馬鈴薯DHN家族基因鑒定及干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析

紀(jì)藝紅　李越　白雪　溫美沙　劉暢　許春江　李雅飛　王磊

摘要：馬鈴薯遭遇干旱脅迫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低。用生物信息學(xué)的方法，對(duì)馬鈴薯DHN（StDHN）基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，對(duì)其理化性質(zhì)、染色體分布等進(jìn)行分析，利用熒光定量的方法，對(duì)其在干旱脅迫下和不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，StDHN基因家族共鑒定出5個(gè)家族成員，分布于1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)染色體上，理化性質(zhì)分析表明氨基酸長(zhǎng)度為80～243個(gè)，分子量為8 544.27～25 121.94 ku，等電點(diǎn)（pI）的范圍為5.24～7.38。StDHN蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本以無(wú)規(guī)卷曲為主，延伸鏈與β-轉(zhuǎn)角的比例相當(dāng)，僅有PG0009968以α-螺旋為主。對(duì)馬鈴薯DHN基因上游1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，DHN基因受到光的調(diào)控，平均每個(gè)基因中有10.4個(gè)光響應(yīng)元件；還受到脫落酸（PG0015495、PG0003531、PG0009968）、赤霉素（PG0003531）等激素的調(diào)控；與逆境脅迫相關(guān)的包括低溫響應(yīng)元件（PG0030949、PG0003531、PG0009968）、干旱響應(yīng)元件（PG0030949）等；生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控元件包括胚乳表達(dá)（PG0015495）、種子特異性調(diào)控（PG0003531）、分生組織表達(dá)（PG0003531、PG0009968）。熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DHN基因參與干旱應(yīng)答響應(yīng)，也有可能參與馬鈴薯的生長(zhǎng)調(diào)控。本研究為馬鈴薯中的耐旱候選基因研究提供參考。

關(guān)鍵詞：全基因組；馬鈴薯；干旱脅迫；組織特異性；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S532.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）14-0058-07

植物遭受高鹽、干旱或重金屬等非生物脅迫逆境時(shí)，會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、減產(chǎn)及品質(zhì)降低［1-2］。植物會(huì)通過(guò)一系列防御機(jī)制，來(lái)應(yīng)對(duì)各種傷害，從而增強(qiáng)對(duì)各種非生物脅迫的抵抗能力，幫助植物適應(yīng)環(huán)境，例如積累可溶性滲透物（可溶性糖、甘氨酸甜菜堿等）及合成親水性蛋白，如脫水素（dehydrins，簡(jiǎn)稱DHNs）［3-5］，一種高親水性蛋白質(zhì)，在細(xì)胞核、液泡、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體等植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中廣泛存在［6］，由Dure 最早發(fā)現(xiàn)于 20 世紀(jì) 80 年代［7］。研究表明，在非生物脅迫的抗逆過(guò)程中，脫水素基因扮演著重要的作用［8］，目前研究較多的是廣泛參與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)功能的一類 LEA 蛋白［9］，該類蛋白可與分子伴侶、滲調(diào)蛋白和解毒酶協(xié)同作用，在逆境下調(diào)控植物細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)［10-11］。

據(jù)報(bào)道，DHN 基因與生物的抗逆性密切相關(guān)，當(dāng)植物遭受如干旱、高鹽和溫度脅迫等與細(xì)胞脫水相關(guān)的非生物脅迫時(shí)，DHNs在營(yíng)養(yǎng)組織中大量積累，從而保護(hù)蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞膜等［12-13］。很多研究表明，脫水素與干旱及鹽脅迫的調(diào)控相關(guān)［14］。過(guò)量表達(dá) DHN類基因可以提高擬南芥、水稻、煙草、草莓、 酵母和大腸桿菌等應(yīng)對(duì)抗寒、抗旱或耐鹽能力的非生物脅迫能力［15-18］。水稻植株過(guò)表達(dá) OsDHN1，抗旱和耐鹽性與野生型相比顯著增強(qiáng)［19］。在番茄中，過(guò)量表達(dá)雪蓮 SiDHN基因，可以提高植株的抗旱能力［20］。在小立碗蘚中，PpDHNA 和 PpDHNB 在鹽和甘露醇脅迫下被強(qiáng)烈的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)［21］。與野生型煙草相比，過(guò)表達(dá)枇杷脫水素基因 EjDHN1能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗寒能力［22］。CaDHN5在辣椒中對(duì)鹽脅迫起正調(diào)控作用，此外，也有研究發(fā)現(xiàn) DHNs與重金屬的應(yīng)答和解毒相關(guān)［23］。SiDHN2受低溫脅迫上調(diào)表達(dá)［24］。在芥菜中，煙草中過(guò)表達(dá)的2個(gè)脫水素基因 BjDHN2 和 BjDHN3受重金屬誘導(dǎo)，提高了過(guò)表達(dá)煙草植株對(duì)重金屬 Cd 和 Zn的抵抗能力［25］。在煙草中，過(guò)量表達(dá)玉米脫水素基因 ZmDHN13，有利于提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì) Cu 脅迫的抗性［26］。大麥脫水素基因 DHN3被干旱、ABA 和鹽脅迫誘導(dǎo)［27］。

本研究主要對(duì)馬鈴薯中的DHN基因進(jìn)行鑒定，分析了它們?cè)谌旧w上的分布，對(duì)馬鈴薯中DHN基因啟動(dòng)子區(qū)的順式元件、組織器官表達(dá)模式以及非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行研究，有助于了解DHN基因在馬鈴薯抗逆分子機(jī)制中的作用，為進(jìn)一步對(duì)馬鈴薯的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2022年8月在河北北方學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 馬鈴薯基因組中StDHN成員的鑒定及染色體定位

馬鈴薯基因組信息、蛋白質(zhì)和CDS序列及染色體位置等信息均下載自在線數(shù)據(jù)資源（PGSC，https：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download. shtml）。以含有DHN保守結(jié)構(gòu)域degydrin的HMM模型（PF00257）作為模板在Pfam（http：//pfam. xfam. org/）中搜索，利用HMM 3.0比對(duì)（http：//hmmer. org/download. Html），使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）網(wǎng)站進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到5個(gè)含有degydrin保守結(jié)構(gòu)域的StDHN成員。

根據(jù)基因組的注釋信息和StDHN家族基因成員在染色體上所對(duì)應(yīng)的位置，使用MapChart軟件繪制StDHN基因的染色體位置圖，用Adobe Illustrator 2020軟件進(jìn)行美化處理。

1.3 馬鈴薯StDHN家族成員的序列和結(jié)構(gòu)特征分析

使用Expasy網(wǎng)站（http s：//www. exp asy. org/vg/index/Protein）計(jì)算StDHN成員的氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)分子量（molecular weight，簡(jiǎn)稱MW）以及理論等電點(diǎn)（isoelectric point，簡(jiǎn)稱pI）；將StDHN家族成員序列上傳至CELLO（http：//cello.life. nctu. edu. tw/），進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；使用SOPMA（http：pbil.ibcp.fr/）在線預(yù)測(cè)5個(gè)StDHN蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

使用MEME（http：//meme-suite. org/tools/meme），搜索識(shí)別所有StDHN家族基因的蛋白保守基序（motif）。使用Gene Structure Display Server 2.0（GSDS 2.0 http：//gsds.gao-lab.org/index.php）確定基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)，用Adobe Illustrator 2020軟件進(jìn)行美化處理。

1.4 馬鈴薯StDHN家族成員順式作用元件預(yù)測(cè)

通過(guò)perl腳本檢索，將馬鈴薯基因數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)StDHN基因的啟動(dòng)子序列（5′非翻譯區(qū)上游 1.5 kb）上傳于Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），進(jìn)行搜索檢測(cè)，將順式作用元件按功能歸類后，使用Gene Structure Display Server 2. 0（GSDS 2.0 http：//gsds.gao-lab.org/index.php）將結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 馬鈴薯StDHN家族的表達(dá)模式分析

使用馬鈴薯品種冀張薯8號(hào)組培苗，采用濃度15 % 的PEG處理0、6、12、24 h后，5株混合取樣，試驗(yàn)重復(fù)3次，在液氮中速凍，存放于-80 ℃，提取植株RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于分析干旱脅迫下的表達(dá)模式。在開花期取不同組織（花、根、莖、葉、塊莖、葡匐莖）分析各基因在不同組織中的表達(dá)模式。使用Premier 6.0對(duì)馬鈴薯DHN家族進(jìn)行查找設(shè)計(jì)引物（表1），以elongation factor 1-α為內(nèi)參基因，qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL、上下游引物各 1 μL、SYBR Premix MIX 10 μL。 反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

組織中將莖中表達(dá)量設(shè)為1，干旱脅迫以未處理的材料（0 h）作為對(duì)照，表達(dá)量設(shè)為 1。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算和分析，使用GraphPad Prism 9軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 StDHN的鑒定及染色體分布

通過(guò)生物信息學(xué)方法，利用HMMER進(jìn)行搜索，結(jié)果共鑒定出9個(gè)候選StDHN基因，利用Smart檢測(cè)，去除冗余后，在馬鈴薯中共鑒定出了5個(gè)DHN基因家族成員。

通過(guò)染色體定位分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，StDHN基因在4號(hào)染色體上分布最多，為3個(gè)（PG0003530、PG0003531、PG0015495），1號(hào)染色體上為1個(gè)（PG0030949），7號(hào)染色體上分布1個(gè)（PG0009968）。其中，PG0030949和PG0009968分別位于染色體的下端，PG0003530、PG0003531、PG0015495基因位于染色體中間位置，其余染色體上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)StDHN基因的分布。

2.2 StDHN蛋白的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

由表2可知， StDHN家族成員的氨基酸長(zhǎng)度和理化性質(zhì)存在較大的差異，包括基因名稱、轉(zhuǎn)錄本登錄號(hào)、染色體位置、氨基酸數(shù)量（AA）、分子量（MW）、等電點(diǎn)（pI）和亞細(xì)胞定位。氨基酸長(zhǎng)度為80（PG0015495）～243個(gè)氨基酸（PG0030949）。分子量為8 544.27 ku （PG0015495）至25 121.94 ku （PG0005573），等電點(diǎn)（pI）的范圍為5.24（PG0009968）～7.38（PG0030949）。3個(gè)StDHN氨基酸序列（PG0003530、PG0003531、PG0030949）理論等電點(diǎn)在酸性范圍（pI>7）內(nèi)，2個(gè)PG0009968、PG0015495）理論等電點(diǎn)在堿性范圍（pI<7）內(nèi)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，各成員均定位于細(xì)胞核中。

2.3 StDHN基因結(jié)構(gòu)和motif分析

構(gòu)建基因結(jié)構(gòu)圖譜，結(jié)果（圖2）顯示，該家族成員結(jié)構(gòu)基本相似，內(nèi)含子數(shù)目相同，均只含有1個(gè)內(nèi)含子。為了更全面了解DHN蛋白的保守基序組成元件，利用在線MEME程序，預(yù)測(cè)了DHN蛋白的10個(gè)保守基序。分析發(fā)現(xiàn)，StDHN結(jié)構(gòu)域存在多種組成形式，如motif1和motif 5、motif 8和motif 10，含有3～9個(gè)數(shù)目不等的motif。每個(gè)成員的motif組成相對(duì)保守，每個(gè)基因中均有motif1和motif4，基因結(jié)構(gòu)則較為相似（圖3）。

2.4 StDHN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

StDHN蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本以無(wú)規(guī)卷曲為主，延伸鏈與β-轉(zhuǎn)角的比例相當(dāng)，僅有PG0009968以α-螺旋為主（圖4、表2）。

2.5 馬鈴薯StDHN家族基因的順式作用元件

選取馬鈴薯基因組StDHN家族基因起始密碼子上游1 500 bp進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）表明，在馬鈴薯StDHN家族基因中除啟動(dòng)子區(qū)域的核心元件外，共鑒定出97種不同的順式作用元件，主要由光響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件等組成。在馬鈴薯DHN基因家族含有的啟動(dòng)子元件中光響應(yīng)元件數(shù)量最多，光響應(yīng)元件分布在所有家族成員中，平均每個(gè)基因中有10.4個(gè)。植物激素調(diào)控相關(guān)元件包括茉莉酸響應(yīng)元件為14個(gè)，分布于3個(gè)基因（PG0015495、PG0030949、PG0009968）中；脫落酸響應(yīng)元件10個(gè)，分布于3個(gè)基因（PG0015495、PG0003531、PG0009968）中；赤霉素誘導(dǎo)元件1個(gè)（PG0003531）。逆境脅迫相關(guān)元件包括低溫響應(yīng)元件（PG0030949、PG0003531、PG0009968）、 干旱響應(yīng)元件（PG0030949）等。生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控元件包括胚乳表達(dá)（PG0015495）、種子特異性調(diào)控（PG0003531）、分生組織表達(dá)（PG0003531、PG0009968）等元件。

2.6 StDHN基因組織特異性分析

組織表達(dá)結(jié)果（圖6）顯示，StDHN各個(gè)基因在馬鈴薯不同部位的表達(dá)量存在差異，而且基因間也存在差異。將莖部表達(dá)量設(shè)為1，PG0003531在花中相對(duì)表達(dá)量最高，與莖相比具有極顯著差異，在塊莖中幾乎不表達(dá)；PG0003530在花、塊莖和葡匐莖中的表達(dá)量低于莖中的表達(dá)量，具有極顯著差異；PG0009968在根中的表達(dá)量高于莖，具有極顯著差異，葡匐莖中的表達(dá)量也較高，具有顯著差異；PG0030949在葡匐莖和葉片中表達(dá)量較高，具有極顯著差異；PG0015495基因在各組織中表達(dá)量無(wú)差異。因此，推測(cè)StDHN基因可能會(huì)參與調(diào)控馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育，在不同部位中發(fā)揮了作用。

2.7 StDHN基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

為了研究DHN家族基因在干旱處理下的表達(dá)模式，在馬鈴薯中進(jìn)行熒光定量分析。結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)，PG0015495基因積極響應(yīng)干旱脅迫，受到干旱脅迫時(shí)表達(dá)量均高于0 h，在24 h時(shí)達(dá)到最高，與 0 h 相比具有極顯著差異；PG0003530基因受到干旱脅迫時(shí)，表達(dá)受到抑制，與0 h相比，均低于0 h的表達(dá)量，其中6 h和12 h時(shí)與0 h相比具有極顯著差異；在干旱脅迫時(shí)，PG0030949表達(dá)趨勢(shì)先升高后降低，在6 h時(shí)顯著高于0 h，在12 h和24 h時(shí)基因表達(dá)量降低，低于0 h；PG0003531和PG0009968基因表達(dá)趨勢(shì)一致，與0 h相比沒(méi)有顯著差異。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，DHN基因參與了非生物脅迫的響應(yīng)對(duì)植物的抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育等起著重要的作用。根據(jù)報(bào)道，其中蘋果中的DHN家族成員數(shù)量最多，共有12個(gè)成員［28］；最少的為葡萄［29］和黃瓜［30］，僅有 4 個(gè)成員；梨［31］和獼猴桃［32］中均鑒定到 7個(gè)成員；蘿卜［33］中鑒定到 11 個(gè)成員，目前，馬鈴薯DHN家族基因還未被研究。本研究在馬鈴薯中共鑒定出5個(gè)StDHN基因，與前人在蘋果、葡萄、黃瓜、梨、獼猴桃、蘿卜等物種中鑒定出的個(gè)數(shù)有所不同，數(shù)目較少，通過(guò)對(duì)該家族成員的基因復(fù)制事件分析，發(fā)現(xiàn)該基因家族不存在片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)，推測(cè)這可能是該基因家族較少的原因之一。

在本研究中，馬鈴薯DHN家族基因的等電點(diǎn)為5.24～7.38，與已經(jīng)報(bào)道的擬南芥、番茄、煙草、白菜的結(jié)果一致，說(shuō)明其編碼的蛋白具有相似的功能。馬鈴薯5個(gè)StDHN基因家族均含有1個(gè)內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)高度一致，說(shuō)明DHN可能存在相似的生物學(xué)功能。本研究利用SMART網(wǎng)址分析馬鈴薯DHN的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，所有的DHN蛋白均包含Dehydrin結(jié)構(gòu)域。通過(guò)分析motif發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯DHN家族基因含有3～9個(gè)數(shù)目不等的motif，每個(gè)基因中均有motif1和motif 4，組成相對(duì)保守，推測(cè)該基因家族在功能保守的同時(shí)，不同的基因的功能發(fā)生分化。通過(guò)啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯DHN家族基因在激素響應(yīng)、逆境脅迫、光調(diào)控及生長(zhǎng)發(fā)育等方面可能發(fā)揮著一定的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，StDHN家族成員PG0003531、PG0003530、PG0009968在不同的器官中表達(dá)具有顯著差異，因此，推測(cè)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中該基因可能參與馬鈴薯的生長(zhǎng)調(diào)控，在不同部位的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了作用。分析馬鈴薯DHN家族基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理時(shí)，PG0015495、PG0003530、PG0030949基因與對(duì)照相比具有不同的響應(yīng)模式，說(shuō)明馬鈴薯DHN基因廣泛響應(yīng)干旱脅迫。

分子抗性育種是馬鈴薯育種中的重要課題之一，馬鈴薯基因組測(cè)序的完成和不斷完善，為深入研究這些基因的功能以及上游和下游的調(diào)控蛋白提供了基礎(chǔ)，本研究通過(guò)對(duì)StDHN家族基因的分析，為今后提高馬鈴薯的耐旱性和改良馬鈴薯耐旱新品種提供理論依據(jù)，StDHN家族的功能及通過(guò)何種途徑提高馬鈴薯的抗性仍需進(jìn)一步研究闡明。

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收稿日期：2022-10-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-09-P05）；河北省張家口市基礎(chǔ)研究和人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2221015A）；

河北省教育廳自然科學(xué)類青年項(xiàng)目（編號(hào)：QN2021011）；

河北省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（編號(hào)：［2016］5號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：紀(jì)藝紅（1990—），女，河北張家口人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)榉肿涌鼓嬗N。E-mail：281030822@qq.com。

通信作者：王 磊，博士，講師，研究方向?yàn)轳R鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail：wanglei@hebeinu.edu.cn。