寧夏小麥莖基腐病病原鑒定

胡耀龍　申昊　高龍　茍金紅　李文強(qiáng)　賈龍　任斌

摘要 為確定寧夏地區(qū)小麥莖基腐病病原，于2020年小麥灌漿期在寧夏引黃灌區(qū)小麥產(chǎn)區(qū)采集小麥莖基腐病發(fā)病植株，進(jìn)行組織分離純化。根據(jù)培養(yǎng)性狀、菌落顏色、分生孢子等形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行病原鑒定及致病性測(cè)定。結(jié)果表明，共分離獲得87株菌株，根據(jù)病原形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，其中有59株菌株鑒定為假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum），28株菌株鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），其中假禾谷鐮刀菌占總分離菌株的67.8％，是寧夏地區(qū)小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原。

關(guān)鍵詞 小麥莖基腐??；病原鑒定；假禾谷鐮刀菌；尖孢鐮刀菌；致病性

中圖分類(lèi)號(hào) S 432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2023）15-0131-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.032

Identification of Pathogen of Wheat Crown Rot Disease in Ningxia

HU Yao-long，SHEN Hao，GAO Long et al

（College of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan， Ningxia 750000）

Abstract In order to determine the pathogen of wheat crown rot in Ningxia area， plants with wheat crown rot disease were collected in the wheat production area of Ningxia irrigation area in 2020 for tissue separation and purification. Pathogen identification and pathogenicity determination were based on morphology and molecular biology such as culture traits， colony color， conidia， etc. The results showed that a total of 87 strains were isolated， and according to the pathogen morphological identification and molecular biology identification results， 59 strains were identified as F. pseudograminearum and 28 strains were identified as F. oxysporum， of which F. pseudograminearum accounted for 67.8% of the total isolated strains， which was the dominant pathogen of wheat crown rot in Ningxia.

Key words Wheat crown rot;Pathogen identification;Fusarium pseudograces;Fusarium oxysporum;Pathogenicity

小麥莖基腐病是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的真菌性病害，該病害在發(fā)病初期導(dǎo)致小麥莖基部變褐及腐爛，影響小麥生長(zhǎng)，發(fā)病后期致使小麥穗部干癟甚至變?yōu)榘姿?，?yán)重影響小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量［1-2］。小麥莖基腐病的病原組成較為復(fù)雜，且在各地不同環(huán)境條件下的優(yōu)勢(shì)致病菌也不同。在塞爾維亞地區(qū)，從小麥莖基腐病的發(fā)病部位分離出的病原包括假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）［3］。在伊拉克地區(qū)，研究表明黃色鐮刀菌（F.culmorum）是引起該地區(qū)病害發(fā)生的重要病原菌［4］。在智利南部地區(qū)，小麥莖基腐病的病原組成主要為鐮刀菌屬（Fusarium.sp.），包括禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）等［5］。我國(guó)研究者同樣發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬（Fusarium sp.）是引起小麥莖基腐病發(fā)生的主要病原菌。研究者從小麥莖基腐病病株上分離出的病原菌主要包括燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）［6］、木賊鐮刀菌（F.equiseti）、假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）［7］、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides）、禾谷鐮孢菌（F.graminearum）［8］、三線鐮刀菌（F.tricinctum）［9］等。鐮刀菌屬（Fusarium.sp.）分布范圍大，寄生或腐生于寄主植物維管束中。在一定的氣候條件下，對(duì)小麥的莖基部及根部進(jìn)行侵染，導(dǎo)致小麥株系萎蔫，對(duì)小麥產(chǎn)量造成極大影響［10］。

近年來(lái)，因?yàn)榻斩掃€田的實(shí)行，寧夏引黃灌區(qū)銀川平原永寧縣、靈武市、吳忠市等地土地中的菌原累積的越來(lái)越多，加之其他因素導(dǎo)致小麥莖基腐病在全國(guó)多省大面積發(fā)生，且不斷加劇［11-13］。寧夏引黃灌區(qū)地勢(shì)平坦，小麥作為銀川平原的主要農(nóng)作物，而小麥莖基腐病在寧夏的病原組成一直缺乏系統(tǒng)研究。筆者通過(guò)對(duì)寧夏引黃灌區(qū)小麥產(chǎn)區(qū)采到的小麥莖基腐病病株進(jìn)行病原分離純化，根據(jù)培養(yǎng)性狀、菌落、分生孢子等形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法對(duì)小麥莖基腐病株中所含有的鐮刀菌種類(lèi)進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究和防治小麥莖基腐病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年5月在寧夏引黃灌區(qū)小麥種植區(qū)采集小麥莖基腐病發(fā)病植株，裝在自封袋中，記錄采樣地點(diǎn)、病株編號(hào)、采樣日期等信息。將采集的病株帶回實(shí)驗(yàn)室之后于4 ℃保存以待后續(xù)分離使用。

供試小麥品種：寧春50。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，用于病原菌的分離純化；水瓊脂，用于病原菌分生孢子的純化。培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。121 ℃滅菌25 min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫時(shí)加入氯霉素。水瓊脂培養(yǎng)基：2 g瓊脂，100 mL蒸餾水，121 ℃滅菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化。

采用植物組織分離法。取樣品病株發(fā)病部位，剪成5 mm×5 mm左右的碎片，用75％乙醇消毒15 s、無(wú)菌水漂洗、5％的次氯酸鈉消毒4 min，最后用無(wú)菌水沖洗干凈后用濾紙片對(duì)組織表面水分干燥后置于PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿上均勻分布4塊植物組織。于26 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，長(zhǎng)出菌落后對(duì)邊緣菌落繼續(xù)純化培養(yǎng)，生長(zhǎng)5 d左右后對(duì)其進(jìn)行鏡檢，對(duì)確認(rèn)是致病的病原菌進(jìn)行單孢分離，以獲得純培養(yǎng)物，并將純化后菌種置于斜面PDA上，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定。

將獲得純化后的病原菌置于PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d左右，觀察菌落生長(zhǎng)情況和菌絲生長(zhǎng)情況，包括孢子形態(tài)、色素產(chǎn)生及菌絲形狀與疏密程度并拍照記錄。對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定，初步明確目標(biāo)病原的類(lèi)型。

1.2.3 病原菌致病性測(cè)定。

對(duì)分離獲得的病原菌在小麥合適生長(zhǎng)條件下進(jìn)行致病性的測(cè)定。挑取寧春50春小麥種子，播種至花盆當(dāng)中，于溫室培養(yǎng)。當(dāng)小麥生長(zhǎng)至三葉期時(shí)，將不同致病菌株分別接種至小麥幼苗上，后每經(jīng)過(guò)2 d觀察一次發(fā)病情況并澆水。接種方法采用針刺法，15 d后觀察盆栽小麥發(fā)病情況。

1.2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定。

采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)代表性菌株DNA進(jìn)行提取，方法步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。將提取到不同菌株的DNA樣品送至上海生工生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增及基因序列測(cè)序，所有產(chǎn)物均采用雙向測(cè)序。選取EF-1α序列上的一對(duì)基因位點(diǎn)對(duì)代表性菌株的DNA樣品進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。用于分子生物學(xué)鑒定的引物信息：

EF-1T 5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′，EF-2T 5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′。

根據(jù)上海生工生物工程有限責(zé)任公司所反饋的測(cè)序拼接結(jié)果，并進(jìn)行人工校對(duì)，然后于NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載同源性較高的序列，將在基因庫(kù)中所下載的鐮刀菌序列和試驗(yàn)中所測(cè)的鐮刀菌序列，采用MEGA.7分析軟件的鄰接法構(gòu)建基于EF-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果及形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)對(duì)寧夏引黃灌區(qū)采集到的小麥莖基腐病病株進(jìn)行分離，共獲得87株菌株，對(duì)所獲得菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形狀的觀察及分生孢子和厚垣孢子的顯微觀察，將其鑒定為兩類(lèi)鐮刀菌，包括59株假禾谷鐮刀菌和28株尖孢鐮刀菌。

2.1.1 假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）。

PDA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑為4.4～5.7 cm。氣生菌絲為粉紅色或者白色，絨狀，可以產(chǎn)生深紅色的色素、黃色色素或不產(chǎn)色素（圖1a、b）。大型分生孢子較直。隔膜數(shù)為1～11個(gè)，大多數(shù)為5～6個(gè)，孢子大小為（45～91） μm×（2.8～5.5） μm，有明顯足細(xì)胞，頂細(xì)胞彎曲（圖1c、d）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加有厚垣孢子產(chǎn)生（圖1f）。

2.1.2 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

PDA培養(yǎng)基上25 ℃暗培養(yǎng)5 d，菌落直徑為2.7～5.2 cm。氣生菌絲呈棉絮狀，初期為粉色，后期為白色與淡青蓮色相間。移植次數(shù)增多，有退化現(xiàn)象，菌絲成束生緊貼管壁（圖2a、b）。小型分生孢子數(shù)量較多，卵形，假頭狀著生，孢子大小為（5.0～12.6） μm×（2.5～3.6） μm（圖2d）。大型分生孢子，美麗型，鐮刀狀，稍彎，向兩端比較均勻地逐漸變尖，基孢足跟明顯。隔膜數(shù)為1～6隔，孢子大小具體為1～2隔，（10～34）μm×（2.5～4.0） μm；3～4隔，（23.0～56.6） μm×5 μm；5～7隔，（31～60） μm×（3～6） μm（圖2c）。容易形成厚垣孢子，多為球形，直徑為6～8 μm，單生或頂生（圖2f）。產(chǎn)孢細(xì)胞較短，單瓶梗。大小為（4.4～10.0） μm×（2.5～4.4） μm，在菌絲上直接長(zhǎng)出或分生孢子座上成叢生狀（圖2e）。

2.2 致病性測(cè)定

以寧春50春小麥為試驗(yàn)材料，在室溫條件下通過(guò)針刺莖基部的接種方法對(duì)不同鐮刀菌菌株進(jìn)行盆栽苗的致病性測(cè)定。結(jié)果表明，2種鐮刀菌對(duì)小麥均具有致病力，可以引起小麥苗期發(fā)病，且對(duì)照組不發(fā)病（圖3）。后依據(jù)柯赫氏法則，對(duì)接種發(fā)病的小麥苗進(jìn)行分離純化，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，同樣將分離物鑒定為假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。符合柯赫氏法則，并選取4株代表性菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.3 鐮刀菌的分子生物學(xué)鑒定

選用鐮刀菌特異性引物EF1/EF2對(duì)代表性的4種菌株（YNWH-A/B/C/E）進(jìn)行PCR擴(kuò)增后雙向測(cè)通，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載同源性在99%以上的序列，數(shù)據(jù)庫(kù)中的EF-1α基因序列信息見(jiàn)表1。將下載的鐮刀菌序列和試驗(yàn)所得序列采用比鄰法構(gòu)建基于EF-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。結(jié)果表明，菌株編號(hào)為YNWH-B和YNWH-E的2種菌株與GenBank中登錄號(hào)為MG670541.1的假禾谷鐮刀菌聚在一起，支持率高達(dá)100％，所以將YNWH-B和YNWH-E這2株菌株鑒定為假禾谷鐮刀菌，菌株編號(hào)為YNWH-A和YNWH-C的2種菌株與登錄號(hào)為MH819256.1的尖孢鐮刀菌屬于同一分支，將其鑒定為尖孢鐮刀菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定寧夏地區(qū)小麥莖基腐病病原為假禾谷鐮刀菌F.pseudograminearum和尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

3 討論

小麥莖基腐病隨著不同地區(qū)氣候的不同，對(duì)小麥的生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同的影響程度，不同經(jīng)緯度海拔地區(qū)小麥莖基腐病的病原組成也具有一定差異［14］。該試驗(yàn)的分子生物學(xué)鑒定采用鐮刀菌特異性EF-1α基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析方法，同時(shí)也證明形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性。結(jié)果從分離出的87株菌株中共鑒定出2類(lèi)鐮刀菌，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）占其中32.2%，是致小麥莖基腐病發(fā)生的新興菌種［3］。假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）占其中67.8%，是小麥莖基腐病在寧夏地區(qū)發(fā)生的優(yōu)勢(shì)病原菌，這與塞爾維亞地區(qū)對(duì)該病害的鑒定結(jié)果一致，相關(guān)學(xué)者從該地區(qū)小麥莖基腐病上分離到這2種鐮刀菌［3］。國(guó)內(nèi)大部分相關(guān)學(xué)者同樣印證了假禾谷鐮刀菌作為小麥莖基腐病優(yōu)勢(shì)病原菌這一結(jié)論［6-9］。張向向［14］研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌是南方地區(qū)寄生在小麥上的優(yōu)勢(shì)病原菌，這與該試驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異，這可能與不同地區(qū)的海拔、經(jīng)緯度及環(huán)境條件的差異相關(guān)［15-16］。

該試結(jié)果確定了假禾谷鐮刀菌和尖孢鐮刀菌是致使寧夏引黃灌區(qū)小麥莖基腐病發(fā)生的病原，豐富了寧夏地區(qū)對(duì)小麥莖基腐病的研究，為小麥莖基腐病的進(jìn)一步研究和防治提供參考。

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基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860352）。

作者簡(jiǎn)介 胡耀龍（1999—），男，寧夏銀川人，碩士研究生，研究方向：植物病理學(xué)。

*通信作者，副教授，從事植物病理學(xué)研究。

收稿日期 2022-08-17；修回日期 2022-09-23