王書琦 綜述 武衛(wèi)東 審校

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)一直是世界范圍內嚴重危害健康的疾病,也是臨床研究的焦點。近年來,AKI的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢[1]。AKI增加了慢性腎臟疾病( kidney disease,KD)、心血管疾病和終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)的潛在風險[2]。AKI的治療方法主要包括糾正電解質紊亂、避免腎毒性藥物和腎臟替代治療[3]。然而,AKI發(fā)生發(fā)展的具體機制尚不清楚。目前還沒有有效的治療方法來預防AKI的發(fā)生。因此,有必要深入研究AKI的具體發(fā)病機制,為臨床治療開發(fā)新的治療方法。

細胞死亡是每一個細胞的終點,是無法逆轉的功能終結,研究認為,細胞凋亡是急性腎損傷(AKI)和腎移植中大多數(shù)死亡細胞的罪魁禍首[4]。在多細胞生物體中,程序性細胞死亡在調節(jié)個體細胞發(fā)育和成體生活中起著重要作用。已發(fā)現(xiàn)多種機制的程序性細胞死亡以不同方式發(fā)揮作用。細胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶(caspase)介導的一種程序性細胞死亡。如果細胞凋亡是AKI的驅動機制,caspase的藥物抑制將防止腎小管細胞死亡,但這一點尚未得到驗證。細胞凋亡的干預對AKI的預后并無改善,因此,在過去的十年里,人們提出了其他細胞死亡途徑?，F(xiàn)有研究表明,壞死性凋亡與鐵死亡等都參與AKI的發(fā)生和發(fā)展[5]。本文對壞死性凋亡及鐵死亡途徑在AKI中的作用機制研究進展進行綜述。

1 壞死性凋亡

當細胞受到過多的應激,如熱、缺血和感染時通常會發(fā)生壞死。傳統(tǒng)上,壞死被認為是被動和無規(guī)則的,與傳統(tǒng)觀念相反,所謂壞死性凋亡,是一種受控制的細胞死亡形式,形態(tài)學上表現(xiàn)為細胞膜穿孔,胞漿腫脹,線粒體功能障礙,核染色質缺失,質膜發(fā)生破裂,胞內內容物外溢[6]。由于在細胞死亡過程中,形態(tài)與壞死極為相似,被稱為壞死性凋亡。壞死性凋亡可被死亡受體的配體激活,并在細胞凋亡不足的情況下誘導死亡受體配體的表達。死亡受體配體激活壞死性凋亡需要受體相互作用蛋白1(RIP1)的激酶活性,RIP1介導受體相互作用蛋白3(RIP3)和混合譜系激酶域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)的激活,RIP3和MLKL是壞死性凋亡的2個關鍵下游介質。核黃素是RIP1的小分子抑制劑,其抑制RIP1的作用可以阻止壞死性凋亡的發(fā)生和細胞的存活。

1.1 壞死性凋亡的傳導通路 過去10年,壞死性凋亡途徑的復雜機制細節(jié)已被闡明[7],腫瘤壞死因子(TNF)家族成員、Toll樣受體激活(TLRs)及其他病原微生物等因素都可能觸發(fā)壞死性凋亡,目前TNF與其受體結合所介導的激活途徑研究較多。這種死亡通過腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor-1,TNFRI)發(fā)出信號死亡,形成腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白(tumor necrosis factor receptor associated death domain protein,TRADD),TRADD 募集受體相互作用蛋白激酶(RIPK),當RIPK1被去泛素化酶(cylindromatosis,CYLD)去泛素化,同時TRADD解離,結合Caspase-8和Fas相關死亡域蛋白(FADD),若Caspase-8活化,啟動細胞凋亡。若Caspase-8被抑制,RIPK1募集RIPK3通過磷酸化形成被稱為“壞死小體”的復合物[8],移位至細胞膜,導致其破裂,進而觸發(fā)凋亡性壞死。因此,Caspase-8似乎既可以作為細胞凋亡的起始者,也可以作為壞死性凋亡的抑制者。

ESCRT-Ⅲ復合體是一種膜修復機制,通過從細胞表面萌發(fā)含有磷酸MLKL(PMLKL)的囊泡來對抗壞死性凋亡的執(zhí)行,從而保持質膜的完整性。 研究表明,MLKL是唯一已知的壞死性凋亡的下游效應因子[9],近年來通過越來越多的證據(jù)表明,PMLKL是執(zhí)行壞死性凋亡所必需的,RIPK3可能不僅可以作為壞死性凋亡的調節(jié)靶點,還可以作為由壞死性凋亡引起的疾病的生物標志物。有關研究表明AKI或敗血癥危重患者血漿中的RIPK3水平與疾病活動呈正相關[10-11]。

1.2 壞死性凋亡與AKI Linkermann等[12]在缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,IRI)模型中觀察到RIPK1、RIPK3表達升高,在RIPK3二聚化后20 min內應用壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1(Nec-1)可以明顯改善腎功能,RIPK1抑制劑如索拉非尼和苯妥英鈉[13],均可通過抑制RIPK1活性而緩解IRI所致的AKI。

順鉑的毒性長期以來一直被認為是一種腎毒性和DNA損傷的化合物。最近,由Rob-ERT Safirstein團隊發(fā)現(xiàn),在最初應用順鉑后,腎臟中RIPK3和MLKL蛋白上調,增加了對反復損傷的敏感性,從而增加了對壞死性凋亡的敏感性。TNFR超家族成員Fas也被證明在離體腎小管中介導順鉑毒性[14]。研究發(fā)現(xiàn)使用Nec-1可以延緩腎小管上皮細胞的死亡,一定劑量的漢黃芩素可延緩順鉑誘導的AKI。在結石所導致AKI的樣本中,研究者通過免疫熒光法檢測到了磷酸化的MLKL。當晶體引起的壞死最初被認為是壞死性凋亡的結果時,研究者發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞中RIPK1 和RIPK3蛋白的表達可被晶體誘導[15],但尚不清楚多大劑量的葉酸(FA)可能會誘導腎腔內的結晶,而高劑量的FA可能會進一步破壞腎小管上皮。在FA-AKI小鼠模型中觀察到高水平的腎臟脂質過氧化。給予Fer-1后腎臟的功能和結構較對照組有明顯緩解的趨勢。進一步證實,在晶體誘導的AKI過程中,依賴RIPK3的中性粒細胞胞外陷阱(Nets)的釋放可以成為壞死性凋亡抑制劑的靶點[16]。另有研究發(fā)現(xiàn),依賴RIPK3-MLKL的Nets也促進了小鼠和人類ANCA相關性血管炎(AAV)的發(fā)生[17]。在膿毒癥所致的AKI模型中,通過使用Nec-1可緩解腎小管上皮細胞的自噬[15]。在慶大霉素誘導的AKI模型中,MLKL表達升高,提示出現(xiàn)壞死性凋亡?？傊?在多種因素造成AKI的模型中,都可以觀察到有壞死性凋亡發(fā)生,如果可以從上游抑制壞死性凋亡,將是阻止各種疾病導致AKI的重大進展,但目前尚無針對壞死性凋亡靶向治療AKI的藥物。

2 鐵死亡

鐵死亡是一種由過度脂質過氧化介導的鐵依賴細胞死亡方式[18],Ferrostatin-1是首個被發(fā)現(xiàn)的鐵死亡抑制劑。谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)、FPN1、SLC7A11以及Nrf2等基因已被證明在鐵死亡中發(fā)揮重要作用。然而鐵死亡從基因到蛋白質再到細胞的完整途徑仍不清楚。其特征可以概括為一個中心、兩個特征和四個方面。其中一個中心是指脂質活性氧(ROS)的積累;兩個特征是指細胞抗氧化劑的破壞和細胞內鐵水平的提高,從而導致有害的脂質ROS的沉積;四個方面是鐵的代謝紊亂,脂質過氧化物的積累,以及Gpx4和System-Xc的消耗(半胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白系統(tǒng))。鐵死亡的特征不同于其他細胞死亡類型,嗜鐵細胞的形態(tài)主要表現(xiàn)為線粒體改變,包括體積減小,膜密度增加,線粒體嵴減少,大量鐵離子分布在線粒體和內質網(wǎng)中,但細胞膜保持其完整性,細胞核大小保持正常[19]。

2.1 鐵死亡機制與調控

2.1.1 Gpx4:Gpx4是谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)家族成員,它的主要生物學作用是保護生物體免受氧化損傷。Gpx4被發(fā)現(xiàn)在鐵死亡中起關鍵作用。作為一種高效的還原酶,Gpx4通過谷胱甘肽(GSH)將有毒的過氧化脂質(L-OHO)轉化為無毒的脂醇(L-OH),從而抑制脂質過氧化的擴散和過氧化脂質的積累[20-21]。此外,細胞內GSH的消耗顯著降低了Gpx4的活性,導致脂質過氧化和細胞鐵死亡。Gpx4催化脂質過氧化還原并間接干擾Fenton反應[22],Fenton反應是維持細胞內過氧化氫(H2O2)含量的重要因素。高濃度的H2O2會產生ROS,并迅速氧化脂肪酸(FAs)和花生四烯酸(AA)產生脂毒性物質。許多研究表明,Gpx4的抗氧化功能是死亡的中心環(huán)節(jié)[23]。因此,影響Gpx4功能和活性可能會顯著影響鐵死亡的發(fā)生。

鐵死亡抑制蛋白1(FSP1),也被稱為凋亡誘導因子線粒體2,通過肉豆蔻酸結合基序被募集到質膜上[24]。它是一種不依賴Gpx4預防鐵死亡的物質。它作為一種氧化還原酶來預防鐵死亡,產生捕捉自由基的抗氧化劑,從而抵消脂質過氧化。然而,目前尚不清楚該系統(tǒng)在多大程度上與腎小管細胞中的Gpx4系統(tǒng)相關。

2.1.2 System-Xc途徑:System-Xc是一種廣泛表達于細胞膜上的氨基酸轉運體,其活性亞基為SLC7A11。Cys通過System-Xc交換進入細胞內,促進GSH的合成[25]。因此,促進System-Xc的功能可抑制鐵死亡。研究顯示,SLC7A11調節(jié)的半胱氨酸攝取促進GSH和Gpx4蛋白的合成,最終抑制鐵死亡[26]。此外,虎杖苷可以劑量依賴性地減輕System-Xc抑制劑誘導的細胞死亡[27]。另一項研究表明,下調連接蛋白43(Cx43)可以通過恢復SLC7A11水平來抑制鐵死亡,從而減輕順鉑誘導的AKI[28]。一些藥物,如柳氮磺胺吡啶和鐵死亡誘導劑 Erastin可以通過阻斷System Xc- 來誘發(fā)鐵死亡[29]。

2.1.3 鐵代謝、脂質過氧化:鐵是人體內最重要的微量元素之一,其動態(tài)平衡對細胞的正常生理功能非常重要[30]。人體內吸收和紅細胞降解產生的鐵離子主要被氧化成Fe3+與轉鐵蛋白結合,通過Tf受體1(TFR1)形成“Tf-Fe3+-TFR1”的復合體進入細胞內,在細胞內的Fe3+進一步被還原酶STEAP3還原為二價鐵并儲存在鐵池中[31]。當細胞中二價鐵過載時,將通過Fenton反應產生過量ROS,進而啟動鐵死亡發(fā)生[32]。而鐵蛋白可以將Fe2+轉化為Fe3+儲存在鐵蛋白殼中,從而減少因為鐵過載所導致的鐵死亡。鐵蛋白可分為鐵蛋白輕鏈(FTL)和鐵蛋白重鏈(FTH),在某些生理和病理條件下,易患鐵死亡的細胞表現(xiàn)為TFR表達上調,鐵蛋白(包括FTH1和FTL)表達下調,表明增加鐵攝取或減少鐵的儲存形式可導致鐵死亡[33]。研究表明涉及酰基輔酶a合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)的脂氧合酶依賴性酶途徑的激活在脂質過氧化中起關鍵作用,其可通過促進氧化的細胞膜磷脂的積累來驅動鐵死亡。有學者通過使用CRISPR/Cas9技術,發(fā)現(xiàn)在鐵死亡敏感的小鼠細胞中ACSL4對Erastin誘導的細胞死亡具有保護作用,認為ACSL4既是急性腎功能衰竭中體內調節(jié)細胞死亡方式的預測生物標志物,也是藥效學標志物,從而為臨床監(jiān)測和診斷鐵死亡介導性疾病提供了重要的研究價值[20]。許多親脂性抗氧化劑(如FER-1、β-胡蘿卜素、Liproxstatin-1、和α-生育酚)以及某些酶系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶、輔酶Q和GPX,可以清除多余的ROS以防止組織損傷[34]。但是目前對于鐵死亡抑制劑的應用大多是動物研究,缺少臨床數(shù)據(jù),因此未來在臨床上對于鐵死亡相關AKI的防治仍需要進一步探討。

2.2 鐵死亡與AKI 最初,細胞凋亡被認為是AKI的主要細胞死亡類型。然而最近的研究表明,鐵死亡可能是各種類型所致AKI的主要死亡途徑[35],體內和體外實驗表明鐵死亡抑制劑對緩解腎臟損傷有效。當FTH基因敲除小鼠發(fā)生橫紋肌溶解(RM)誘導的AKI時,病死率增加,表明FTH在AKI腎損傷中起重要作用。RM大鼠腎細胞胞漿和線粒體中的血紅素和游離鐵水平以及腎組織中的脂質過氧化水平顯著增加[36]。姜黃素被發(fā)現(xiàn)可抑制鐵死亡和有效改善RM導致的腎功能下降[37]。研究表明,缺鐵可通過增加催化血紅素鐵來加重RM誘導的AKI,糾正缺鐵可減少所有類型的AKI[38]。

IRI所致的AKI相關性鐵死亡是由線粒體細胞因子肝再生增強因子(ALR)介導的,而ALR與Gpx4系統(tǒng)有關。沉默ALR基因會降低Gpx4活性,并促進鐵死亡[39]。褪黑素和恩他卡朋被證實可上調Nrf2的核轉位,導致下游SLC7A11的表達增加,并顯著抑制氧化應激和鐵死亡[40]。最近的研究表明,右旋糖苷可以通過抑制ACSL4減輕鐵死亡誘導的AKI[41]。有關研究表明,通過抑制肌醇需要酶1(IRE1)/c-Jun NH2末端激酶(JNK)通路,可以通過抑制鐵死亡來保護IRI所致的腎臟損傷[42]。Michael等發(fā)現(xiàn)藥物抑制鐵死亡可以改善嚴重IRI后的不良適應性腎臟反應和纖維化[43]。各種研究表明,鐵絡合劑和其他鐵蛋白抑制劑可以減輕IRI引起的腎臟損傷,與鐵死亡相關的調節(jié)因子的失活會導致或加重AKI。

高劑量的FA被廣泛用于誘導動物腎臟疾病。腎臟中的高水平FA可嚴重損害細胞抗氧化系統(tǒng),導致氧化還原失衡和氧化應激加劇。給予Fer-1可預防AKI,減輕炎性反應,表明鐵死亡是FA誘導的AKI損傷的主要途徑[44]。

Fer-1可顯著減輕敗血癥導致的AKI[45]。最近的一項研究還表明,鳶尾素可增加GSH水平以及改變腎組織中Gpx4和ACSL4的表達來抑制膿毒癥小鼠的鐵死亡和改善腎功能[46]。褪黑素治療已被證明通過上調Nrf2/HO-1途徑抑制鐵死亡和減輕膿毒癥引起的AKI[47]。在慶大霉素、甘油和環(huán)孢素等藥物誘導的急性腎損傷中,活性氧和過氧化氫的生成增加。同時,GSH和血紅素加氧酶(HO-1)等抗氧化防御機制也發(fā)生了變化。重癥急性胰腺炎(SAP)誘導的AKI后,鐵蓄積,脂質過氧化增加,鐵死亡相關蛋白和基因上調。Liproxstatin-1治療可減輕SAP大鼠的胰腺和腎臟組織病理學損傷[48]。

3 結 論

目前研究已證實AKI中涉及多種形式的調控性細胞死亡,抑制其中一種細胞死亡形式可能延緩或逆轉腎功能的衰竭,但這種保護作用并不全面。研究表明,對一種途徑敏感的細胞可以通過另一種途徑抵抗死亡,一條受調控的壞死通路可以補償另一條途徑不同的細胞死亡形式。在某些AKI病例中,鐵死亡與壞死性凋亡這2條受調控的壞死途徑似乎獨立且平行地起作用。理想情況下,對這2條通路都有內源性抑制潛力的化合物,如NEC-1,可能是最利于治療受這2條途徑調控的AKI。同樣,這樣的策略也適用于其他實質臟器,如肝臟和肺。未來的研究將集中在壞死性凋亡和鐵死亡的具體途徑,每條途徑之間的相互作用,以及其他形式的細胞死亡之間的內在聯(lián)系。盡管許多動物實驗表明靶向是有效的,但動物模型和人類是不同的,還需要更多的研究來證實這種策略在體內也是有效的。此外,壞死性凋亡與鐵死亡能在多大程度上作為恢復AKI的治療靶點是未來研究的重點。