不同劑量的地龍?zhí)崛∥飳Ψ卫w維化小鼠肺組織波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平及纖維化程度的影響▲

陳 宏 王文增 李可心 王玉葉 張明浩 鄧琳千 張佩穎 趙建云 陳 群

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒一科,黑龍江省哈爾濱市 150040;黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)人民醫(yī)院2 神經(jīng)內(nèi)科,3 檢驗科,黑龍江省哈爾濱市 150300)

肺纖維化是一種肺間質(zhì)性疾病,是結(jié)締組織病的常見并發(fā)癥,其發(fā)病機制及誘因復(fù)雜,主要的病理過程為纖維細(xì)胞病理性增生分化為肌成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致肺組織增厚,肺泡通氣量減少,進(jìn)而引起呼吸困難和呼吸衰竭等癥狀[1-2]。目前尚無治療該病的特效藥物,患者預(yù)后較差,病死率高,且近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[3]。西醫(yī)治療肺纖維化的常用藥物為吸入激素類氣霧劑、色甘酸鈉氣霧劑等,這些藥物雖然起效快,但長期服用容易產(chǎn)生耐藥性,而停藥后在誘因作用下容易導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。中醫(yī)認(rèn)為肺纖維化屬于“絡(luò)病”范疇,肺絡(luò)瘀阻是肺纖維化進(jìn)展的主要病機。地龍是我國重要的中藥材之一,其是蚯蚓的干燥體,富含多種氨基酸,具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘的功效[4],用于治療肺纖維化時可以發(fā)揮化痰散結(jié)、活血化瘀、消癥解毒、補益肺腎的作用。研究表明,波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白參與了肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。我們推測,地龍可能通過調(diào)節(jié)波形蛋白及α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)而改善肺纖維化。為此,本研究探討不同劑量的地龍?zhí)崛∥飳Ψ卫w維化小鼠模型肺組織波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平及纖維化程度的影響,為地龍?zhí)崛∥镏委煼卫w維化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57小鼠90只,8～10周齡,體重(22.3±3.5)g,購于青龍山動物繁殖中心[許可證號:SCXK(蘇)2017-0001],飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心,環(huán)境溫度(23.0±1.5)℃,相對濕度(50.0±3.5)%,自由飲食。本研究遵循實驗動物護(hù)理指南的原則,并已通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗倫理審查委員會審查及批準(zhǔn)。

1.2 主要實驗試劑 百草枯(北京百靈威科技有限公司,批號:2020-35-5;濃度>98%);地龍干燥飲片(廣東天誠中藥飲片有限公司,批號:2020-20-8);波形蛋白一抗和α-平滑肌肌動蛋白一抗(Abcam公司,批號:ab32575、ab92547),HE染色試劑(上海舜田生物科技有限公司,批號:SBT10001),Masson染色試劑(北京索萊寶科技有限公司,批號:G1340),辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗(湖北鴻鑫瑞宇精細(xì)化工有限公司,批號:275-632-5),GAPDH 抗體(Proteintech Group,Inc.,批號:ELK8632)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及建模方法:按隨機數(shù)字表法將小鼠分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組,每組18只。除空白組外,其余4組均通過一次性腹腔注射40 μmol/L百草枯(18 mg/kg)建立肺纖維化模型[7]。給予空白組小鼠腹腔注射等量無菌生理鹽水。

1.3.2 地龍?zhí)崛∥锏奶崛》椒靶∈蟮母深A(yù)方法:(1)地龍?zhí)崛∥锏奶崛?。將地龍干燥飲片剪碎并用乙醇回流提?次,過濾回收后濃縮,并溶于5 mL生理鹽水備用。(2)小鼠的干預(yù)方法。建模后1周,分別給予高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠灌服80 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)地龍?zhí)崛∥?1次/d,干預(yù)14 d。給予空白組和模型組小鼠灌服等量的生理鹽水。

1.3.3 Western blot檢測波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的相對表達(dá)水平:以小鼠建模當(dāng)天記為第0天,分別于建模后第14天、第21天和第28天,采集各組小鼠右肺組織,采用Western blot檢測波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白相對表達(dá)水平。于每個時間點,每組選取6只小鼠,采用脫頸椎法處死,解剖小鼠后分離其新鮮右肺組織并稱重,冰上研磨后,采用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,利用二喹啉甲酸法檢測細(xì)胞蛋白濃度。取95 ℃高溫變性后的150 μg蛋白,通過SDS-PAGE分離等量蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶在4 ℃下封閉PVDF膜1 h,用TBST洗膜3次,5 min/次,然后加入波形蛋白一抗(1 ∶500)、α-平滑肌肌動蛋白一抗(1 ∶500)及GAPDH一抗(1 ∶2 000),4 ℃濕盒孵育過夜,TBST洗膜3次,5 min/次,再將膜置于辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1 ∶3 000)中,室溫孵育1 h,TBST洗膜5次,5 min/次。以GAPDH為內(nèi)參蛋白,顯影曝光后,利用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值[8]。

1.3.4 肺組織HE染色及Masson染色:建模第21天,采用脫頸椎法處死小鼠,用滅菌生理鹽水進(jìn)行心臟灌流后,取左上肺組織,將其固定于4%的多聚甲醛,經(jīng)石蠟包埋、切片后,進(jìn)行HE染色和Masson染色,嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行操作。其中HE 染色的切片用于評估肺組織纖維化情況,Masson染色的切片用于觀察肺組織膠原沉積情況[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時間點各組小鼠肺組織波形蛋白表達(dá)水平的比較 建模后第14天,模型組及各劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達(dá)水平均高于空白組(均P<0.05)。建模后第21天及第28天,模型組小鼠肺組織的波形蛋白表達(dá)水平均高于空白組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05)。建模后第28天,高劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達(dá)水平低于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組小鼠肺組織波形蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 不同時間點各組小鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平的比較 建模后第14天,模型組和各劑量組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平均高于空白組(均P<0.05)。建模后第21天及第28天,模型組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平均高于空白組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05)。建模后第28天,高劑量組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平均低于中劑量組與低劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 不同時間點各組小鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.3 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果 建模第21天時,空白組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡清晰,未見肺泡間隔明顯增厚等纖維化表現(xiàn);模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)異常,正常肺泡結(jié)構(gòu)消失,肺泡壁明顯增厚,成纖維細(xì)胞增生明顯;相較于模型組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠的肺纖維化程度明顯減輕,肺泡結(jié)構(gòu)相對完整,且地龍?zhí)崛∥餄舛仍礁?小鼠肺組織結(jié)構(gòu)越完整,纖維化程度越輕。見圖1。

空白組 模型組 高劑量組 中劑量組 低劑量組

2.4 各組小鼠肺組織Masson染色結(jié)果 建模第21天時,空白組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,少見藍(lán)色的膠原纖維沉淀;模型組小鼠肺泡間隔和間質(zhì)均存在大量藍(lán)色沉淀,肺泡結(jié)構(gòu)異常;相較于模型組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺泡間隔和間質(zhì)的藍(lán)色沉淀明顯減少,肺泡結(jié)構(gòu)相對完整,且地龍?zhí)崛∥餄舛仍礁?上述改善越明顯。見圖2。

空白組 模型組 高劑量組 中劑量組 低劑量組

3 討 論

目前,肺纖維化的發(fā)病機制尚未完全清楚,其病理過程主要為肺間質(zhì)細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)沉積,導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞大量形成,進(jìn)而引起呼吸困難和肺功能衰竭[10]。研究表明,肺纖維化的發(fā)生與炎癥、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞等有關(guān),而且多種細(xì)胞因子參與其中[11]。波形蛋白是細(xì)胞骨架蛋白,正常情況下在間葉組織中表達(dá),其表達(dá)水平與肺纖維化程度呈正相關(guān),可作為反映肺纖維化進(jìn)程的標(biāo)志物[12]。α-平滑肌肌動蛋白是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物及平滑肌細(xì)胞收縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),其具有較強的收縮能力及促進(jìn)膠原合成能力,能促進(jìn)膠原沉積并形成纖維化,其表達(dá)水平與肺纖維化程度呈正相關(guān)[13]。

肺纖維化屬于中醫(yī)的“絡(luò)病”范疇,由肺絡(luò)瘀阻所致,因此中醫(yī)認(rèn)為消除絡(luò)脈之瘀濁、保持脈(經(jīng))絡(luò)氣血通暢和肺絡(luò)無損是治療肺纖維化及肺系脈絡(luò)病的關(guān)鍵[14]。地龍是較早被應(yīng)用的動物類藥物之一,其由蚯蚓去除雜質(zhì)、炒制干燥制成,味咸、寒,歸肝、脾、膀胱經(jīng),具有清熱定痙、通絡(luò)、平喘、利尿的功效,在治療肺纖維化的多個中醫(yī)方劑中均有地龍[15]。有研究表明,地龍能下調(diào)肝臟細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平,改善小鼠肺纖維化程度[16],但其最佳的干預(yù)劑量目前仍有爭議。本研究采用百草枯建立肺纖維化小鼠模型,結(jié)果顯示,模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)異常,正常肺泡結(jié)構(gòu)消失,肺泡壁明顯增厚,成纖維細(xì)胞增生明顯,且建模后第14天,模型組小鼠肺組織的波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平均高于空白組(均P<0.05)。這說明肺纖維化小鼠模型建模成功。本研究結(jié)果還顯示,建模后第21天起,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺組織的波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05);建模后第28天,高劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達(dá)水平低于低劑量組,α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平均低于中劑量與低劑量組(均P<0.05)。這提示地龍?zhí)崛∥锟梢砸种品卫w維化模型小鼠肺組織波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá),且高劑量地龍?zhí)崛∥锏男Ч选E染色和Masson染色結(jié)果顯示,高劑量組、中劑量組和低劑量組小鼠在肺組織結(jié)構(gòu)及膠原纖維沉淀等方面的改善程度均優(yōu)于模型組,且地龍?zhí)崛∥餄舛仍礁?改善程度越明顯,表明地龍?zhí)崛∥锬軌蛴行ПＷo(hù)肺纖維化模型小鼠肺組織結(jié)構(gòu),減輕纖維化及膠原沉積,以高劑量地龍?zhí)崛∥镄Ч罴选?/p>

綜上所述,地龍?zhí)崛∥锬苡行б种品卫w維化小鼠肺組織中波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá),減少肺組織膠原沉積,延緩肺纖維化的進(jìn)程,其中高劑量[80 mg/(kg·d)]地龍?zhí)崛∥锏男Ч罴?。但本研究例?shù)較少,可能對結(jié)果產(chǎn)生影響,故所得結(jié)論仍需進(jìn)一步研究加以證實。