榆黃湯對(duì)激素依賴性皮炎豚鼠的治療效果及可能作用機(jī)制▲

熊 飛 曹經(jīng)江

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院皮膚科,湖北省宜昌市 443000)

激素依賴性皮炎是長(zhǎng)期不規(guī)范局部使用糖皮質(zhì)激素制劑導(dǎo)致用藥期間皮膚疾病消失,而停藥后出現(xiàn)皮膚損傷的一類炎癥性皮膚疾病[1-2]。此類患者的臨床表現(xiàn)主要為丘疹、紅斑、痤瘡樣或酒糟鼻樣皮疹,常伴有脫屑、干燥、灼痛、瘙癢等表現(xiàn)[3]。目前,臨床上主要采用免疫抑制劑或激素類藥物遞減等方法進(jìn)行治療,但效果并不顯著,部分患者短期內(nèi)會(huì)出現(xiàn)反跳現(xiàn)象,且出現(xiàn)不同程度的副作用[4-6]。中醫(yī)具有整體觀和辨證論治兩大特點(diǎn),中醫(yī)認(rèn)為激素依賴性皮炎屬于“中藥毒”范疇,病機(jī)為風(fēng)、熱、毒邪阻滯面部,治療應(yīng)以清熱涼血、解毒、祛風(fēng)止癢為主要原則,中醫(yī)藥內(nèi)服、中藥外用、中西醫(yī)結(jié)合、針灸均可改善面部皮損[7]。我院院內(nèi)制劑榆黃湯由黃柏、地榆、野菊花、蒲公英、黃芩組成,具有清熱利濕、解毒的功效。前期臨床研究已證實(shí)榆黃湯對(duì)面部變應(yīng)性接觸性皮炎的療效顯著[8],但是關(guān)于其治療激素依賴性皮炎的臨床數(shù)據(jù)較少。因此,本研究使用豚鼠建立激素依賴性皮炎模型,基于體內(nèi)研究探討榆黃湯治療激素依賴性皮炎的效果及可能機(jī)制,從而為臨床上治療激素依賴性皮炎提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康豚鼠40只,體重(300±20)g,雌雄各半,月齡3～5個(gè)月,購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXN(鄂)2010-0041]。于無(wú)菌、溫度為18 ℃～22 ℃、濕度為40%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲食,每12 h光暗交替。

1.2 主要藥物和試劑 榆黃湯湯劑由三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院制備,湯劑組成包括地榆30 g、 黃柏30 g、 黃芩20 g、 蒲公英20 g、 野菊花20 g, 加水10 L, 武火煎煮20 min后文火煎煮40 min,過(guò)濾后得中藥煎液5 L,低溫保存。鹵米松乳膏購(gòu)自重慶華邦制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字:H20153118),他克莫司軟膏購(gòu)自四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司(國(guó)藥準(zhǔn)字:H20123430),IgE ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6 ELISA試劑盒、IL-8 ELISA試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司(批號(hào):042911、170924、092743),CD8+T淋巴細(xì)胞分選試劑盒購(gòu)自北京匯智和源生物技術(shù)有限公司(批號(hào):A001417)。

1.3 建模方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只豚鼠分為藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、模型組和空白對(duì)照組,每組10只。于實(shí)驗(yàn)前24 h給予各組豚鼠背部去毛,范圍約3 cm×3 cm。空白對(duì)照組不做處理,將鹵米松乳膏涂于藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和模型組豚鼠背部,2次/d,連續(xù)外用15 d,構(gòu)建激素依賴性皮炎模型。停藥3 d后,涂藥區(qū)域出現(xiàn)紅斑、腫脹等炎癥反應(yīng)則表明造模成功,本研究30只豚鼠均造模成功。

1.4 干預(yù)方法 造模成功后7 d,給予藥物對(duì)照組豚鼠皮損部位涂抹他克莫司軟膏,早晚各1次,連續(xù)干預(yù)21 d;給予實(shí)驗(yàn)組豚鼠皮損部位冷敷榆黃湯紗條(浸透榆黃湯湯劑的醫(yī)用紗布,大小超過(guò)背部皮損)20 min,早晚各1次,連續(xù)干預(yù)21 d;給予模型組豚鼠皮損部位冷噴生理鹽水20 min,早晚各1次,連續(xù)干預(yù)21 d。空白對(duì)照組不做處理。

1.5 觀察指標(biāo) (1)干預(yù)21 d后,完成其他指標(biāo)檢測(cè)后處死豚鼠,取背部皮損組織(空白對(duì)照組取去毛處皮膚組織),置于多聚甲醛固定液進(jìn)行固定,然后依次進(jìn)行沖洗、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色,在顯微鏡(OLYMPUS公司,型號(hào):BH-2)下觀察皮膚各層細(xì)胞變化情況,并采用VISIA?皮膚檢測(cè)系統(tǒng)(Canfield Scientific,Inc.)測(cè)量表皮層、真皮層厚度(單位為μm)。(2)造模成功后,于干預(yù)前及干預(yù)21 d后采用生理鹽水清洗豚鼠皮損處皮膚(清洗空白對(duì)照組豚鼠去毛處皮膚)并擦干,用適當(dāng)力度將皮脂測(cè)試分析儀(Courega+Khazaka electronic GmbH,型號(hào):Sebumeter?SM 815)的探頭垂直于皮膚表面測(cè)量油脂含量,連續(xù)測(cè)量3次取平均值。(3)造模成功后,于干預(yù)前及干預(yù)21 d后,抽取豚鼠尾部靜脈血0.5 mL(共2管)。其中,一管血標(biāo)本于4℃下以3 000 r/min離心10 min后獲得血清,采用ELISA檢測(cè)血清IgE、IL-6、IL-8水平。另一管血標(biāo)本經(jīng)肝素抗凝后,取100 μL全血加入檢測(cè)管中,并加入CD8+單標(biāo)單克隆抗體(10 μg/mL),避光孵育20 min后,用PBS洗滌1次,再用0.5mL PBS重懸,采用流式細(xì)胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號(hào):FACSCantoⅡ)檢測(cè)CD8+T淋巴細(xì)胞比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié) 果

2.1 4組豚鼠皮損組織HE染色結(jié)果的比較 HE染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組豚鼠去毛處皮膚組織的表皮層細(xì)胞排列整齊,真皮層膠原纖維排列整齊、均一;模型組豚鼠皮損組織過(guò)度角化,表皮棘層增厚,且棘層細(xì)胞水腫,真皮層存在大量炎癥細(xì)胞;藥物對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組豚鼠皮損組織的角質(zhì)層增厚,棘層細(xì)胞水腫情況有所減輕,真皮層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,兩組HE染色結(jié)果無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色結(jié)果(×400)

2.2 4組豚鼠表皮厚度及真皮厚度的比較 相較于空白對(duì)照組,模型組、藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠的表皮厚度和真皮厚度更薄(均P<0.05);相較于模型組,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠的表皮厚度和真皮厚度更厚(均P<0.05);藥物對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組豚鼠的表皮厚度和真皮厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組豚鼠表皮厚度及真皮厚度的比較(x±s,μm)

2.3 干預(yù)前后4組豚鼠皮膚油脂含量的比較 干預(yù)前,相較于空白對(duì)照組,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠皮膚油脂含量均更低(均P<0.05),而藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠皮膚的油脂含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。干預(yù)21 d后,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠皮膚油脂含量均較干預(yù)前增加(均P<0.05);相較于空白對(duì)照組,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠皮膚油脂含量均更低(均P<0.05);相較于模型組,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠皮膚油脂含量均更高(均P<0.05);而藥物對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組豚鼠皮膚油脂含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 干預(yù)前后4組豚鼠皮膚油脂含量的比較(x±s,μg/cm2)

2.4 干預(yù)前后4組豚鼠血清IgE水平的比較 干預(yù)前,相較于空白對(duì)照組,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠血清IgE水平均更高(均P<0.05),而藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠血清IgE水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。干預(yù)21 d后,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清IgE水平均較干預(yù)前下降(均P<0.05);相較于空白對(duì)照組,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠血清IgE水平均更高(均P<0.05);相較于模型組,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清IgE水平均更低(均P<0.05);而藥物對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清IgE水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 干預(yù)前后4組豚鼠血清IgE水平的比較(x±s,mg/L)

2.5 干預(yù)前后4組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例的比較 干預(yù)前,相較于空白對(duì)照組,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例均更低(均P<0.05),而藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。干預(yù)21 d后,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例均較干預(yù)前上升(均P<0.05);相較于空白對(duì)照組,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例均更低(均P<0.05);相較于模型組,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例均更高(均P<0.05);而藥物對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 干預(yù)前后4組豚鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例的比較(x±s,%)

2.6 干預(yù)前后4組豚鼠血清IL-6、IL-8水平的比較 干預(yù)前,相較于空白對(duì)照組,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均更高(均P<0.05),而藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠血清IL-6、IL-8水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。干預(yù)21 d后,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均較干預(yù)前下降(均P<0.05);與空白對(duì)照組比較,藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及模型組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均更高(均P<0.05);相較于模型組,藥物對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均更低(均P<0.05);而藥物對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清IL-6、IL-8水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 干預(yù)前后4組豚鼠血清IL-6、IL-8水平的比較(x±s,ng/L)

3 討 論

激素依賴性皮炎是停用長(zhǎng)期外用的糖皮質(zhì)激素制劑后導(dǎo)致原有皮膚病復(fù)發(fā)或加重,迫使患者再次使用糖皮質(zhì)激素制劑治療的疾病[9-11]。激素依賴性皮炎患者的病情反復(fù)且難以痊愈,特別是面部激素依賴性皮炎可能導(dǎo)致毀容,不僅給患者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而且嚴(yán)重影響患者的心理健康[9,12]。

中醫(yī)將激素依賴性皮炎歸于“中藥毒”范疇,風(fēng)邪侵襲為本病的病機(jī)之一[13]。激素依賴性皮炎的皮損常見(jiàn)于面部,并可使得面部皮膚敏感性增加,患者表現(xiàn)為怕風(fēng)、不耐寒熱,這也進(jìn)一步佐證風(fēng)邪侵襲為該病病機(jī)之一。但風(fēng)邪多不單獨(dú)致病,常與濕熱相結(jié)合。此外,激素類藥物屬辛燥、甘溫之品,長(zhǎng)期使用可助陽(yáng)生熱、傷津傷陰,以致毒熱之邪侵襲[5,14]。榆黃湯為我院院內(nèi)制劑,主要成分為地榆、黃柏、黃芩、野菊花、蒲公英。地榆可解毒斂瘡、止血涼血,具有抗氧化、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等作用,可作為燒傷、燙傷等外傷常用藥[15]。黃柏和黃芩均具有瀉火解毒、清熱燥濕之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明,黃柏具有局部抗炎、抗感染、清除自由基等作用,并可抑制致病菌的增殖和定植;黃芩的主要作用成分為黃芩素,具有抗氧化、增強(qiáng)或抑制免疫功能雙向調(diào)節(jié)作用[8]。黃柏與黃芩合用可增強(qiáng)清熱解毒的功效[16]。野菊花和蒲公英均為治療疔瘡癰腫的中藥。野菊花的主要活性成分為萜類、揮發(fā)油和黃酮類化合物,具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、清除氧自由基等作用[8]。蒲公英的主要成分為揮發(fā)油、黃酮類,同樣具有抗腫瘤、抗炎等功效[17]。諸藥合用,共奏清熱解毒、祛風(fēng)止癢之功。本研究結(jié)果表明,激素依賴性皮炎豚鼠的皮損組織炎癥浸潤(rùn)明顯,皮損處油脂含量減少,表皮及真皮變薄,而經(jīng)榆黃湯干預(yù)后,激素依賴性皮炎豚鼠的皮損組織炎癥及棘層細(xì)胞水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張等情況明顯減輕,皮損處油脂含量、表皮厚度及真皮厚度增加,且作用效果與西藥他克莫司相似。這說(shuō)明榆黃湯對(duì)激素依賴性皮炎具有較好的干預(yù)作用。

長(zhǎng)期使用激素類藥物可抑制表皮細(xì)胞的增殖、分化等,進(jìn)而影響皮膚屏障功能,再加上外界因素的刺激,可導(dǎo)致皮炎復(fù)發(fā),此時(shí)機(jī)體炎癥介質(zhì)過(guò)度表達(dá),血清IgE水平顯著上升[18]。此外,激素類藥物還可抑制巨噬細(xì)胞功能,導(dǎo)致外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例降低,CD4+/CD8+值失衡[18]。而CD8+T淋巴細(xì)胞比例下降可誘發(fā)大量炎癥因子如IL-6、IL-8等的釋放,進(jìn)而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能,促進(jìn)皮炎的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示,激素依賴性皮炎豚鼠的血清IgE、IL-6、IL-8水平上升,而外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例有所下降;經(jīng)他克莫司或榆黃湯干預(yù)后,激素依賴性皮炎豚鼠的血清IgE、IL-6、IL-8水平均有所下降,而外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例有所上升,且兩種藥物效果相似。這說(shuō)明榆黃湯可減輕激素依賴性豚鼠的炎癥反應(yīng),并可改善其免疫功能。

綜上所述,榆黃湯對(duì)激素依賴性皮炎豚鼠模型具有較好的干預(yù)作用,其機(jī)制可能與減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)、改善免疫功能有關(guān)。榆黃湯的作用效果與他克莫司相似,或許可作為免疫抑制劑的替代藥物,用于治療激素依賴性皮炎。