過表達(dá)ERF76 小黑楊的木材組分分析及影響

李 鑫，廖詩賢，王宇婷，姜廷波

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

楊樹（populus）屬楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus）植物，分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、在我國約有60 多種[1]。楊樹所具有的速生特性使其成為林木產(chǎn)品生產(chǎn)的重要原料之一，主要用于生物質(zhì)能源制造、民用建筑、板料及紙漿制造等[2]。其中小黑楊（Populus simonii×P.nigra）是通過小葉楊（Populus simonii Carr）和黑楊（Populus nigra）雜交而來的優(yōu)良品種[3]。為培育品質(zhì)更為優(yōu)良的樹種，利用基因工程將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)來改變植株部分特性是改良樹種的有效途徑之一。AP2/ERF 家族是一個(gè)龐大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子群，在許多生物過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究所涉及的ERF 類轉(zhuǎn)錄因子參與植物一系列的重要生命活動(dòng)，包括激素信號誘導(dǎo)調(diào)控、代謝調(diào)控、細(xì)胞分化、植物生長發(fā)育等[5]。根據(jù)報(bào)道，ERF76 轉(zhuǎn)基因楊樹中植物激素ABA 和GA 生物合成和信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因的相對表達(dá)水平顯著高于野生型[2]。其中GA 參與調(diào)控纖維素的合成，并通過DELLA 參與調(diào)控[6]。這為ERF76 基因影響楊木生長發(fā)育進(jìn)而影響木材化學(xué)組分提供了一定的理論基礎(chǔ)。而化學(xué)組分原料主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，是有關(guān)木材產(chǎn)品生產(chǎn)最主要的原料[7-10]。對于這些組分的分離與應(yīng)用工藝有許多，例如堿/尿素處理工藝[11]、稀酸處理[12]、水性助溶劑處理[13]、自水解[14,15]、堿處理[16]等處理方式。考慮到能源、機(jī)械等實(shí)際生產(chǎn)條件以及實(shí)驗(yàn)室條件，文章采用氫氧化鈉對目標(biāo)楊木進(jìn)行堿法處理以及半纖維抽提[17]工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)。

文章研究的主要目的有二，首先是探究過表達(dá)ERF76 小黑楊在基因的影響下木材中的化學(xué)組分發(fā)生了哪些變化。其次是通過堿處理工藝處理探索由該轉(zhuǎn)基因造成的化學(xué)組分變化在工業(yè)化應(yīng)用處理過程中會(huì)造成哪些影響，意在對日后該轉(zhuǎn)基因木材的合理應(yīng)用提供一定的理論與數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料實(shí)驗(yàn)選用位于東經(jīng)125°42’—130°10′，北緯44°04′—46°40′野生型小黑楊（WT）與ERF76 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小黑楊（2 年生與6 年生）。取樣時(shí)間為2022 年6 月

1.1.2 試劑氫氧化鈉、72%濃硫酸、4%硫酸、苯、95%乙醇、70%乙醇、亞氯酸鈉、去離子水、冰醋酸、丙酮、飽和氫氧化鋇溶液、鄰苯二甲酸氫鉀

1.2 楊木化學(xué)組分測定方法

水分、有機(jī)物抽提、綜纖維素、灰分分別根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T462-2008、GB/T2677.6-1994、GB/T2677.10-1995、GB/T2677.3-1993 測定。酸溶木質(zhì)素和酸不溶木質(zhì)素含量按照美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室NREL/TP-510-4261 “Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass”檢測，楊木纖維素與半纖維素的測定采用高效液相色譜測定水解液（水解液來自酸不溶木質(zhì)素制備過程）中葡萄糖與木糖的含量，以葡萄糖和木糖的標(biāo)樣作為標(biāo)準(zhǔn)測定含量。分別對WT 與轉(zhuǎn)基因楊木進(jìn)行水分、綜纖、苯醇-抽提、klason 木質(zhì)素、酸溶木質(zhì)素、半纖維素、纖維素、灰分等組分進(jìn)行測定。篩選優(yōu)良轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將楊木試樣送至生工生物工程 （上海） 股份有限公司進(jìn)行cDNA 文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序，從中找尋ERF76 基因（Potri.005G195000.1）并使用TBtools 軟件分析。對比轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)野生型與ERF76 轉(zhuǎn)基因楊木的差異基因。

1.4 半纖維素抽提

將實(shí)驗(yàn)所用6 年生小黑楊楊木自然風(fēng)干一段時(shí)間后去除樹皮，通過球磨機(jī)制備尺寸為40-60 目的楊木木粉，將合格木粉通過苯-醇抽提脫脂，并根據(jù)國標(biāo)GB/T462-2008 測量木粉水分后備用。稱取1g（絕干、精確0.0001）脫脂木粉放置于錐形瓶中，用20 mL 濃度為100 g/L 的氫氧化鈉溶液與之充分混合，并處于室溫下反應(yīng)（0.5-3 h）反應(yīng)結(jié)束后通過恒重的G2 玻沙漏斗分離固液相。

固相用去離子水洗滌至濾液為中性后放入（105±2℃）烘箱內(nèi)烘至絕干，稱重計(jì)算固相得率。液相使用冰醋酸調(diào)節(jié)液體pH 值為5.5 并加入3 倍體積（60 mL，濃度95%）的乙醇溶液。等待完全沉淀后再次固液分離，用70%的乙醇溶液洗滌并風(fēng)干稱量半纖維素質(zhì)量并計(jì)算半纖維素提取率。

1.5 堿法組分分離

將實(shí)驗(yàn)楊木（6 年生）靜置一段時(shí)間自然風(fēng)干水分后去除樹皮分別裁剪制備長2 mm 寬1 mm 高30 mm的木桿。將5g 楊木桿分別用用堿量為20、30（NaOH 計(jì)）的氫氧化鈉，以液比為1∶6 的配比放在玻璃瓶中混合并充分?jǐn)嚢琛７馍w后將盛有溶液的玻璃瓶轉(zhuǎn)移到高壓滅菌鍋中，預(yù)設(shè)滅菌鍋反應(yīng)時(shí)間90 min 溫度120℃。靜待反應(yīng)結(jié)束后采用布氏漏斗過濾，分離固液相。固相產(chǎn)物用去離子水清洗直至產(chǎn)物濾液變?yōu)橹行詾橹埂Ｊ占腆w產(chǎn)物并放入（105±2℃）烘箱中烘干并記錄得率數(shù)據(jù)，烘干原料經(jīng)球磨機(jī)粉碎，并篩選40～60 目木粉用于檢測殘余木質(zhì)素含量（參照1.2）每種處理包含3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 組分分析

由（表1）可知，轉(zhuǎn)基因株系在纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等化學(xué)組分含量上發(fā)生了變化。由此可以判斷過表達(dá)ERF76 基因?qū)π『跅钅静慕M分造成了一定影響，且由于轉(zhuǎn)基因株系的不同表現(xiàn)出了不同的結(jié)果。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得知ERF76 基因在不同小黑楊株系中的表達(dá)倍數(shù)，將其與木材各個(gè)化學(xué)組分定量結(jié)果相互比對發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FC 倍數(shù)相對較低時(shí)ERF76 過表達(dá)小黑楊的纖維素占比有所提高。當(dāng)FC 倍數(shù)進(jìn)一步提高后纖維素占比含量逐步下降直至出現(xiàn)負(fù)增長；半纖維素的含量占比與FC 變化的規(guī)律與纖維素相反，木質(zhì)素含量占比的變化規(guī)律與半纖維素相同，雖然這一規(guī)律在木質(zhì)素組分變化上有所體現(xiàn)但總體上對木質(zhì)素占比含量影響并不是很大，變化的規(guī)律主要體現(xiàn)在纖維素與半纖維素的變化之上。

表1 兩年生楊木各化學(xué)組分含量表Table1 Biennial poplar content table of each chemical component

經(jīng)過比較P1、P2、P3 株系與WT 在纖維素的占比差的絕對值分別為1.25、0.37、0.06；半纖維素的占比差的絕對值分別為1.06、0.22、0.21；根據(jù)比較結(jié)果P1 的化學(xué)組分變化較其它株系更加明顯，因此選定P1 株系進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

由（表2）可知經(jīng)歷過4 年生長發(fā)育，由ERF76 基因的過表達(dá)木材對化學(xué)組分的影響在P1 株系體內(nèi)不斷累積并增大。與WT 纖維素含量的差值由四年前的1.25 變?yōu)?.05； 半纖維素的差值由1.06 變?yōu)?.16；四年生長發(fā)育過程中小黑楊木質(zhì)化水平不斷提高，但WT 與P1 的木質(zhì)素水平差距不大。

表2 6 年生楊木各化學(xué)組分含量表Table2 Six-year-old poplar content table of various chemical components

由轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過TBtools 軟件分析并結(jié)合（表3）可知ERF76 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹與野生型楊樹在549個(gè)基因表達(dá)上有所差異。其中上調(diào)基因195 個(gè)，下調(diào)基因354 個(gè)，其中影響轉(zhuǎn)基因楊樹碳水化合物合成的差異基因共27 個(gè)上調(diào)基因7 個(gè)（ID：Potri.002G006200.2；Potri.003G122000.1；Potri.004G071600.1；Potri.005G195000.1；Potri.007G015500.2；Potri.008G132500.1；Potri.010G201500.2），下調(diào)基因 20 個(gè)（ID：Potri.001G192200.2；Potri.002G060500.1；Potri.002G089800.1；Potri.002G089800.4；Potri.002G145300.1；Potri.005G201200.2；Potri.006G140300.3；Potri.008G055900.2；Potri.008G120000.2；Potri.008G123500.1；Potri.008G192600.1；Potri.008G219200.1；Potri.009G060800.4；Potri.010G010500.1；Potri.010G063100.1；Potri.014G094800.1；Potri.014G116800.1；Potri.016G025500.2；Potri.016G054600.2；Potri.016G075700.4；Potri.017G073200.3）由此為轉(zhuǎn)基因楊木纖維素、半纖維素組分含量發(fā)生變化提供了分子層面的的依據(jù)。

表3 ERF76 楊木轉(zhuǎn)錄組差異基因統(tǒng)計(jì)表Table3 Transcriptome differential gene statistics table

2.2 半纖維抽提&堿法處理

針對P1 株系木材化學(xué)組分的特點(diǎn)，文章對該木材的工業(yè)化應(yīng)用做了一些探究，對P1 轉(zhuǎn)基因小黑楊進(jìn)行了堿法工藝和半纖維素提取工藝[18]的進(jìn)一步研究，研究相同工藝下WT 與ERF76 轉(zhuǎn)基因楊樹（P1 株系）的不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

根據(jù)報(bào)道，室溫（25℃）下100 g/L 的氫氧化鈉只能溶解聚合度較低的半纖維素[19]。結(jié)合（表4）和（圖1）所示結(jié)果可以得出以下結(jié)論：從氫氧化鈉抽提結(jié)果上看，在相同的處理?xiàng)l件下P1 脫除半纖維素的效率明顯高于WT。由于該工藝條件針對于聚合度低的半纖維素進(jìn)行抽提，且P1 的半纖維素脫除率較高，因此P1 所含低聚合度的半纖維素在總半纖維素中占比相對較高。由此側(cè)面證明了P1 植株的半纖維素合成途經(jīng)受到了ERF76 基因過表達(dá)的影響。同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)平衡時(shí)間與半纖維素脫除效率，找尋到了ERF76 過表達(dá)小黑楊木材在室溫 （25℃）氫氧化鈉提取液濃度為100 g/L 提取半纖維素的最適時(shí)間為90 min。

圖1 半纖維素脫除率Figure1 Hemicellulose removal rate

表4 半纖維素抽提結(jié)果表Table4 Hemicellulose extraction results table

正如（表5）所示結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的堿處理工藝下P1 與WT 木材在脫除木質(zhì)素方面的差別不大，但P1 可以保持較高的制漿得率。提高反應(yīng)工藝的用堿量后轉(zhuǎn)基因木材仍舊維持著上述結(jié)果。造成這一結(jié)果的原因主要應(yīng)有兩點(diǎn)，第一轉(zhuǎn)基因株系的和WT 纖維素組分含量、半纖維素組分含量存在差異（詳見表2）。由于反應(yīng)溫度并未超過150℃，因此反應(yīng)釜內(nèi)的主要化學(xué)反應(yīng)應(yīng)為剝皮反應(yīng)[20]。根據(jù)上述半纖維素抽提所得結(jié)論，P1 含有大量聚合度較低的半纖維素。因剝皮反應(yīng)的特性是從纖維素、半纖維素鏈條的末端依次反應(yīng)降解，且半纖維素含有大量支鏈更易降解。因此WT 與P1 在反應(yīng)之初半纖維素快速溶出并降解，而纖維素反應(yīng)較慢，此時(shí)木材纖維素組分上的不同成為了得率差異的主要原因。第二從反應(yīng)接觸面積來看，半纖維素的降解會(huì)為反應(yīng)液的侵入提供更多的接觸孔隙。由于P1 與WT 在半纖維素組分含量上的差異（詳見表2）P1 較少的半纖維素含量，致使反應(yīng)過程中WT 更易與反應(yīng)液接觸促進(jìn)碳水化合物的不斷降解。

表5 固體產(chǎn)物的得率、木質(zhì)素分析表Table5 Table of yield and lignin analysis of solid products

3 結(jié)論

通過研究多年生過表達(dá)ERF76 小黑楊的化學(xué)組分變化為人們進(jìn)一步了解ERF76 基因?qū)δ静慕M分方面的影響提供了相關(guān)依據(jù)。通過對兩年生WT 與不同ERF76 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系木材化學(xué)組分的分析和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，揭示了ERF76 基因過表達(dá)倍率不同對木材各組分的影響。當(dāng)FC 增高時(shí)纖維素組分占比曾高，半纖維素含量占比較低；當(dāng)FC 進(jìn)一步提高時(shí)半纖維素含量占比得到逐步提高，纖維素占比下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出化學(xué)組分來變化較為明顯的ERF76 轉(zhuǎn)基因株系（P1），通過進(jìn)一步檢驗(yàn)六年生WT 與P1 植株的木材化學(xué)組分?jǐn)?shù)據(jù)，觀察到由ERF76 基因過表達(dá)造成的纖維素、半纖維素組分影響在植物生長發(fā)育過程中不斷累積。

針對ERF76 基因?qū)w維素、半纖維素組分影響較大的特點(diǎn)，對轉(zhuǎn)基因小黑楊木材中相關(guān)纖維素、半纖維素材料方面進(jìn)行了低聚合度半纖維素的提取和堿法處理工藝處理的進(jìn)一步的探究。研究發(fā)現(xiàn)ERF76過表達(dá)的小黑楊木材中低聚合度的半纖維素占據(jù)其半纖維素總量的大部分。這為探究ERF76 基因影響植株低聚合度半纖維素合成路徑提供了一定的思路。在堿處理實(shí)驗(yàn)過程中通過對反應(yīng)溫度的限制，利用剝皮反應(yīng)為主要反應(yīng)探究化學(xué)組分變化在比較溫和的堿性反應(yīng)過程中帶來的影響。具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因株系（P1）相較WT 存在高纖維素低半纖維素的特點(diǎn)。在剝皮反應(yīng)中半纖維素含量低反應(yīng)快、纖維素含量高反應(yīng)慢，最終導(dǎo)致了P1 高得率結(jié)果。半纖維素提取結(jié)果上找到了轉(zhuǎn)基因木材在室溫下氫氧化鈉濃度為100 g/L 時(shí)最適提取時(shí)間為90 min。