曹張歡 蔣顯鋒 黃子靜 孫杰

現(xiàn)如今，酒類飲品超范圍、超限量使用食品添加劑的現(xiàn)象屢見不鮮，如白酒中超范圍或超限量使用甜蜜素、糖精鈉；葡萄酒中超范圍或超限量使用三氯蔗糖；果酒中超范圍或超限量使用苯甲酸、合成著色劑；露酒中超范圍或超限量使用甜蜜素、三氯蔗糖等。目前我國國家標準和行業(yè)標準中沒有同時檢測這四類酒中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍的方法標準。本文應用高效液相色譜-三重四級桿質譜技術，測定了四類酒中12種食品添加劑，探索了同時使用分子離子、特征碎片離子和保留時間作為定性依據(jù)，對多種食品添加劑進行檢測的新方法。

一、材料與方法

1.材料與試劑。標準物質溶液（1000mg/mL）：苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、糖精鈉、三氯蔗糖、甜蜜素、安賽蜜、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍；甲醇（99.9%，色譜純）；乙酸銨（99.0%，macklin，色譜純）；乙酸銨溶液（5mmol/L）：稱取0.39g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1000mL，搖勻后經(jīng)0.22μm水相微孔濾膜過濾備用；流動相A：甲醇+乙腈（2+1），流動相B：5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%氨水）；0.22μm水相微孔濾膜。

2.儀器與設備。賽多利斯電子天平（精度：0.0001）；電熱恒溫水浴鍋；賽默飛UltiMate3000型高效液相色譜儀，由二元泵、柱溫箱、自動進樣器組成；AB SCIEX API3200型三重四級桿質譜儀，配電噴霧電離源（ESI）。

3.方法。（1）色譜條件。色譜柱為AcclaimTM120 C18柱（3μm，30×100mm，賽默飛公司）；流動相A為甲醇+乙腈（2+1），流動相B為5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%氨水）；柱溫為40℃；進樣量為30μL。

梯度洗脫條件：流速0.4mL/min。0-5min（95%流動相B），5-10min（30%流動相B），10-12min（95%流動相B），12-20min（95%流動相B）。

參考保留時間（RT）：苯甲酸（2.95min）、山梨酸（3.35min）、脫氫乙酸（2.95min）、糖精鈉（3.54min）、三氯蔗糖（5.35min）、甜蜜素（4.23min）、安賽蜜（2.68min）、檸檬黃（4.24min）、日落黃（4.25min）、莧菜紅（3.16min）、胭脂紅（3.82min）、亮藍（5.66min）。

（2）質譜條件。電離源：電噴霧負離子模式（ESI-）；檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）；離子化電壓（IS）為-4500V；噴霧氣壓力（GS1）為55Psi；輔助加熱氣壓力（GS2）為55Psi；氣簾氣壓力（CUR）為15Psi；離子源溫度（TEM）為300℃；噴撞氣（CAD）：5；接口加熱（ihe）：打開；其他質譜參數(shù)見表1。

（3）標準工作液的配制。稱取2.5g白酒、葡萄酒、果酒、露酒陰性基質于25mL容量瓶中，根據(jù)樣品中添加劑的含量情況，加入標準儲備液，用初始流動相定容，使標準工作液與樣液中目標峰的峰面積相近。

（4）樣品處理。稱取酒樣2.5g，置于50mL燒杯中，于60℃水浴30min，用初始流動相洗滌殘渣，并全部轉移至25mL容量瓶中，定容并搖勻，經(jīng)0.22μm水相微孔濾膜過濾，上液相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測。

（5）條件優(yōu)化。①溶劑的選擇。由于檢測項目涉及多種食品添加劑，前處理必須兼顧絕大多數(shù)組分的提取效率。大多數(shù)添加劑均為鈉鹽或鉀鹽，具有較好的水溶性，但實驗發(fā)現(xiàn)摸索質譜條件時用初始流動相溶解標準物質，比用純水溶解會大大增加幾種合成著色劑的響應值?？紤]到提高離子化效率，最終選擇用5+95的流動相A+流動相B作為提取液。實驗表明：流動相A用甲醇+乙腈（2+1），能更好地減小峰面積重復性誤差；流動相B為5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%氨水），可以使各組分響應值達到相對較高值。

②液相色譜條件的優(yōu)化。由于檢測組分多達12種，且含有胭脂紅和莧菜紅兩種同分異構體，所以快速、高效的分離尤為重要。本實驗選用了AcclaimTM120 C18柱（3μm，30×100mm，賽默飛公司）作為分析柱，以甲醇和5mmol/L乙酸銨溶液為流動相，進行梯度洗脫。結果表明，絕大多數(shù)添加劑分離良好，全部組分在6min內出峰，包括系統(tǒng)平衡和沖洗殘留物在內，僅需20min即可完成一個樣品的篩查。

③質譜參數(shù)的優(yōu)化。將各添加劑標樣溶液注入質譜儀，對質譜參數(shù)進行優(yōu)化，以獲得最佳的靈敏度和足夠的子離子信息。其中，去簇電壓和碰撞能量是質譜參數(shù)中最重要的2個參數(shù)。去簇電壓直接影響各組分的靈敏度，隨著去簇電壓的升高，各添加劑的響應值逐漸增強，但去簇電壓過高可能導致色素分子離子在離子源內因共振而碎裂、解離，反而影響母離子的靈敏度。經(jīng)實驗，在去簇電壓15-70V、碰撞能量7-79eV時，絕大部分添加劑可獲得較強的子離子。

④其他條件的優(yōu)化。由于基質效應明顯，因此選擇了基質加標的方法減小基質效應。合成著色劑在做曲線時呈拋物線趨勢明顯，所以選擇單點法配制標液。由于酒類樣品中乙醇含量較高，因此應該進行除乙醇處理。

二、結果與分析

1.基質效應研究。（1）基質效應評價方法。本研究采用斜率法評價基質效應，4類酒中12種添加劑的基質效應詳見表2。斜率法：ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率。若 ME=1，表示不存在基質效應；ME>1（或ME-1>0），為增強效應；ME<1（或ME-1<0），為抑制效應。若0.8≤ME≤1.2，為弱基質效應；當0.51.5時，為強基質效應。

（2）實驗結果。由表2可知，檢測12種添加劑時，75%以上具有中等基質效應，通過基質匹配標準曲線、同位素內標、稀釋樣品溶液以及優(yōu)化色譜條件和采集方式，均能有效補償12種化合物的基質效應。由于酒類食品基質復雜、同位素內標物價格昂貴且不易購買等原因，本實驗采取基質匹配標準曲線以減小基質效應影響。

2.12種添加劑檢測研究。（1）方法的定性、定量、檢出限和定量限。進行樣品測定時，若樣品色譜峰的保留時間與標準品一致，并且在扣除背景后，樣品譜圖中各定性離子的相對豐度與濃度和同樣條件下得到的標準溶液譜圖相比，最大允許相對偏差符合歐盟2002/657/EC中規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中檢出相應組分。但對于苯甲酸和山梨酸，由于在本方法的ESI－檢測模式下，只產(chǎn)生1個二級碎片離子，無法計算碎片離子的相對豐度，因此本方法采用保留時間結合1個Q1/Q3離子對進行定性。按照方法配制混合標準溶液，在選定的HPLC-MS條件下進行測定，12種添加劑標準溶液的色譜圖如圖1所示，采用在空白基質中添加目標組分的方法，依據(jù)MRM色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定最低定量限（LOQ），得到12種目標組分的LOD和LOQ，具體見表3。由表3可知，各添加劑的LOD和LOQ分別為0. 01mg/kg-0.71mg/kg和0.05mg/kg-2.37mg/kg。

（2）準確度與精密度試驗。分別準確稱取不含待測化合物的白酒、葡萄酒、果酒、露酒樣品2.5g于25mL容量瓶中，用微量移液器準確加入一定量的各添加劑標準溶液，用初始流動相定容至刻度，混勻，配成低、中、高3個濃度水平的質量控制（QC）樣品，每一濃度進行6次平行測定，結果見表4。根據(jù)表4可知，白酒、葡萄酒、果酒、露酒中低、中、高3個濃度水平的各添加劑均具有較好的準確度與精密度，

12種目標化合物在白酒中的回收率為81.3%-113.7%，相對標準偏差（RSD）為1.1%-11.2%；在葡萄酒中的回收率為80.0%-112.5%，RSD為1.2%-12.3%；在果酒中的回收率為80.2%-112.9%，RSD為1.7%-10.0%；在露酒中的回收率為80.3%-104.5%，RSD為1.4%-10.8%。

3.方法的應用。按照所建的方法對市售的23份白酒、24份葡萄酒、12份果酒、12份露酒中的12種添加劑進行測定。葡萄酒樣品中，9份檢出含有山梨酸，含量在0.03g/kg-0.17g/kg。果酒樣品中，8份檢出含有山梨酸，含量在0.01g/kg-0.19g/kg；6份樣品檢出含有三氯蔗糖，含量在0.01g/kg-0.22g/kg；6份樣品檢出含有糖精鈉，含量在0.01g/kg-0.04g/kg；5份樣品檢出含有甜蜜素，含量在0.18g/kg-0.29g/kg；3份樣品檢出含有莧菜紅，含量在0.01g/kg-0.03g/kg；2份樣品檢出含有苯甲酸，含量在0.01g/kg-0.13g/kg。露酒中4份樣品檢出含有山梨酸，含量在0.07g/kg-0.17g/kg；4份樣品檢出含有三氯蔗糖，含量在0.05g/kg-0.10g/kg；3份樣品檢出含有甜蜜素，含量在0.14g/kg-0.61g/kg；1份樣品檢出含有胭脂紅，含量為0.23g/kg；1份樣品檢出含有莧菜紅，含量為0.05g/kg；1份樣品檢出含有亮藍，含量為0.01g/kg；1份樣品檢出含有苯甲酸，含量在0.07g/kg。

從檢測結果可以看出，葡萄酒中防腐劑的檢出率為38%左右；果酒中人工合成甜味劑的檢出率為58%，防腐劑的檢出率為75%，人工合成著色劑的檢出率為25%；露酒中人工合成甜味劑的檢出率為33%，防腐劑的檢出率為33%，人工合成著色劑的檢出率為25%。

根據(jù)GB 2760規(guī)定，所檢樣品的12種防腐劑、甜味劑、合成著色劑均在使用要求范圍內。但需注意的是，配制酒使用復合甜味劑的現(xiàn)象較多，且這些甜味劑還不相同，說明市場上已存在將多種人工合成甜味劑添加到配制酒中的現(xiàn)象，這應引起食品安全監(jiān)管部門的足夠重視，以應對潛在的食品安全風險。

研究結果表明，高效液相色譜-質譜是對白酒、果酒、葡萄酒、露酒中多種食品添加劑進行檢測的有效技術，具有分離效率高、定性定量結果準確的特點，應用前景廣闊。

基金項目：四川省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（SCSJ2021010）。