基于敏感肌形成機制的舒緩成分評價方法研究

袁春穎，韓婷婷，李 燕，姜姍姍，劉三嶺，冷佳蔚，楊素珍*

（1. 山東福瑞達生物股份有限公司，山東 濟南 250101；2. 山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

敏感性肌膚是一種特殊的皮膚類型，不屬于皮膚病的范疇。敏感肌易出現(xiàn)皮膚干燥、泛紅、脫屑、紅斑、丘疹、腫脹、膿包、水皰、毛細血管擴張等客觀癥狀，同時也易出現(xiàn)瘙癢、刺痛、灼燒、緊繃等主觀癥狀；更有甚者，當皮膚敏感情況嚴重時，也可能出現(xiàn)負面情緒或精神癥狀。根據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，皮膚敏感已成為皮膚的一種常態(tài)，亞洲女性中敏感性肌膚人群比例已超過50 %[1]；在全球范圍內(nèi)，有高達71 %普通成年人發(fā)生某種程度的肌膚敏感，而40 %人群有中度或重度的肌膚敏感[2-3]。

敏感肌的產(chǎn)生是一個復雜的過程，由外而內(nèi)涉及皮膚表面的微生態(tài)屏障、表皮屏障、神經(jīng)系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)等多個方面，改善敏感肌常需通過皮膚護理、調(diào)整生活習慣、避免接觸刺激源等方式緩解或避免。目前市面上用于改善肌膚敏感的原料和護膚產(chǎn)品眾多，效果也參差不齊，因此，建立全面有效的功效評價體系是一項亟待完善的工作。本文從敏感肌的形成機制出發(fā)，介紹了包括細胞、3D模型、動物和人體等4個維度上的功效靶點和檢測方法，為舒緩、抗敏感功效成分的研發(fā)提供科學依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 皮膚敏感機制

1.1 基于微生態(tài)失衡的皮膚敏感機制

皮膚是人體最大的器官，其表面環(huán)境與微生物群落組成的微生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了皮膚的第一道屏障[4-5]，微生物群落的組裝、穩(wěn)定和功能的執(zhí)行由宿主和微生物之間相互作用來驅(qū)動。當皮膚微生物群與宿主和外部環(huán)境平衡穩(wěn)定時，皮膚表現(xiàn)為健康狀態(tài)；若皮膚微生物群與宿主和外部環(huán)境失衡時，皮膚屏障受損，則出現(xiàn)各種皮膚問題[6-7]。如在特應(yīng)性皮炎（AD）患者的皮膚中檢測出金黃色葡萄球菌的豐度更高，表皮屏障受損更嚴重，白介素4（IL-4）、白介素13（IL-13）、白介素22（IL-22）、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（TSLP）和其他與AD相關(guān)的細胞因子的表達升高[6]，加劇皮膚炎癥。因此，穩(wěn)定皮膚微生態(tài)，是改善敏感肌的一大重要關(guān)注點。

1.2 基于表皮屏障功能受損的皮膚敏感機制

狹義上的皮膚屏障一般指表皮層，尤其是與角質(zhì)層結(jié)構(gòu)相關(guān)的屏障功能，干燥、脫屑等癥狀均是敏感肌膚最直接的表現(xiàn)。其原因主要是外界刺激后，角質(zhì)細胞排列錯亂，細胞間基質(zhì)成分破壞降解，角化包膜不能正常形成，導致角質(zhì)層結(jié)構(gòu)改變，通透性增加、水分的維持能力受損、屏障功能異常。表皮屏障功能受損不僅與特應(yīng)性皮炎、銀屑病、黃褐斑、痤瘡等疾病[8]的發(fā)生密切相關(guān)，同樣也是敏感肌形成的重要原因，因此，為改善皮膚的敏感情況，需著重關(guān)注皮膚表皮屏障功能的損傷及修復情況。

表皮層形態(tài)及結(jié)構(gòu)的完整是發(fā)揮屏障功能的基礎(chǔ)，任何結(jié)構(gòu)受損均直接或間接導致敏感肌或加重敏感癥狀。何黎等[9]構(gòu)建了長鏈非編碼RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）的共表達網(wǎng)絡(luò)，通過全基因組測序篩選敏感肌膚與非敏感肌膚的差異基因，發(fā)現(xiàn)IncRNA LNC 000265這一的差異化最大，它與編碼緊密連接蛋白5的序列具有高度相關(guān)性，緊密連接蛋白5在真表皮連接處發(fā)揮至關(guān)重要的作用；兜甲蛋白、外周蛋白和富含脯氨酸的小蛋白在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1，3和5的催化下與神經(jīng)酰胺發(fā)生交聯(lián)，形成角化包膜，保護和防止水分流失[10]；絲聚蛋白在角質(zhì)細胞從顆粒層向角質(zhì)層過渡的過程中，被多種酶（如基質(zhì)蛋白酶、弗林蛋白酶、成對氨基酸轉(zhuǎn)化酶-4）去磷酸化，聚集角蛋白的中間細絲，形成最外層的角質(zhì)屏障[11]；除此之外，內(nèi)膜蛋白水通道蛋白3可在細胞膜上形成“孔道”，像細胞的“水泵”一樣控制水的進出[12]。表皮屏障的正常功能不僅依賴于其正確的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還需有充足且完整的生化成分。透明質(zhì)酸是細胞外基質(zhì)的最大成分，具有非常強的水結(jié)合能力；皮膚中天然存在的神經(jīng)酰胺可形成防水屏障，減少水分流失，而神經(jīng)酰胺鏈長度減少對角質(zhì)層的滲透性有很大的負面影響，特應(yīng)性皮炎患者中有觀察到神經(jīng)酰胺鏈長度減少[13-14]。

1.3 基于神經(jīng)反應(yīng)的皮膚敏感機制

敏感皮膚中的感覺受體在接觸到外界刺激時，經(jīng)神經(jīng)末梢與神經(jīng)元的逐級信號傳遞，最終在大腦皮層形成疼痛、瘙癢等感覺，若皮膚的神經(jīng)反應(yīng)性過于敏感，感覺受體表達異常，均有可能導致皮膚敏感。Misery等[15]發(fā)現(xiàn)瞬時受體蛋白（TRP）的激活與Ca2+調(diào)控通道密切相關(guān)，非興奮細胞外的Ca2+濃度低，膜內(nèi)外濃度差小，便無法形成感受電位，當受到刺激時，Ca2+內(nèi)流，膜內(nèi)外濃度差變大，產(chǎn)生動作電位，神經(jīng)遞質(zhì)傳遞從而介導疼痛等神經(jīng)變化。刺激源不同會激活不同的瞬時性受體電位通道（TRPV），從而傳遞不同的神經(jīng)信號：辣椒素或熱源可激活辣椒素受體（TRPV1）[16]，傳遞熱感或灼燒感；激活瞬時性受體電位通道4則引起瘙癢與疼痛感[17]；TRPM8主要傳遞冷感[18]。臨床試驗結(jié)果表明，敏感肌膚的表皮內(nèi)神經(jīng)纖維的數(shù)量明顯減少，C纖維和Aδ纖維群也發(fā)生了改變[15,19]。

1.4 基于炎癥反應(yīng)的皮膚敏感機制

與正常皮膚相比，敏感性皮膚對外源性刺激和過敏原的攻擊防御能力相對較差，很容易因刺激或過敏而產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)[20]。據(jù)報道，美國兒童和成人群體中AD的流行率分別為11.3 %～12.7 %和6.9 %～7.6 %[21]。白介素（IL）是白細胞或免疫細胞間相互作用的最主要淋巴因子，參與不同的信號通路調(diào)控各類生理活動。IL-14和IL-13 兩型細胞因子能促進趨化因子的產(chǎn)生、誘導皮膚屏障功能障礙、抑制抗菌肽的表達[22-23]；IL-31可促進腦源性利鈉肽的產(chǎn)生和釋放，調(diào)控致炎因子和趨化因子釋放，誘導AD患者的瘙癢感[24]；IL-17能減少絲聚蛋白和外披蛋白的表達，加劇皮膚的屏障損傷[25-26]。區(qū)別于T淋巴細胞產(chǎn)生的多種細胞因子，IL-33是在皮膚遭受感染、炎癥或損傷時由各種組織的駐留細胞產(chǎn)生，通過影響造血干細胞的功能引發(fā)炎癥，與非炎癥皮膚相比，AD患者皮膚中IL-33的表達水平大幅升高[27]。

2 改善敏感肌成分的評價方法研究

2.1 基于微生態(tài)平衡的改善敏感肌成分的評價方法

目前在化妝品中人為干預(yù)或調(diào)控皮膚微生態(tài)平衡、增加菌群多樣性的方法主要是添加應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)開發(fā)的益生菌、益生元、后生元和合生元等，屈暢[28]指出對微生物的菌群豐度及多[29-30]樣性進行檢測是反映化妝品原料干預(yù)效果最直觀的評價形式?；诟纳破つw微生態(tài)的原料評價思路可概括為采樣-檢測-分析3個階段。常用的采樣手段主要有無菌棉簽擦拭皮膚進行大規(guī)模采樣、膠帶粘取或剝脫收集表層皮膚樣本、針孔穿刺取樣等[30]。對于菌群的檢測手段經(jīng)歷了從凝膠平板技術(shù)和低聚糖生物選擇性技術(shù)到DNA測序技術(shù)的精確性跨越。通過凝膠平板培養(yǎng)活菌菌落，對其進行分離、計數(shù)和鑒定是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，但是受限于實驗室條件不能完美復原或?qū)崿F(xiàn)菌種的最優(yōu)生長環(huán)境，可實現(xiàn)體外培養(yǎng)的菌種有限；房曉[29]用大多數(shù)共生菌群均能利用低聚糖做為碳源，利用致病菌群則沒有代謝低聚糖能力的這一特性，對基體中碳殘留量進行對比，間接反映共生菌與致病菌的生存及定殖情況，但它僅能依據(jù)低聚糖的種類將菌種的范圍鑒定在屬水平。DNA測序技術(shù)彌補了以上兩種方法的缺陷，傳統(tǒng)的測序方法如擴增子測序，利用保守的基因序列進行擴增，通過擴增循環(huán)數(shù)間接反映含量變化，如細菌多采用16S核糖體RNA（16S rRNA），真菌則優(yōu)選內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）為各自的保守序列進行擴增[31-32]，根據(jù)擴增子的測序分析可確定屬和物種水平的群落組成及變化。近年，隨著重大技術(shù)和分析方法突破，利用鳥槍法宏基因組測序成為可能，不需靶向序列擴增，且不需對特定目標區(qū)域進行測序，即可同時捕獲包括人類、細菌、真菌、古細菌和病毒樣本中的所有遺傳物質(zhì)[33-36]，揭示其在界和菌株水平上的相對豐度。

2.2 基于表皮屏障功能的改善敏感肌成分的評價方法

針對表皮屏障功能相關(guān)的靶點，可在人體、離體皮膚、皮膚外植體、3D全層皮膚模型、3D表皮模型及2D細胞上進行不同維度的生物及化學方法檢測。基于離體皮膚、皮膚外植體、3D全層皮膚模型、3D表皮模型，可直觀地在顯微鏡下觀察角質(zhì)細胞排列狀況判斷屏障結(jié)構(gòu)的完整性，在此基礎(chǔ)上升級的蘇木精-伊紅（HE）染色法，通過顏色變化可更為直觀地觀察到角質(zhì)層厚度變化及角質(zhì)形成細胞的活性。對于各個靶標蛋白的檢測方法則更多元化，如對某一目標蛋白進行特異的熒光染色，目前常用的標記染料如FITC、GFP等，根據(jù)其熒光面積及強度分析目標蛋白的表達是否增加；蛋白免疫印跡技術(shù)（western blotting）可在提取的總蛋白中特異性標記出目的蛋白，通過比較目的蛋白的灰度即可判斷相應(yīng)蛋白的表達量，與此原理相似的方法還有酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），同樣可精準識別并定量總蛋白中的特異性目的蛋白。通過滲透實驗，根據(jù)熒光染料進入皮膚模型的情況確定表皮的通透性，若進入模型的染料增多，則皮膚的通透性增大?；谕该髻|(zhì)酸鈉、神經(jīng)酰胺、長鏈/短鏈脂肪酸、天然保濕因子等細胞間各生化成分的檢測，可采用紫外檢測、高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用[37-38]等方法；雷曦利用ATP或底物剩余量的酶促反應(yīng)動力學實驗檢測透明質(zhì)酸酶的抑制率，其抑制率越高，屏障修護功效越強[39]。

離體皮膚資源較難獲得，皮膚外植體及3D皮膚模型的普及和使用難度較高，基于2D細胞層面的功效評價較容易實施與開展。在2D細胞層面，通過噻唑藍（MTT）比色法、Cell Counting Kit-8（CCK-8）、中性紅染色等常規(guī)方法檢測細胞活性與增殖情況；通過細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移率，多角度驗證功效成分對皮膚特征性細胞的直接作用。收集功效成分干預(yù)后的細胞，破碎提取其總蛋白，利用Western Blotting、特異性熒光染色、ELISA等方法繼續(xù)特定蛋白的表達檢測，同時還可裂解細胞提取總RNA，用實時熒光定量PCR方法進行基因?qū)用娴姆治雠c檢測。

在人體維度，除了借助調(diào)查問卷通過消費者的自我評估獲得相應(yīng)數(shù)據(jù)外，還可借助儀器測量獲取直觀數(shù)據(jù)，如皮膚水分測試儀（corneometer）可檢測功效成分使用前后皮膚含水量的變化，VISIACR可對采取面部成像進行紅區(qū)的a*值分析；經(jīng)皮水分散失值（TEWL）則可利用經(jīng)皮水分散失測試儀（如aqua flux）獲得。

2.3 基于神經(jīng)反應(yīng)的改善敏感肌成分的評價方法

對具有神經(jīng)舒緩功效的成分進行評價時，可從神經(jīng)鎮(zhèn)靜的角度出發(fā)，鎮(zhèn)靜效果越好，則舒緩功效越強，主要思路是通過比較原料作用前后相關(guān)神經(jīng)纖維的密度、受體蛋白的表達或激活水平及Ca2+電位變化進行評估，其神經(jīng)纖維的密度越接近于正常肌膚，感覺受體蛋白的激活與表達數(shù)量越少，Ca2+的內(nèi)流情況得到抑制，則舒緩功效越強。

劉棟等[40]借助Ca2+選擇性微電極進行穿刺，檢測內(nèi)充液在細胞內(nèi)外的電位差，檢測功效成分的舒緩功效；劉麗娜等[41]用放射性同位素標記Ca2+，檢測含量變化；劉麗娟等[42]用Fura2、Indol、Fluo-4AM等熒光指示劑標記Ca2+，通過流式細胞儀、熒光分光光度計或熒光顯微鏡聯(lián)合檢測Ca2+變化。針對受體表達方面，Scandolera等[43]開發(fā)了正常人星形膠質(zhì)細胞的炎癥模型模擬敏感皮膚中與神經(jīng)炎癥相關(guān)的疼痛感應(yīng)，并證實紅色微藻提取物中的γ-氨基丁酸（GABA）及其結(jié)構(gòu)衍生物GABA-丙氨酸能抑制TRPV1的表達，緩解敏感；Zhou等[44]利用角質(zhì)形成細胞的炎癥模型發(fā)現(xiàn)柑橘果實提取物能通過抑制TRPV1激活，緩解辣椒素、乳酸、苯氧乙醇等引發(fā)的神經(jīng)高反應(yīng)，增強皮膚的耐受性。

2.4 基于炎癥反應(yīng)的改善敏感肌成分的評價方法

炎癥導致皮膚的血管增生、口徑增大，斑馬魚炎癥誘導試驗可用于觀察降低炎癥因子IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達后血流速度與血管口徑的變化[45]；此外，小鼠實驗表明痔九味鎮(zhèn)痛膏能有效抑制皮膚毛細血管通透性增加，對祛腫功效評價有一定借鑒意義。在炎性滲出過程中，白細胞通過黏附因子與內(nèi)皮細胞先發(fā)生粘連游出，然后在趨化因子和細胞因子的牽引下向炎區(qū)移動，因此黏附因子、趨化因子的表達情況也間接反映了白細胞的流出與趨化情況。潘虎[46]通過培養(yǎng)體外鼻息肉和皮膚組織，檢測到組胺和花生四烯酸能誘導單核細胞趨化因子蛋白-1（MCP-1）、單核細胞趨化因子蛋白-3（MCP-3）、活化后可調(diào)節(jié)的正常T細胞表達分泌因子（RANTES）等趨化因子和IL-4、IL-5和TNF-α的表達，導致炎癥的發(fā)生；5-脂氧合酶（5-LOX）及環(huán)氧合酶1/2（COX1/2）不僅是花生四烯酸代謝的主要動力酶，同樣也是各種舒緩成分的主要作用靶點，花生四烯酸會通過5-LOX介導的脂質(zhì)氧化酶途徑和 COX-1/2介導的環(huán)氧化酶途徑分別生成白三烯和前列腺素，吳丹丹[47]通過二氧化鈦納米管固定酶篩選出忍冬中的槲皮素、木犀草素、忍冬苷等10種化合物對5-LOX具有較好的抑制功效。由于抗原呈遞細胞數(shù)量和形式的限制很難在體外培養(yǎng)，因此用CD54/CD86在人急性單核細胞白血病細胞系（THP-1）上的表達增加作為等效替代指標[48]。通過比較THP-1上CD54/CD86的相對熒光強度（RFI）的影響程度，判斷其作用效果：在THP-1細胞的存活率大于50 %的前提下，如果RFICD86≥150或者RFICD54≥200，則表示有促炎作用。

除此之外，針對各類白介素的檢測也是舒緩功效成分的主要檢測靶點。Johnston等[49]通過轉(zhuǎn)錄組及差異基因富集分析發(fā)現(xiàn)IL-1和IL-36是廣泛性膿皰型銀屑病的主要細胞因子，戰(zhàn)紫瑩通過酶聯(lián)免疫吸附法、HE染色、免疫熒光染色等實驗證實菊科植物木香中的木香烴內(nèi)酯可抑制IL-36[50]介導的銀屑病樣皮膚炎癥；包括阿達木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、賽妥珠單抗和戈利木單抗在內(nèi)的TNF-α抑制劑[51]，能很好地抑制AD的發(fā)生。

3 展望

敏感皮膚形成原因包括微生態(tài)屏障失衡、表皮屏障功能受損、神經(jīng)反應(yīng)敏感及炎癥反應(yīng)。本文將抗敏感活動分為四步評價法：維持微生態(tài)平衡能力、表皮屏障修復能力、神經(jīng)鎮(zhèn)靜能力和抗炎能力；按照上述分類，在進行舒緩成分的功效評價工作時，分別通過體外細胞、3D皮膚模型、動物或相應(yīng)的人體實驗進行篩選和改進，以建立系統(tǒng)的基于敏感皮膚產(chǎn)生機制的原料評價方法，為篩選出更好的改善皮膚敏感的化妝品原料提供科學的依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

然而，在皮膚微生態(tài)、神經(jīng)因素及抗炎能力的評價方法方面，目前有很多細胞因素及其生理功能尚未分析完全，各種體外培養(yǎng)的人體皮膚細胞和3D皮膚模型無法完全還原機體的變化情況，因此，我們?nèi)孕枰獜亩喾矫妗⒍鄬哟卫^續(xù)探索分析敏感皮膚的成因，尋找更加合適的抗敏感成分的功效評價方法，建立更加完善的評價體系。