郭斯崖，鄭慧芳，張淼，蔡靜，王鑫彤，郭雷

（1.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；3.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，江蘇 連云港 222005）

隨著世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，特別是高密度養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的暴發(fā)和流行已日益成為影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要因素[1]。由哈氏弧菌（Vibrio harveyi）等弧菌屬細(xì)菌所引起的暴發(fā)性弧菌病是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物最嚴(yán)重的疾病之一。該病可感染多種魚、蝦、貝類，造成大量死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2-4]。目前，主要用抗生素預(yù)防和治療弧菌病。但是，長期使用抗生素會導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)，給水生動物疾病的治療帶來困難和水產(chǎn)品、環(huán)境和人體一定危害[5,6]。因此，對海水養(yǎng)殖病原弧菌開展防治至關(guān)重要。

中草藥具有資源豐富、殘留少、副作用小、安全性高等優(yōu)點[7]，已成為替代水產(chǎn)抗生素的重點藥物[8,9]。中草藥苦參（Sophora flavescenes Ait）為豆科植物苦參的干燥根，含有種類豐富的化合物，包括生物堿、黃酮、三萜皂苷、木質(zhì)素及酚酸等[10]?？鄥⒆鳛閭鹘y(tǒng)中藥材，有幾千年的藥用歷史，臨床應(yīng)用廣泛，有抗腫瘤、抗病毒、抗病原微生物、抗氧化、抗炎等作用[11]，已被中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)用于防治水生動物疾病[12]。但其抗菌活性物質(zhì)尚不清楚，整體療效也不穩(wěn)定。

鑒于此，本文采用單因素實驗、Box-Behnken 設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化苦參抗水產(chǎn)病原哈氏弧菌活性物質(zhì)（ASSF）的提取工藝以富集其抗菌活性物質(zhì)，利用高效液相色譜法（HPLC）和牛津杯法對其主要抗菌化學(xué)成分進行鑒定，最后通過細(xì)菌生長曲線、紫外吸收、電導(dǎo)率和掃描電鏡法研究ASSF 對哈氏弧菌的作用機制，以期為苦參在水產(chǎn)病害防治中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

苦參購自安徽亳州中藥廠；苦參酮購自成都埃法生物科技有限公司；哈氏弧菌1.8690 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC，北京）；MH肉湯培養(yǎng)基購自杭州百思生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；除色譜級甲醇外，其他有機試劑均為分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素實驗

苦參經(jīng)粉碎后過40 目篩，每次實驗準(zhǔn)確稱量1.0 g 苦參粉末。首先考察了提取溶劑（蒸餾水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇）對提取物抑菌活性的影響。將20 mL 不同提取溶劑和1.0 g 苦參粉加入250 mL 磨口錐形瓶中，上置冷凝器。提取過程在80 ℃下HH-4 恒溫水浴鍋中進行，提取120 min。其次，考察不同濃度乙醇對提取物抑菌活性的影響。將20 mL 不同濃度的乙醇（60%～100%）和1.0 g 待提取粉末加入250 mL 磨口錐形瓶中。在80 ℃下恒溫水浴提取120 min。第三，將20 mL 無水乙醇和1.0 g 待提取粉末加入250 mL 磨口錐形瓶中，在不同提取溫度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）下水浴提取120 min，考察提取溫度對提取物抑菌活性的影響。第四，將20 mL 無水乙醇和1.0 g 待提取粉末加入250 mL 磨口錐形瓶中，在90 ℃條件下提取60 min、90 min、120 min、150 min 和180 min，考察提取時間對提取物抑菌活性的影響。最后，分別向250 mL 磨口錐形瓶中加入不同體積的無水乙醇（10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL）和1.0 g 待提取粉末，在90 ℃條件下提取120 min，考察液料比對提取物抑菌活性的影響。進行上述步驟后，將提取物以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，然后抽濾。將濾液稀釋或濃縮至20 mL，用于測定抗哈氏弧菌的活性。

1.2.2 Box-Behnken 設(shè)計

采用Box-Behnken 設(shè)計優(yōu)化提取條件，利用Design Expert 7.0.0（Stat-Ease,Minneapolis,USA）分析實驗數(shù)據(jù)，建立模型[4]。BBD 由17 個測試點組成，其中12 個是階乘點，5 個是中心點的重復(fù)。以提取溫度（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）為自變量，以提取物對哈氏弧菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)變量（Y，mm）。表1 給出了自變量的范圍和級別以及響應(yīng)變量的值。

表1 Box-Behnken 設(shè)計方案與結(jié)果Tab.1 The range and level of the independent variables and the observed values of Box-Behnken design

使用Design Expert 7.0.0 軟件獲得提取物對哈氏弧菌抑菌圈的最大直徑，采用以下二階多項式方程來評價系統(tǒng)模型:

式中，Y 為預(yù)測的響應(yīng)值；β0，βi，βii和βij為截距、線性、二次項中的回歸系數(shù)；Xi和Xj是獨立因子。

1.2.3 高效液相色譜法鑒定ASSF 中的化學(xué)成分

通過查詢文獻發(fā)現(xiàn)，苦參中含有苦參酮等有效成分。本實驗采用苦參酮標(biāo)準(zhǔn)品作為參考化合物，通過高效液相色譜法（HPLC）比較參考化合物和ASSF 的色譜圖來鑒定ASSF 的主要化學(xué)組成[13]。使用Agilent 1260 高效液相色譜儀，色譜柱CLC-ODS（10.0 mm×250 mm,5 μm,1.5 mL/min），檢測波長為295 nm。流動相為水、0.1%磷酸（溶劑A）和甲醇（溶劑B）。梯度洗脫程序如下（v/v）：0 min 30% B,20 min 80% B,45 min 90% B,60 min 100% B,70 min 100% B。

1.2.4 牛津杯法

采用牛津杯法測定提取物抗哈氏弧菌的活性[7]。將20 mL MH 肉湯培養(yǎng)基倒入平板，凝固后，取100 μL 哈氏弧菌菌懸液（1×106cfu/mL）均勻涂布在培養(yǎng)基上。將牛津杯放置在培養(yǎng)基上，然后向杯中加入200 μL 樣品溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑的平均值（mm，n=3）作為樣品抗哈氏弧菌的活性。通過上述方法測定ASSF 及其主要化學(xué)成分（苦參酮等）對哈氏弧菌的最小抑菌濃度（MIC）。將ASSF 及苦參酮等化合物分別溶于甲醇中，用二倍稀釋法制成系列濃度的樣品溶液，測定抑菌圈直徑。以該化合物能產(chǎn)生抑菌圈的最低濃度定義為MIC[14]。

1.2.5 試管稀釋法

采用試管稀釋法測定ASSF 和苦參酮對哈氏弧菌的MIC。將ASSF 和苦參酮分別溶于甲醇中，采用二倍稀釋法進行稀釋。向裝有4 mL MH 肉湯培養(yǎng)基的試管（20.5 cm×2.5 cm）中加入1.0 mL 哈氏弧菌菌懸液（1×106cfu/mL）和50 μL 不同濃度的樣品溶液，同時以甲醇50 μL 作為陰性對照。將試管充分混合并在37 ℃和160 r/min 下培養(yǎng)。24 h 后，肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低化合物濃度定義為MIC，48 h后，視肉眼無菌生長的最小化合物濃度定義為MBC[15]。

1.2.6 細(xì)菌生長曲線

將100 倍MIC 濃度的ASSF 和100 倍MBC 濃度的ASSF 溶于甲醇中配制樣品溶液。然后分別向裝有20 mL MH 肉湯培養(yǎng)基的50 mL 錐形瓶中加入200 μL 100 倍MIC 濃度的ASSF 和100 倍MBC 濃度的ASSF 樣品溶液，以甲醇作為陰性對照。將溶液充分混勻后，分別向錐形瓶中加入200 μL 哈氏弧菌菌懸液（1×106cfu/mL）。在37 ℃和160 r/min 下水浴振蕩培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)0 h、3 h、6 h、9 h、12 h，及24 h 時分別取樣200 μL，測定620 nm 處的吸光度，實驗設(shè)三組重復(fù)。以吸光度的平均值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)菌生長曲線。

1.2.7 細(xì)胞膜的完整性和通透性

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞時，蛋白質(zhì)、DNA 和RNA等生物內(nèi)源性紫外線吸收材料會泄漏。測定細(xì)菌上清液在260 nm 處的吸光度可以分析細(xì)胞膜的完整性[16]。將100 倍MIC濃度和100 倍MBC濃度的ASSF溶于400 μL 甲醇中，將樣品溶液及陰性對照400 μL 甲醇加入到裝有40 mL 的MH 肉湯培養(yǎng)基的100 mL 的錐形燒瓶中。向錐形瓶中分別加入400 μL 哈氏弧菌懸液（1×106cfu/mL）后充分混勻。在37 ℃和160 r/min 下水浴振蕩培養(yǎng)，分別在0 h、1 h、2 h、3 h 和4 h 收集4.0 mL 細(xì)菌樣品裝入10 mL 離心管，在5 000 r/min 下離心10 min，測定上清液在260 nm 處的吸光度。實驗設(shè)三組平行，分別以平均吸光度和培養(yǎng)時間為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，研究ASSF對哈氏弧菌細(xì)胞膜完整性的影響。

通過測定ASSF 處理的哈氏弧菌懸液的電導(dǎo)率來評估細(xì)胞膜的滲透性。在260 nm 處測定吸光度后，將2.0 mL 上清液和8.0 mL 蒸餾水添加到20 mL燒杯中。充分混勻后用電導(dǎo)率測定筆測量其電導(dǎo)率，以電導(dǎo)率值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞膜通透性的影響曲線。

1.2.8 細(xì)胞壁的通透性

堿性磷酸酶（AKP）存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，正常情況下在細(xì)胞外不能檢測到其活性，如果細(xì)胞壁被破壞，增加通透性，便可檢測到AKP 的泄露。AKP 檢測試劑盒的原理是AKP 會分解磷酸苯二鈉進而產(chǎn)生游離酚和磷酸，然后在堿性溶液中，酚與4-氨基安替吡啉通過鐵氰化鉀氧化生成最大吸光度為520 nm 的紅色醌衍生物[15]。將100 倍MIC濃度的ASSF 和100 倍MBC 濃度的ASSF 溶于400 μL 甲醇中。向裝有40 mL MH 肉湯培養(yǎng)基的100 mL 的錐形瓶中分別加入100 倍MIC 濃度和100 倍MBC 濃度的ASSF 甲醇溶液400 μL，以等體積甲醇作陰性對照。分別向錐形瓶中加入400 μL 哈維氏弧菌懸液（1×106cfu/mL）后充分混勻。在37 ℃和160 r/min 下水浴振蕩培養(yǎng)，分別在0 h、3 h、6 h、9 h和12 h 收集4.0 mL 細(xì)菌樣品裝入10 mL 離心管，在5 000 r/min 下離心10 min，取上清液0.1 mL 于1.0 mL 離心管中，分別加入100 μL 緩沖液和基質(zhì)液充分混勻后，37 ℃下水浴加熱15 min 后加入400 μL 顯色劑混勻。吸取100 μL 加入96 孔微量滴定板中，平行三組，測定在520 nm 處的吸光度。以吸光度平均值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞壁通透性的影響曲線。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

實驗均重復(fù)進行3 次，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用T 檢驗確定組間的顯著性差異。星號（*）表示P ＜0.05，有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參抗哈氏弧菌活性物質(zhì)（ASSF）的提取工藝優(yōu)化

提取溶劑、溶劑濃度、提取溫度、提取時間和液料比等因素對苦參提取物抗哈氏弧菌活性的影響見圖1。乙醇較甲醇、蒸餾水作提取溶劑時，抗菌活性物質(zhì)的提取效果較好（圖1-a）。隨著乙醇濃度的升高，提取物的抑菌圈直徑增大，這表明ASSF 主要為疏水性物質(zhì)（圖1-b）。在60 ℃～80 ℃下，ASSF 抑菌圈直徑隨溫度升高而增大，但溫度過高ASSF 某些活性物質(zhì)分解，抑菌效果隨之降低（圖1-c）。提取120～150 min 時，ASSF 抑菌圈直徑隨時間延長而增加，提取180 min 時，抑菌圈直徑降低，表明時間太久破壞了ASSF 某些活性物質(zhì)（圖1-d）。當(dāng)液料比從10∶1 mL/g 增長為30∶1 mL/g 時，抑菌圈的直徑隨之增加。但隨著比例的增加，抑制區(qū)直徑不再增加（圖1-e）。

圖1 不同因素對苦參提取物抗哈氏弧菌活性的影響Fig.1 Effect of different variables on the antibacterial activity of the extracts against V.harveyi

因此，將提取溶劑確定為無水乙醇，提取溫度80℃、提取時間150 min、液料比30∶1 mL/g 作為Box-Behnken 設(shè)計中三個自變量的中心點用于ASSG 提取工藝的優(yōu)化。

Box-Behnken 設(shè)計由17 個測試點組成，其中12 個是階乘點，5 個是中心點的重復(fù)。以提取溫度（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）作為自變量，以苦參提取物對哈氏弧菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)變量（Y，mm），設(shè)計的因素組合及響應(yīng)值如表1 所示。

通過對實驗數(shù)據(jù)的多元回歸分析，建立的多元二次回歸方程如下:

方差分析結(jié)果如表2 所示，模型的P 值（0.0001）非常顯著，而失擬項值（0.1362）不顯著，表明構(gòu)建模型的適應(yīng)性非常顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2（0.9729）非常接近于1，表明回歸模型很好地定義了系統(tǒng)的真實行為。此外，提取溫度的線性影響顯著（P＜0.05），提取溫度、提取時間和液料比的二次效應(yīng)影響極顯著（P＜0.01）。

表2 方差分析表Tab.2 Variance analysis table

通過回歸模型預(yù)測得到的ASSF 提取工藝最佳參數(shù)為：X1=79 ℃，X2=146 min，X3=30 mL/g，抑菌圈直徑預(yù)測最大值為17.54 mm。按上述優(yōu)化條件進行驗證試驗，實際得到的ASSF 抑菌圈的平均值為（17.64±0.22）mm（n=3），與預(yù)測值無顯著差異。這說明單因素試驗、Box-Behnken 設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面法用于ASSF 提取工藝優(yōu)化的可行性。隨后，將提取物減壓蒸發(fā)干燥得到固體ASSF，得率為（21.17±0.91）%（n=3）。

2.2 ASSF 化學(xué)成分的鑒定及抑菌活性研究

采用高效液相色譜法，以苦參酮標(biāo)準(zhǔn)品作為對照鑒定了ASSF 中的化學(xué)成分。圖2-a 顯示苦參酮的HPLC 圖中，保留時間（tR）為45.097 min。同一條件下，ASSF 的HPLC 圖中具有包括苦參酮在內(nèi)的多種化學(xué)成分，比較峰的吸收光譜鑒定出ASSF 中保留時間（tR）為44.239 min 的峰為苦參酮（圖2-b）。

圖2 苦參酮標(biāo)準(zhǔn)品（a）和ASSF（b）的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of kurarinone standard (a) and ASSF (b)

分別將保留時間為10.456 min、40.091 min、40.762 min、苦參酮及47.362 min 的吸收峰的洗脫液收集后，減壓濃縮干燥。用牛津杯法測定ASSF 及其5 個化學(xué)成分抑制哈氏弧菌的活性，ASSF 和苦參酮對哈氏弧菌的MIC 分別為0.125 mg/mL 和0.062 5 mg/mL，而其他4 個化學(xué)成分的MIC 均大于2 mg/mL，說明苦參酮是ASSF 的主要抑菌活性分子。試管稀釋法測定ASSF 對哈氏弧菌的MIC 和MBC 分別為0.125 mg/mL 和0.25 mg/mL。

2.3 ASSF 抗哈氏弧菌的作用機理

2.3.1 ASSF 對哈氏弧菌生長的影響

對照組的哈氏弧菌菌株在前6 h 緩慢增長，在6～12 h 時達到對數(shù)生長期。1 倍MIC 濃度下的ASSF 組在0～9 h 內(nèi)未見明顯增長，9 h 后開始明顯增長（圖3），這表明ASSF 在MIC 濃度下可以抑制哈氏弧菌的生長，但隨著時間的延長，ASSF 被消耗，抑制作用逐漸減弱。MBC 濃度下的ASSF 組在24 h 內(nèi)仍未見明顯增長，說明ASSF 濃度越高，對哈氏弧菌生長的抑制效果越明顯。

圖3 ASSF 對哈維氏弧菌生長曲線的影響Fig.3 Effect of ASSF on the growth of V.harveyi

2.3.2 ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞膜完整性和通透性的影響

ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞膜完整性的影響結(jié)果如圖4 所示。對照組的吸光度幾乎沒有變化，MIC 和MBC 濃度下ASSF 處理組的細(xì)菌培養(yǎng)物在260 nm處的吸光度值隨時間的延長明顯增加，說明菌液中有生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)）發(fā)生泄漏，即細(xì)胞膜完整性遭到破壞。MBC 濃度下ASSF 組的吸光度值明顯高于MIC 濃度下的ASSF 處理組，說明ASSF對哈氏弧菌細(xì)胞膜完整性的破壞效應(yīng)具有濃度依賴性。

圖4 ASSF 對哈維氏弧菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of ASSF on the cell membrane integrity of V.harveyi

ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果如圖5 所示。MIC 和MBC 濃度下ASSF 處理組的電導(dǎo)率明顯高于對照組，且隨著時間的延長，電導(dǎo)率值不斷增大。說明ASSF 能夠破壞哈氏弧菌的細(xì)胞膜，增大了細(xì)胞膜的通透性。MBC 濃度下ASSF 處理組的電導(dǎo)率明顯高于MIC 處理組，說明ASSF 對細(xì)胞膜通透性的破壞效應(yīng)具有濃度依賴性。

圖5 ASSF 對哈維氏弧菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig.5 Effects of ASSF on the cell membrane permeability of V.harveyi

2.3.3 ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞壁通透性的影響

ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞壁通透性的影響結(jié)果見圖6。在520 nm 處，MIC 和MBC 濃度下ASSF 處理組的吸光度值均高于對照組，且吸光度值隨著時間增加而逐漸增大。由此可推測，ASSF 增大了哈氏弧菌細(xì)胞壁的通透性，導(dǎo)致堿性磷酸酶泄漏量上升。MIC 濃度下ASSF 處理組的吸光度值低于MBC 濃度下ASSF 處理組的吸光度值，說明ASSF 增加哈氏弧菌細(xì)胞壁通透性的效應(yīng)具有濃度依賴性。

圖6 ASSF 對哈氏弧菌細(xì)胞壁通透性的影響Fig.6 Effects of ASSF on the cell wall permeability of V.harveyi

3 討論

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖抗生素替代品的開發(fā)主要集中在益生菌[17]、微生物代謝產(chǎn)物[4,18]、植物及其提取物[19,20]。中草藥應(yīng)用于人類疾病防治已有數(shù)千年的歷史。藥用植物的粗粉、提取物或混合物具有預(yù)防和治療水產(chǎn)動物疾病的良好前景，并已進行了一定的研究[19,20]。但在實際應(yīng)用中存在許多困難，如療效不穩(wěn)定、有效成分不明等。因此，提高藥用植物抗水產(chǎn)病原菌活性物質(zhì)的純度、鑒定其活性化合物，有助于水產(chǎn)抗生素替代品的研發(fā)。前期工作中，筆者已研究了中草藥大黃和五倍子抗哈氏弧菌活性物質(zhì)的提取工藝、鑒定出蘆薈大黃素和大黃酸是大黃的主要抗菌活性成分和沒食子酸是五倍子的主要抗菌活性分子[7,16]。本研究采用單因素實驗和Box-Behnken 設(shè)計優(yōu)化了苦參抗哈氏弧菌活性物質(zhì)的提取工藝，并進一步鑒定出苦參酮是苦參抗哈氏弧菌的主要活性分子。

苦參酮是一種天然生物活性黃酮類化合物，可從中草藥苦參和秦艽中分離得到[21,22]。據(jù)報道，苦參酮具有抗腫瘤[21]、抗炎[23]、抗菌[24]、抗氧化[25]和調(diào)節(jié)免疫等活性[26]。盡管已有研究表明苦參酮對人病原菌具有抗菌作用，但尚無關(guān)于其抗水產(chǎn)病原菌作用的報道。本文首次證明了苦參酮具有抗水產(chǎn)病原哈氏弧菌的作用，可用于防制水生動物疾病。進一步探討苦參酮在水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中作為生物防治劑的可行性，還需要進行更深入的研究。有必要比較苦參酮與水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗生素對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生長、健康和對病原菌抵抗力的影響。

結(jié)論

采用單因素實驗、Box-Behnken 法和響應(yīng)面法優(yōu)化了苦參抗哈氏弧菌活性物質(zhì)的提取工藝。優(yōu)化的提取工藝為：無水乙醇為溶劑，液料比30∶1 mL/g，提取溫度79 ℃，提取時間146 min。固態(tài)提取物的得率為（21.17±0.91）%（n=3）?？鄥⒖顾a(chǎn)病原哈氏弧菌的主要活性分子為苦參酮，苦參抗菌提取物和苦參酮對哈氏弧菌的MIC 分別為0.125 mg/mL和0.0625 mg/mL。作用機理研究表明，抗菌提取物通過破壞哈氏弧菌細(xì)胞膜的完整性和通透性、細(xì)胞壁的通透性而影響細(xì)胞的生長，表現(xiàn)出良好的抗哈氏弧菌活性。本研究成果為苦參酮在水產(chǎn)動物細(xì)菌性病害防治中的開發(fā)和應(yīng)用提供了依據(jù)。