李夢(mèng)雨,孫玉江,李超程,呂毅航,范洪先,鄭新寶,肖海霞,賈斌*

(1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109;3 新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所,新疆 烏魯木齊 830000)

阿膠和驢乳產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展,使驢皮和驢乳出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀,驢繁殖力低成為制約驢產(chǎn)業(yè)發(fā)展最直接的問(wèn)題[1]。因此,研究驢的性控技術(shù),擴(kuò)大繁殖母驢數(shù)量,實(shí)現(xiàn)高效快速擴(kuò)繁種群,定向培育母畜群體勢(shì)在必行。

睪丸決定因子TDF(testis-determining factor)的發(fā)現(xiàn),使胚胎階段的性別分化成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在Y染色體短臂上存在可以調(diào)控精細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精子的基因[2],分別是睪丸決定因子SRY、精原細(xì)胞增殖因子Eif2s3y[3]和影響精子成熟的轉(zhuǎn)錄因子Zfy2[4]。多種研究表明,Zfy基因是C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(ZNFs)的家族成員之一,當(dāng)敲除Zfy的雙等位基因發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖出現(xiàn)缺陷[5]。隨后研究發(fā)現(xiàn),Zfy基因通過(guò)“鋅指”結(jié)構(gòu)域來(lái)調(diào)控其他基因的表達(dá),影響精子的發(fā)生過(guò)程[6]。RNAi技術(shù)作為疾病靶向基因治療的新手段,已被用于各種疾病的治療。應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默Zfy基因表達(dá),使精子在生精階段相關(guān)基因表達(dá)量變化,從而影響Y精子活力、畸形率等,Y精子與卵子結(jié)合的幾率降低,而X精子不受影響,從而達(dá)到精子發(fā)生階段控制性別的目的。

本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)針對(duì)驢Zfy基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)RNA干擾片段,構(gòu)建shRNA串聯(lián)載體,通過(guò)睪丸注射技術(shù),干擾Zfy基因表達(dá),使精子在發(fā)生階段Zfy基因表達(dá)下降,從而影響Y精子的發(fā)育,降低受精幾率,最終實(shí)現(xiàn)多產(chǎn)母驢的目標(biāo)。為快速擴(kuò)繁種群提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑及儀器

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司);胎牛血清、DMEM/F12(美國(guó)Gibco公司);胰島素、FSH、睪酮、視黃酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、維生素A、C、E(美國(guó)杰華科技有限公司);丙酮酸、胰蛋白酶、DNase(北京索萊寶科技有限公司);脂質(zhì)體2000(invitrogen);TBGreen?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa);QI Aamp DNA Mini and Blood Mini Hand book(凱杰生物工程有限公司)。核酸蛋白檢測(cè)儀(德國(guó)Thermo公司);熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

驢睪丸組織采自新疆石河子九昌驢業(yè)有限公司屠宰的青年健康新疆驢新鮮睪丸。

種公驢、空懷母驢由新疆喀什澤普縣金胡楊牧業(yè)有限公司提供,6頭4～6歲青年健康德州公驢,若干頭經(jīng)產(chǎn)健康新疆母驢。經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理批準(zhǔn)號(hào)分別為2020-051-01、2019-061-01,自覺(jué)遵守試驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則,保障動(dòng)物福利及安全。

1.3 主要試驗(yàn)方法

1.3.1 設(shè)計(jì)shRNA序列

根據(jù)NCBI提供的驢Zfy基因與Zfx基因的CDS區(qū)序列,選擇兩者堿基差異較大區(qū)域設(shè)計(jì)4段siRNA。分別添加loop(頸環(huán))、靶點(diǎn)反義序列及終止密碼子合成shRNA干擾片段,為每段shRNA添加U6啟動(dòng)子。將設(shè)計(jì)好的序列交由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司合成。siRNA序列信息如表1所示。

表1 siRNA序列信息

1.3.2 構(gòu)建shRNA串聯(lián)干擾載體

選擇4.7 kb質(zhì)粒載體CV250,將合成好的shRNA片段與載體重組,構(gòu)建CV250-2shRNA串聯(lián)干擾載體,并分別命名為CV250-1、CV250-2。shRNA序列和串聯(lián)載體構(gòu)建如圖1所示。

圖1 shRNA序列和CV250-2shRNA串聯(lián)載體構(gòu)建

1.3.3 細(xì)胞水平驗(yàn)證串聯(lián)干擾載體

采集成熟驢睪丸組織,采用兩步酶消化法分離出睪丸支持細(xì)胞和生精細(xì)胞,并放入完全培養(yǎng)液[7]中在35 ℃、5% CO2、濕度為95%的條件下培養(yǎng)24 h,用脂質(zhì)體2 000作為轉(zhuǎn)染試劑將1.3.2中保存的載體轉(zhuǎn)染到生精細(xì)胞中,每組重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染58 h后提取生精細(xì)胞的總RNA,設(shè)計(jì)qRT-PCR引物,以驢GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因,以重組載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為試驗(yàn)組,未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組,檢測(cè)重組串聯(lián)干擾載體轉(zhuǎn)染生精細(xì)胞后,Zfy基因的相對(duì)表達(dá)量,計(jì)算重組串聯(lián)干擾載體的干擾效率,選擇高效重組串聯(lián)干擾載體。試驗(yàn)所用引物如表2所示。

表2 Zfy、Zfx、GAPDH引物設(shè)計(jì)序列

1.3.4 體內(nèi)驗(yàn)證串聯(lián)干擾載體

將1.3.3中經(jīng)細(xì)胞水平篩選的高效重組載體CV250-1用于動(dòng)物體內(nèi)干擾試驗(yàn)。根據(jù)驢睪丸體積使用睪丸注射法將質(zhì)粒注射進(jìn)入驢睪丸組織中,共注射3針,每隔10天注射1次,每頭驢每側(cè)睪丸每次注射3 mg質(zhì)粒,第3針結(jié)束后間隔6天進(jìn)行人工授精。

因驢的妊娠期時(shí)間約365 d,妊娠周期較長(zhǎng)。因此,為加快試驗(yàn)進(jìn)程,參照前人的研究[7],選擇18周孕驢外周靜脈血血漿進(jìn)行胎兒游離DNA性別鑒定,統(tǒng)計(jì)后代性別,得到重組干擾載體干擾后代的雌性率。設(shè)計(jì)牙釉蛋白引物,以對(duì)照組(陽(yáng)性對(duì)照:種公驢DNA;陰性對(duì)照:空懷母驢DNA)和試驗(yàn)組(懷孕母驢)的胎兒游離DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。牙釉蛋白引物見(jiàn)表3。

表3 AMEL引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)采用Excel整理初始數(shù)據(jù),qRT-RCR數(shù)據(jù)采用2-△△CT進(jìn)行計(jì)算,采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(AVONA),統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SD)表示,“*”表示(P<0.05)差異顯著,“**”表示(P<0.01)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 shRNA串聯(lián)干擾載體的構(gòu)建

菌液PCR電泳結(jié)果如圖2所示,得到重組載體CV250-1質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增出1 101 bp陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子,CV250-2質(zhì)粒擴(kuò)增出1 110 bp陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子,測(cè)序結(jié)果與菌液PCR結(jié)果一致,表明干擾載體構(gòu)建成功。

1:ddH2O;2:空載自連組;3:GAPDH;M:Marker;5-10:1-6號(hào)陽(yáng)性克隆菌。圖2 菌液PCR電泳結(jié)果圖

2.2 干擾載體在生精細(xì)胞中的功能驗(yàn)證

體外共培養(yǎng)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞,在顯微鏡下觀察到貼壁生長(zhǎng)的支持細(xì)胞和附著于支持細(xì)胞上的生精細(xì)胞,生精細(xì)胞多呈圓形,中間可明顯觀察到黑色細(xì)胞核。用2個(gè)重組干擾載體和1個(gè)空白組轉(zhuǎn)染生精細(xì)胞24 h后,觀察到轉(zhuǎn)染干擾載體組有綠色熒光,表明干擾載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染組熒光表達(dá)量達(dá)到最高58 h時(shí),使用熒光顯微鏡激發(fā)綠色熒光,結(jié)果如圖3所示。

A:剛分離出來(lái)的生精細(xì)胞;B:轉(zhuǎn)染58 h生精細(xì)胞(20倍);C:轉(zhuǎn)染58 h生精細(xì)胞(40倍);D:轉(zhuǎn)染58 h生精細(xì)胞熒光觀察。圖3 驢生精細(xì)胞轉(zhuǎn)染串聯(lián)干擾載體熒光圖

以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照組、轉(zhuǎn)染干擾載體的細(xì)胞為試驗(yàn)組,將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示,與對(duì)照組細(xì)胞mRNA的相對(duì)表達(dá)量103.04±11.68%相比,CV250-1干擾組的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了76.37±6.36%,差異極顯著(P<0.01);CV250-2干擾組的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了67.73±4.94%,差異顯著(P<0.05)。CV250-1和CV250-2經(jīng)細(xì)胞水平篩選,皆可有效干擾細(xì)胞內(nèi)Zfy基因表達(dá),可用于驢體內(nèi)試驗(yàn)。由于CV250-1具有更好的干擾效果,后續(xù)選擇CV250-1用于動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)。

肩注*表示差異顯著(P<0.05),同行肩注**表達(dá)差異極顯著(P<0.01);下同。圖4 驢對(duì)照組、試驗(yàn)組生精細(xì)胞Zfy基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 串聯(lián)干擾載體的體內(nèi)檢測(cè)效果評(píng)估

性控精液(睪丸注射Zfy基因串聯(lián)干擾載體)、非性控精液(空白處理組)人工授精后B超檢查受胎結(jié)果如表4所示,性控組的受胎率為61.72%,非性控組的受胎率為67.4%。

表4 性控精液與非性控精液受胎率統(tǒng)計(jì)表

使用陽(yáng)性對(duì)照(種公驢)、陰性對(duì)照(空懷母驢)血液DNA、性控組懷孕母驢血漿提取的胎兒游離DNA為模板,PCR擴(kuò)增AMEL基因,結(jié)果如圖5所示。1號(hào)泳道公驢陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出2條帶,2號(hào)泳道為空懷母驢陰性對(duì)照擴(kuò)增出1條帶,符合預(yù)期,3號(hào)泳道為無(wú)酶水空白對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果無(wú)條帶。從性控組結(jié)果可明顯看出泳道5、8與公畜陽(yáng)性對(duì)照相同,確定子代為雄性;泳道4、6、7、9、10、11與母畜陰性對(duì)照相同,確定子代為雌性。

統(tǒng)計(jì)胎兒性別鑒定結(jié)果,并分析后代性別比例,結(jié)果如表5所示:CV250-1干擾載體性控組子代雌性率為71.05%(P<0.05)。

表5 性控與非性控子一代性別數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Zfy基因曾作為睪丸決定因子的候選基因而備受關(guān)注[8]。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)Y染色體的基因足以使生殖細(xì)胞在輔助受精中起作用并產(chǎn)生活的后代[9],即睪丸決定因子SRY和精原增殖因子Eif2s3y。隨著SRY基因的功能被不斷挖掘,Zfy基因被逐漸的遺忘了,花了20多年時(shí)間才重新出現(xiàn),扮演新的生精角色。Yamauchi[10]的研究表明,小鼠的Y染色體上Zfy2促進(jìn)精子形態(tài)發(fā)生,提高圓形精子細(xì)胞注射(ROSI) 的成功,并且是形成精子的必要條件,能夠在卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)注射后產(chǎn)生活的后代。Zfy2基因的存在使圓形精子細(xì)胞能夠啟動(dòng)和經(jīng)歷頭部形態(tài)發(fā)生和完整的尾部發(fā)育。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)添加Zfy2基因到雄性 Y 染色體缺陷的個(gè)體中,發(fā)現(xiàn)圓形精子細(xì)胞階段減數(shù)分裂后停滯,證明了Zfy2在輔助受精中負(fù)責(zé)精子功能的形成[4]。在本研究中,當(dāng)干擾Zfy基因后,發(fā)現(xiàn)子一代的性別相比于對(duì)照組發(fā)生明顯偏移,影響了圓形精子細(xì)胞的正常發(fā)育,使Y精子的受精幾率降低,X精子不受影響,與理論相符。但在后續(xù)的研究中還需驗(yàn)證注射干擾載體后,對(duì)下游基因表達(dá)產(chǎn)生的影響。在驢中,Y 染色體上只有一個(gè)單一的Zfy基因,沒(méi)有Zfy突變的描述,因此,關(guān)于Zfy基因在精子發(fā)生中的生物學(xué)功能可能引發(fā)研究員們對(duì)性控研究的重新評(píng)估。

汪存利[11]的研究表明,體外培養(yǎng)生精細(xì)胞會(huì)隨著支持細(xì)胞功能的衰落而退化,要想穩(wěn)定的培養(yǎng)生精細(xì)胞還需探尋與支持細(xì)胞功能相近的存活時(shí)間長(zhǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞。本試驗(yàn)培養(yǎng)驢的生精細(xì)胞,在這些研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),在支持細(xì)胞貼壁后即進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn),以防止生精細(xì)胞退化影響試驗(yàn)結(jié)果。但無(wú)法進(jìn)行生精細(xì)胞的生長(zhǎng)傳代,在后續(xù)的研究中還需要探索生精細(xì)胞的生長(zhǎng)及傳代的方法。

睪丸注射是將外源基因整合到雄性生殖系細(xì)胞中,從而獲得轉(zhuǎn)基因精子的方法[12-13]。Amaral等[14]在研究中發(fā)現(xiàn),使用睪丸注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠,會(huì)導(dǎo)致小鼠生殖器官損壞,生精細(xì)胞的數(shù)量降低,曲細(xì)精管的功能損壞。李福兵[15]的研究認(rèn)為睪丸間質(zhì)注射是注射過(guò)程中影響了曲細(xì)精管完整性,侵染質(zhì)粒通過(guò)缺口進(jìn)入生精細(xì)胞,或者是通過(guò)睪丸組織體內(nèi)的體液循環(huán)和滲透作用進(jìn)入生精細(xì)胞完成侵染。Bichun等[16]將pEGFP-N1質(zhì)粒注入雞睪丸,從30個(gè)受精卵中隨機(jī)篩選出23只雛雞,成功地得到13只轉(zhuǎn)基因雞(檢出率56.5%)。He等人[17]成功獲得了轉(zhuǎn)基因羊應(yīng)用睪丸注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)(陽(yáng)性率2.0%)。在本研究中發(fā)現(xiàn),睪丸間質(zhì)注射法對(duì)睪丸組織產(chǎn)生了一定影響,引起睪丸腫脹,嚴(yán)重會(huì)引起睪丸組織出血等狀況,需要精密的技術(shù)支持。在本研究中,注射干擾載體對(duì)驢睪丸組織產(chǎn)生可恢復(fù)性損傷,在注射干擾載體8個(gè)月后,對(duì)種公驢進(jìn)行精液品質(zhì)檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),精液活力降低、睪丸腫脹及精液中帶血等問(wèn)題皆已恢復(fù),精子活力及身體狀況恢復(fù)正常水平。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明,成功構(gòu)建出驢Zfy基因重組載體CV250-1、CV250-2,CV250-1能更好的抑制種公驢睪丸組織Zfy基因的表達(dá),細(xì)胞水平干擾效率為76.37%,體內(nèi)試驗(yàn)子一代雌性率為71.05%,可顯著影響子代雌性率。