崔露露 池雨鋒 張銳利 馬繼永 高德民
【摘 要】 目的:建立廣西產(chǎn)不同品種石韋藥材的HPLC指紋圖譜,對(duì)其進(jìn)行分析和質(zhì)量評(píng)價(jià),同時(shí)測(cè)定石韋中綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁的含量。方法:采用HPLC測(cè)定廣西產(chǎn)6批不同品種石韋藥材的含量, 分別運(yùn)用SPSS 19.0軟件和中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版對(duì)廣西產(chǎn)6批不同品種石韋藥材的14個(gè)共有峰進(jìn)行聚類(lèi)分析(HCA)、主成分分析(PCA)和相似度分析。結(jié)果:廣西產(chǎn)不同品種石韋中綠原酸含量最高,其次為蘆丁、芒果苷和山奈素。其中,有柄石韋中綠原酸最高,石韋中芒果苷最高,而在柔軟石韋中蘆丁及山奈素含量較高。對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行比較,聚類(lèi)分析中除絨毛石韋外,其它石韋可為一類(lèi);主成分分析中越石韋、廬山石韋、有柄石韋和柔軟石韋為一類(lèi);在相似度分析中,對(duì)比藥典項(xiàng)下石韋,可見(jiàn)中越石韋與廬山石韋、有柄石韋較接近。結(jié)論:廣西產(chǎn)不同品種石韋中綠原酸,芒果苷,山奈素,蘆丁含量存在差異。此外,相似度分析,主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果為鑒別石韋藥材提供依據(jù),為石韋藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和臨床用藥提供參考。
【關(guān)鍵詞】 石韋;高效液相色譜法;相似度分析;聚類(lèi)分析;主成分分析
【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517(2023)15-0050-07
DOI:10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202315012
Abstract:Objective The HPLC Fingerprints were built to analyze and evaluate the different Pyrrosia from Guangxi province. Simultaneously, the contents of chlorogenic acid, mangiferin, kaempferol and rutin were determined.Methods 14 peaks of the common model were collected and used by establishing HPLC fingerprint from Guangxi Pyrrosia species The data were applied to professional software named SPSS 19.0 statistical analysis software for hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA) and Similarity Evaluation System for chromatographic fingerprint of TCMs (Version 2004 A) recommended by the SFDA of China for evaluating similarities.Results The content of four ingredients were determined, which it were chlorogenic acid> rutin > mangiferin> kaempferol. Among them, chlorogenic acid and mangiferin were the highest in P. petiolosa and P. lingua respectively, while the contents of rutin and kaempferol were higher in P. mollis. To compare their fingerprints, except for P. subfurfuracea, the others can be classified as one class by HCA. The PCA method showed that it was categorized into one group: P. tonkinensis,P. sheareri,P. petiolosa and P. mollis. And the similarity values, P. tonkinensis,P. sheareri, and P. petiolosa, were very close by comparing the pharmacopeia. Conclusions The content of main ingredients (chlorogenic acid, mangiferin, kaempferol and rutin) was difference from different species Pyrrosia. Besides,it provides a basis for identifying and evaluating the quality of Pyrrosia by the similarity analysis,PCA and HCA, and offers a reference for the quality standards and clinical application of Pyrrosia.
Keywords:Pyrrosia; HPLC; Similarity Analysis; HCA; PCA
石韋為水龍骨科(Polypodiaceae)石韋屬(Pyrrosia)的多種植物的干燥葉,主要分布于華北、西北及湖南等地區(qū)。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》將同屬植物石韋[Pyrrosia lingua(Thunb.) Fat-well]、有柄石韋[Pyrrosia petiolosa(Christ) Ching]和廬山石韋[Pyrrosia sheareri(Bak.) Ching]的干燥葉作為石韋藥材來(lái)源。石韋具有利尿通淋、清肺止咳、涼血止血的功效,臨床用于治療熱淋、血淋、石淋、肺熱喘咳、吐血、衄血等癥?,F(xiàn)代研究[1]表明石韋含有黃酮、酚酸及皂苷類(lèi)成分,如綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁、咖啡酸、胡蘿卜苷等。綠原酸具有抗菌解毒、消炎利膽和抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[2-4];芒果苷具有良好的抗炎、抗病毒和保肝等作用[5-7];山奈素具有抗癌、抗感染及抗炎作用[8-10];蘆丁具有抗自由基、抗病毒及抗腫瘤等作用[11-13]。
石韋作為藥材應(yīng)用,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,此后歷代本草著作多有記載。目前有部分地區(qū)以非藥典品種入藥,尤其是在廣西省,柔軟石韋[Pyrrosia mollis(Kunze)Ching]常見(jiàn)于藥材市場(chǎng)[14]。本研究在廣西藥材市場(chǎng)收集了多份廣西產(chǎn)石韋藥材樣本,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定,除藥典品種外,還有中越石韋[Pyrrosia tonkinensis(Gies.) Ching]、有柄石韋[Pyrrosia petiolosa(Christ) Ching](A005)及柔軟石韋[Pyrrosia mollis (Kunze) Ching]。為比較廣西產(chǎn)不同品種石韋之間的差異,本次實(shí)驗(yàn)采用高效液相法建立石韋的指紋圖譜,并測(cè)定石韋中綠原酸、芒果苷、山奈素及蘆丁的含量,同時(shí)進(jìn)行相似度分析,主成分分析和聚類(lèi)分析[15-19],用以比較廣西產(chǎn)不同品種石韋的質(zhì)量差異。為石韋質(zhì)量控制和臨床用藥提供參考。
1 儀器與試藥
1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜儀(型號(hào)1100,DAD 檢測(cè)器);分析天平(上海菁海儀器有限公司);KQ-100DE超聲波清洗器(醫(yī)用超聲波清洗器);SHZ-DⅢ真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。
1.2 試藥 中國(guó)食品藥品檢定研究院綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110753-202018);山奈素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110861-202013);蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100080-201811);芒果苷對(duì)照品(批號(hào):111607-201704)。乙腈為色譜純,磷酸、甲醇為分析純,水為娃哈哈純凈水。
1.3 藥材 購(gòu)買(mǎi)的藥材樣品,產(chǎn)地為廣西省,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定,分別為石韋[Pyrrosia lingua(Thunb.) Fat-well](A001廣西桂林)、絨毛石韋[Pyrrosia subfurfuracea(Hook.) Ching](A002廣西玉林)、中越石韋[Pyrrosia tonkinensis(Gies.) Ching](A003廣西河池)、廬山石韋[Pyrrosia sheareri(Bak.) Ching](A004廣西玉林)、有柄石韋[Pyrrosia petiolosa(Christ) Ching](A005廣西河池)及柔軟石韋[Pyrrosia mollis(Kunze) Ching](A006廣西茂名)。
2 方法和結(jié)果
2.1 色譜條件 采用Agilent 5 HC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;進(jìn)樣量20 μL,流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脫,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,洗脫程序(0~15 min,10% A;15~35 min,10%~15% A;35~60 min,15%~23% A;60~70 min,23% A),檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm。
2.2 對(duì)照液的制備 分別精密稱(chēng)取綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁對(duì)照品25.00 mg、1.00 mg、0.75 mg、2.00 mg,置于4個(gè)10 mL容量瓶中,用50%甲醇定容至刻度,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。然后分別精密吸取上述4種儲(chǔ)備液各2 mL置于同一10 mL容量瓶中,用50%甲醇定容至刻度,作為混合對(duì)照品溶液(每1 mL混合對(duì)照品溶液含綠原酸500.0 μg、芒果苷20.0 μg、山奈素15.0 μg、蘆丁 40.0 μg)。
2.3 供試液的制備 取藥材粉末1.0 g,精密稱(chēng)定,置50 mL碘量瓶中,移取50%甲醇15 mL加入,蓋塞稱(chēng)重,超聲提取40 min,冷至室溫后,再次稱(chēng)重,用50%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,過(guò)濾得提取液,二次提取用50%甲醇15 mL,重復(fù)上述操作,提取20 min,合并兩次提取液,過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜,即得供試液。
2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL置于2 mL容量瓶中,用50%甲醇稀釋至刻度,測(cè)定線性關(guān)系,以濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 精密度考察 取2.3項(xiàng)下的供試品,連續(xù)進(jìn)樣6次,以3號(hào)特征峰為基準(zhǔn),計(jì)算色譜圖各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間(RRT)和相對(duì)峰面積(RPA)的RSD,分別為0.33%~4.92%和0.69%~4.75%,表明該儀器的精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表2。
2.5.2 穩(wěn)定性考察 取有柄石韋(A005)藥材,按前述方法制備供試品溶液,分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣,計(jì)算各特征峰RRT和RPA的RSD,結(jié)果均小于5%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表2。
2.5.3 重復(fù)性考察 取石韋(A001)樣品6份,按前述方法制備6份供試液進(jìn)行測(cè)定,得到4種成分含量,計(jì)算其RSD值,四種成分RSD值均在5%以?xún)?nèi),表明本方法的重復(fù)性好。結(jié)果見(jiàn)表3。
2.5.4 加樣回收率考察 精密稱(chēng)定已知含量的石韋(A001)藥材,取與藥材含量接近的對(duì)照品儲(chǔ)備液,加入藥材中,按前述方法制備供試品溶液,進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得加樣回收率均在95%~105%之間。結(jié)果見(jiàn)表4。
2.6 石韋指紋圖譜的建立 本實(shí)驗(yàn)選取6種石韋樣品,按前述方法制備供試液進(jìn)行測(cè)定。依據(jù)各峰的RRT和RPA挑選14個(gè)特征峰,如圖1所示,由于品種不同,僅對(duì)藥典項(xiàng)下石韋(A001)、廬山石韋(A004)、有柄石韋(A005)三種樣品建立共有模式指紋圖譜,如圖2所示,經(jīng)與對(duì)照指紋圖譜(如圖3所示)對(duì)照,確定峰5為綠原酸,峰8為芒果苷,峰11為山奈素,峰12為蘆丁。
2.6.1 樣品含量測(cè)定 分別取6種石韋樣品,依據(jù)前述方法制備供試液進(jìn)行測(cè)定,用外標(biāo)法計(jì)算4種成分的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。
如表5顯示,所有的樣品中綠原酸含量較高,其次為蘆丁、芒果苷和山奈酚;其中有柄石韋綠原酸含量最高,中越石韋與有柄石韋不含山奈素(或含量極低);石韋中芒果苷含量最高,絨毛石韋居其次;而在柔軟石韋中蘆丁及山奈素含量較高。
2.6.2 聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析可根據(jù)物質(zhì)所含化學(xué)成分用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)或描述,并將一些觀察對(duì)象依據(jù)某些特征加以歸類(lèi),是研究事物分類(lèi)的有效方法[20-21]??梢罁?jù)所測(cè)樣品的數(shù)據(jù),對(duì)樣品進(jìn)行分類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)以同一產(chǎn)地不同品種的6種石韋為研究對(duì)象,進(jìn)行指紋圖譜研究,獲得包括綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁在內(nèi)的14個(gè)峰。系統(tǒng)聚類(lèi)分析利用SPSS 19.0分析軟件,使用歐氏平方距離作為樣品的測(cè)度[22],6種石韋樣品基本可以分為2大類(lèi)(如圖4所示),石韋(A001)、 中越石韋(A003)、廬山石韋(A004)、有柄石韋(A005)和柔軟石韋(A006)為第1類(lèi),絨毛石韋(A002)為第2類(lèi)。
2.6.3 主成分分析 主成分分析是利用降低空間維度,對(duì)樣品成分進(jìn)行分類(lèi)和分析的方法[23]。以6批樣品中共有峰的14個(gè)峰面積為數(shù)據(jù),利用SPSS 19.0進(jìn)行主成分分析,以著重分析同一產(chǎn)地不同品種樣品6批石韋樣品之間成分的差異(如圖5所示)。由結(jié)果可以看出,中越石韋(A003)、廬山石韋(A004)、有柄石韋(A005)和柔軟石韋(A006)分布較為接近,基本為一類(lèi)。石韋(A001)和絨毛石韋(A002)與其它石韋樣品距離較遠(yuǎn),成分差異性較大,可歸為一類(lèi)。
2.6.4 相似度評(píng)價(jià) 相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)可以對(duì)藥材進(jìn)行更全面的化學(xué)成分的分析和評(píng)價(jià)。本次實(shí)驗(yàn) 將6批藥材樣品的液相指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),根據(jù)多點(diǎn)校正法對(duì)樣品色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配,然后設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)模板(圖2)[24],利用相關(guān)系數(shù)法對(duì)不同品種譜峰差異性和整體相似性進(jìn)行評(píng)價(jià),得各石韋相似度評(píng)價(jià)結(jié)果。石韋(A001):0.5982;絨毛石韋(A002):0.1844;中越石韋(A003):0.6541;廬山石韋(A004):0.7926;有柄石韋(A005):0.9322;柔軟石韋(A006):0.4973。從分析結(jié)果可以看出,藥典項(xiàng)下3種石韋由于品種的差異,其相似度值也存在差異;而除藥典項(xiàng)下外,只有A003中越石韋相似度較高,與廬山石韋、有柄石韋較接近;其它3種石韋相似度均較低。這更符合聚類(lèi)分析的結(jié)果, 將A003、A004和A005分為一組,同時(shí)此結(jié)果也符合主成分分析。
3 分析與討論
化學(xué)指紋圖譜強(qiáng)調(diào)的是色譜的完整性,通過(guò)指標(biāo)性成分的定量分析,可以在一定程度上反映中藥的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)建立的石韋指紋圖譜有良好穩(wěn)定性及重現(xiàn)性,3種評(píng)價(jià)方法相輔相成,從不同方面對(duì)石韋的化學(xué)成分進(jìn)行分析。有柄石韋中綠原酸含量遠(yuǎn)高于其它品種,石韋中的芒果苷含量較其它品種高,而柔軟石韋中的蘆丁和山奈素的含量均高于其它石韋,可以考慮依據(jù)成分的不同對(duì)其進(jìn)行利用,擴(kuò)大石韋的臨床藥用價(jià)值。
綜上所述,來(lái)源于廣西省不同地市的不同種石韋,化學(xué)成分有較大的差異,對(duì)于藥典項(xiàng)下的三種石韋而言,有效成分綠原酸含量差異也較大,相似度也存在很大差異,而中越石韋與藥典項(xiàng)下有柄石韋、廬山石韋比較接近,由聚類(lèi)分析和主成分分析可以看出有柄石韋、廬山石韋和中越石韋較為接近。本次實(shí)驗(yàn)研究的藥材批次較少,缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是,也在一定程度上反映了不同品種石韋之間的差距。因此,以上分析結(jié)果可以為石韋藥材的鑒定及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù),亦可依據(jù)其化學(xué)成分含量的差異對(duì)不同品種的石韋進(jìn)行利用,從而擴(kuò)大石韋的使用范圍。
參考文獻(xiàn)
[1]謝來(lái)成.武當(dāng)山藥用植物(第一卷)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2006:98-99.
[2]陳芳,杜恩存,樊啟文,等.綠原酸類(lèi)物質(zhì)在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,59(21):10-13.
[3]楊玉輝,周艷,阮征,等.綠原酸保護(hù)由脂多糖誘導(dǎo)引起的大鼠慢性肝臟損傷[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(7):23-26.
[4]翟陽(yáng),高櫻,趙渤年.綠原酸藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志,2020,35(10):5095-5099.
[5]張蕾,趙國(guó)發(fā),李楠,等.芒果苷通過(guò)作用于NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)作用[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2021,41(3):265-272.
[6]邱峰,宋春艷,秦福創(chuàng),等.芒果苷對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)肺炎的作用研究[J].中華全科醫(yī)學(xué),2021,19(4):558-560.
[7]包江平,趙琳珺,郭妍如,等.苗藥紅花龍膽有效成分芒果苷在不同物種肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2021,32(8):1874-1877.
[8]呂帥宜,林開(kāi)文,鄧雨婷,等.山奈素對(duì)小鼠乙醇型胃潰瘍的影響及其機(jī)制[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2021,31(6):517-521,540.
[9]WANG J, MAO J, WANG R, et al. Kaempferol protects against cerebral ischemia reperfusion injury through intervening oxidative and inflammatory stress induced apoptosis[J]. Frontiers in pharmacology, 2020, 11(4): 424-436.
[10]余蘇云,鄧蕊,王愛(ài)云,等.基于TRPC5探討山奈酚抗胃癌轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2021,35(10):753-753.
[11]李珂,馮亞莉,曹瑞梅,等.蘆丁的結(jié)構(gòu)修飾及生物活性研究進(jìn)展[J].中草藥,2021,52(20):6413-6424.
[12]金芳多,張?zhí)欤瑥堘?,?蘆丁對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2020,46(6):1117-1123.
[13]潘然,丁濱,胡林峰,等.蘆丁通過(guò)調(diào)控TG代謝途徑抑制肝細(xì)胞脂肪變性的作用機(jī)制研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,38(5):1-6.
[14]阮公梁,王柳萍,鐘霞軍,等.廣西產(chǎn)石韋和柔軟石韋抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,32(2):182-185.
[15]張藝軒,李開(kāi)通,李秋月,等.不同產(chǎn)地和品種石韋藥材的高效液相指紋圖譜研究[J].中藥材,2011,34(1):20-26.
[16]CUI L L, ZHANG Y Y, SHAO W,et al.Analysis of the HPLC fingerprint and QAMS from Pyrrosia species[J]. Industrial Crops and Products, 2016,85(7):29-37.
[17]李穎碩,張曉棟,楊楠楠,等.指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)模式在前胡質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2019,30(7):1557-1560.
[18]楊彬,趙君,劉芳,等.指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別、一測(cè)多評(píng)的連翹質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2020,37(3):292-298.
[19]燕霞,朱雪妍,何頌華,等.HPLC-一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定壯藥羅漢茶中6種黃酮類(lèi)成分及多元統(tǒng)計(jì)分析[J].中國(guó)藥房,2021,32(20):2485-2491.
[20]宋小妹,楊新杰,王薇,等.珠子參的HPLC指紋圖譜及模式識(shí)別[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(11):59-61.
[21]楊樹(shù)聲.連翹HPLC指紋圖譜的建立及其化學(xué)模式識(shí)別研究[J].西部中醫(yī)藥,2011,24(11):23-25.
[22]CHENG X M,ZHAO T,YANG T,et al.HPLC fingerprints combined with principal component analysis, hierarchical cluster analysis and linear discriminant analysis for the classification and differentiation of Peganum sp. indigenous to China[J]. Phytochemical Analysis,2010,21(3):279-289.
[23]CHEN Y,ZHU S B,XIE M Y,et al.Quality control and original discrimination of Ganoderma lucidum based on high-performance liquid chromatographic fingerprints and combined chemometrics methods[J].Analytica chimica acta,2008,623(2):146-156.
[24]崔露露.石韋的HPLC指紋圖譜研究與灰色關(guān)聯(lián)度分析[D].濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué),2017.
(收稿日期:2022-11-30 編輯:陶希睿)
基金項(xiàng)目:2021年度山東省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(編號(hào)2021Q116)。
作者簡(jiǎn)介:崔露露(1989—)女,漢族,碩士,藥品技術(shù)工程師,研究方向?yàn)橹兴幖爸谐伤庂|(zhì)量控制。E-mail:cll5052@163.com
通信作者:高德民(1973—)男,漢族,博士,副教授,研究方向?yàn)橹兴庂Y源研究與中藥質(zhì)量控制。E-mail: gdm607@126.com