致皮下、原位和轉(zhuǎn)移性腫瘤模型中的抗癌活性和CSCs減少。多項研究發(fā)現(xiàn),姜黃素具有強大的抗癌和抗炎作用,Osterman等［45],通過光譜研究和熒光顯微鏡觀察到姜黃素處理胰腺癌細胞后分泌的外泌體中成功包載姜黃素,然后通過Hoffman調(diào)制對比顯微鏡以及AlamarBlue和Trypan blue排除試驗,發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞外泌體成功將姜黃素運載到胰腺癌細胞,增強了姜黃素對胰腺癌細胞的殺傷作用。

Bai等［46],報道了一種靶向tLyp-1外泌體將siRNA運載到腫瘤細胞和腫瘤干細胞。首先,研究者構建了工程tLyp-1-lamp2b質(zhì)粒,在大腸桿菌中進行擴增。然后將tLyp-1-lamp2b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞,從轉(zhuǎn)染后的HEK293T細胞的分泌物中分離出tLyp-1外泌體。通過電穿孔技術將人工合成的siRNA包載到tLyp-1外泌體中。最后,使用靶向siRNA tLyp-1外泌體轉(zhuǎn)染腫瘤細胞以及腫瘤干細胞。結果表明,tLyp-1外泌體有能夠很好的轉(zhuǎn)染腫瘤細胞和腫瘤干細胞,靶向siRNA tLyp-1外泌體能夠敲除腫瘤細胞的靶基因,降低腫瘤干細胞的干性。Ohno等［47],證明了外泌體可以有效地將miRNA傳遞給表達表皮生長因子受體(EGFR)的乳腺癌細胞。通過使供體細胞表達能與GE11肽結合的血小板來源的生長因子受體跨膜結構域?qū)崿F(xiàn)靶向,RAG2(-/-)小鼠靜脈注射外泌體,將miRNA遞送到表達EGFR的異種移植乳腺癌組織。

Celastrol(CEL)是一種植物衍生的三萜,許多研究證明CEL在各種癌癥的治療中具有重要意義。Aqil等［48],研究了外泌體包載CEL對2種非小細胞肺癌細胞的作用,發(fā)現(xiàn)與游離CEL相比,牛乳來源性的外泌體包載CEL的對肺癌細胞的抗腫瘤療效更強。證明外泌體包載提高了CEL對肺癌中的效果并降低了毒副作用。具有生物活性的皂苷和黃酮類化合物,已經(jīng)被證明對癌細胞具有殺傷作用,Donoso-Quezada 等［49]研究發(fā)現(xiàn),用乳腺癌、結腸癌和肝癌細胞系中分離的外泌體包載皂苷和黃酮類化合物,與游離形式處理以及脂質(zhì)體包載形式處理相比,對腫瘤的殺傷作用更加顯著。

3.2 EVs運載溶瘤病毒 Saari等［50]通過實驗證明了,被溶瘤腺病毒(Adv)感染的腫瘤細胞分泌的EVs(IEVs)中的病毒載量與感染時間的對應關系。實驗結果顯示:IEVs在病毒裂解釋放之前就已經(jīng)分泌出來,它們的結構類似于正常細胞分泌的EVs;IEVs能夠攜帶病毒可以誘導其他癌細胞感染殺傷腫瘤細胞,可應用于癌癥治療。Adv在細胞表面表達柯薩奇受體和腺病毒受體(CAR)低的腫瘤細胞中表現(xiàn)出差的感染效率,并且Adv中和抗體能減弱病毒對腫瘤細胞殺傷作用。Zhang等［51],構建表達PD1胞外結構域(Ad5-P)的重組Adv,將其感染細胞表面表達VSV-G蛋白的293T細胞,然后收集感染Ad5-P的293T-VSV-G細胞,通過密度梯度離心收集包載AD5-P的EVs。結果顯示:在CAR低表達的細胞系中,Adv的感染效率、溶瘤能力顯著增強并且產(chǎn)生了可溶性PD-1。小鼠實驗顯示,包載AD5-P的EVs可以逃避免疫系統(tǒng)的中和作用,可溶性Ad5-p表達明顯延長。研究結果證明,該方法可顯著提高肝癌小鼠的抗腫瘤免疫應答、延長小鼠生存期。Ran等［52],報道了腫瘤細胞來源的微囊泡(T-MPs)可以作為載體,運載溶瘤病毒高效地溶解腫瘤細胞。研究發(fā)現(xiàn),T-MPs包載溶瘤病毒可以有效地靶向殺死腫瘤細胞。然而,使用T-MPs作為一種新型的溶瘤腺病毒遞送工具,是如何感染和殺死靶腫瘤細胞的機制仍然需要進一步了解。

Garofalo等［53]研究了EVs作為藥物載體,包載溶瘤病毒和PTX對肺癌的聯(lián)合療法。結果顯示與EVs單獨包載Adv、紫杉醇相比,EVs同時包載兩者顯著提高了轉(zhuǎn)導率和感染滴度。證明了EVs包載溶瘤病毒和紫杉醇聯(lián)合用藥能夠降低人肺癌動物異種移植模型的腫瘤生長。這種聯(lián)合療法,在體內(nèi)和體外肺癌模型均顯示增強了抗腫瘤作用。在另一項研究中,Garofalo等［54]應用影像技術觀察到EVs包載Adv后對小鼠腫瘤模型進行靜脈注射給藥,與直接溶瘤病毒腹腔靜脈注射給藥相比,顯著增強了Adv的腫瘤趨向性;同時也證明了采用EVs包載溶瘤病毒的給藥方式,不會改變病毒的免疫調(diào)節(jié)特性。除此之外,Garofalo等［55]首次證明了腫瘤來源的EVs具有異種、跨物種的腫瘤趨向性,這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了目前對EVs歸巢特性的看法。研究者觀察到EVs裝載溶瘤病毒后,其表面電荷和尺寸大小不會發(fā)生顯著改變。給腫瘤小鼠靜脈注射腫瘤細胞源性的EVs,24 h后在腫瘤部位顯示了明顯的熒光積累,而注射健康組織源性的EVs時,則沒有觀察到這種現(xiàn)象;當EVs包載溶瘤病毒時,并沒有改變EVs的腫瘤趨向性。該研究證明了腫瘤源性EVs對任何腫瘤組織都具有相同的趨向性,與腫瘤類型甚至囊泡的物種來源無關。

4 展望

EVs最初在被發(fā)現(xiàn)由網(wǎng)織紅細胞釋放分泌,被認為是細胞處理廢物的一種工具。EVs在細胞間通訊中發(fā)揮著重要作用,調(diào)節(jié)各種疾病的發(fā)生發(fā)展包括癌癥、心臟病、神經(jīng)退行性疾病、精神疾病等。目前,仍處于EVs研究的起步階段,關于EVs 的產(chǎn)生、分選等過程的分子機制仍未被闡明,對相關機制的研究將更加深入地闡明EVs作為細胞間信號傳遞途徑在各種疾病發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用,有利于將EVs應用于疾病的診斷、監(jiān)測和治療。

目前許多藥效很好的非靶向藥物在全身輸送時效率低下且有毒副作用,如何能將有效的治療藥物送到目標器官,是一個亟待解決的問題。藥物給藥系統(tǒng)(DDS)可以高效的藥物運送到病變器官、降低藥物的副作用,傳統(tǒng)的DDS如聚乙二醇和脂質(zhì)體在藥物遞送中的作用十分顯著。由于EVs是由細胞自然產(chǎn)生的,對機體器官或細胞有趨向性并且毒副作用低,有潛力作為天然DDS。在過去十幾年的研究中,EVs已經(jīng)成為靶向器官或細胞選擇性藥物的潛在工具,基于EVs的DDS研究已經(jīng)取得了很好的結果,因此,EVs介導的器官、細胞選擇性藥物給藥使EVs成為備受關注的DDS。

目前,EVs的臨床應用還面臨著很多問題,僅有樹突狀細胞來源的EVs作為腫瘤疫苗的研究已經(jīng)進入臨床實驗階段,且尚沒有一個準確的、通用的EVs鑒定的方式,說明EVs的研究仍具有極大的空間,其在人類疾病治療中的巨大潛能還未被完全發(fā)掘。相信隨著研究的不斷深入,EVs應用的范圍將越來越廣,在重大疾病攻克中將取得突破性的進展。