西藏色季拉山區(qū)風毛菊屬植物花粉形態(tài)特征及其分類學意義

張淑鈞 楊欣欣 羅 建*

（1.西藏農(nóng)牧學院高原生態(tài)研究所，林芝 860000；2.西藏高原森林生態(tài)教育部重點實驗室，林芝 860000；3.西藏林芝高山森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站，林芝 860000；4.西藏自治區(qū)高寒植被生態(tài)安全重點實驗室，林芝 860000）

菊 科（Asteraceae）風 毛 菊 屬（Saussurea）于1810 年 由 植 物 學 家De Candolle［1］建 立。1881 年Hooker［2］首 次 將 風 毛 菊 屬 劃 分 為2 個 亞 屬。到1979 年前蘇聯(lián)學者Lipschitz［3］詳細調查了全世界范圍內(nèi)的風毛菊類群，根據(jù)植株被毛、莖明顯程度、苞片顏色、總苞片是否被附屬物與膜質附屬物是否明顯等形態(tài)特征，將該屬劃分為6 個亞屬20個組。該系統(tǒng)成為后期大部分風毛菊屬分類系統(tǒng)的研究基礎。隨著對風毛菊屬植物的深入研究，發(fā)現(xiàn)該屬植物廣泛分布于泛北極植物區(qū)，以亞洲分布物種最多，在青藏高原及周邊地區(qū)尤為豐富，約有230 個地方性種［4-6］，是風毛菊屬的“現(xiàn)代分布中心”［7-9］。由于該屬物種較多，分布廣泛，其生境特殊而多樣，既有高山和草地，也有荒漠與冰川等。不同生境下的物種，植株形態(tài)特征變異較大，表現(xiàn)出豐富的形態(tài)特征多樣性［10-11］。此外，同域分布的一些物種為適應共處的極端環(huán)境，采取了相似的適應策略［12］，導致種間界限模糊，如分布于雪山環(huán)境下的苞葉雪蓮（S.obvallata）和寶璐雪蓮（S.luae）等，均具有形態(tài)相似的膜質苞葉，為物種鑒定帶來了困難［13-15］。

花粉形態(tài)特征具有穩(wěn)定的遺傳保守性，在植物分類及親緣關系重建方面提供重要佐證［16-17］?；ǚ坌螒B(tài)大小、萌發(fā)溝以及外壁表面紋飾等特征在種間差異顯著，是物種劃分的重要依據(jù)［18-20］。孫會忠等［21］對菊科絹蒿屬（Seriphidium）10 種植物的花粉形態(tài)進行研究，結果表明10 種絹蒿屬植物花粉粒較小，呈長球形、球形或近球形，赤道面觀為圓形或橢圓形，極面觀為三裂片圓形，認為絹蒿屬和蒿屬（Artemisia）有著較近的親緣關系。王鐵娟等［22］對6 種沙蒿花粉形態(tài)的比較研究，認為6 種沙蒿的花粉形態(tài)高度一致，極面觀均為三裂圓形，赤道面觀為圓形或橢圓形，具三孔溝，外壁紋飾在光鏡下為表面顆粒狀，在電鏡下為排列較疏的刺，刺基外延。王一峰等［23］對青藏高原東緣28種風毛菊屬植物花粉形態(tài)研究認為花粉形態(tài)的刺間表面紋飾、萌發(fā)溝的寬窄、刺的大小、分布密度和花粉大小在種間存在差異，組內(nèi)花粉形態(tài)多樣性豐富。目前，除王一峰等［23］外，對風毛菊屬植物不同種間的孢粉學特征研究涉及仍然較少，不能準確地定義、分類，且缺乏對本屬植物不同種類花粉形態(tài)的詳細數(shù)據(jù)。

色季拉山區(qū)風毛菊屬植物種類豐富，但目前對色季拉山區(qū)風毛菊屬植物的研究、保護及利用仍然不足［24］。色季拉山地勢南高北低高差起伏大，地形地貌復雜，山系縱橫交錯。印度洋季風暖濕氣流和北方高原寒流在此交匯，形成獨特的濕潤半濕潤氣候，冬溫夏涼，干濕季明顯，形成了許多復雜的區(qū)域性小氣候［25］。年降水量600～1 000 mm，年均溫8～10 ℃，積溫為3 000～3 500 ℃［26］。土壤類型豐富，同時由于高原隆升，海拔從低到高，依次受到熱帶、亞熱帶、溫帶和寒帶氣候的控制，孕育了該區(qū)極為豐富的植物資源［27-28］。

本文以色季拉山區(qū)豐富的風毛菊屬植物種類為前提，調查和收集了22 種風毛菊屬植物花粉和1 種須彌菊屬（Himalaiella）植物花粉，將須彌菊屬植物花粉與風毛菊屬其他種一起觀察，以了解其花粉微形態(tài)水平上是否同樣存在分化。通過掃描電鏡觀察記錄它們的花粉形態(tài)和大小、外壁紋飾特征，包括萌發(fā)孔溝、網(wǎng)眼、網(wǎng)脊、刺長和刺寬等特點，比較花粉形態(tài)在種間的差異，通過聚類分析，探討其親緣關系，擬解決以下問題：（1）觀察23 種植物的花粉形態(tài)特征；（2）比較種間、組間和各亞屬間花粉微形態(tài)的異同，探究其分類學意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料

材料為采自色季拉山區(qū)22種風毛菊屬植物和1 種須彌菊屬植物的花粉（表1）。22 種植物分別來自3 個亞屬：雪兔子亞屬（Subgen.Eriocoryne）、雪蓮亞屬（Subgen.Amphilaena）、風毛菊亞屬（Subgen.Saussurea）。其余1 種為白背須彌菊（Himalaiella auriculata），原放置在風毛菊屬齒冠亞屬（Subgen.Florovia），后來被修訂為須彌菊屬成員［13］。研究材料里，有13 個中國特有種，包括：拉薩雪兔子（S.kingii）、綿頭雪兔子（S.laniceps）、碩首雪兔子（S.grandiceps）、多鞘雪蓮（S.polycolea）、毛背雪蓮（S.pubifolia）、尖葉風毛菊（S.ciliaris）、黑苞風毛菊（S.melanotricha）、薄苞風毛菊（S.leptolepis）、川滇風毛菊（S.wardii）、革苞風毛菊（S.coriacea）、彎齒風毛菊（S.przewalskii）、紫苞風毛菊（S.purpurascens）與粗裂風毛菊（S.grosseserrata），其中有4 個西藏特有種：拉薩雪兔子、碩首雪兔子、毛背雪蓮和紫苞風毛菊［5-6］。

表1 實驗材料基本信息Table 1 Basic information of experimental materials

所有研究材料物種的憑證標本均保存于西藏高原生態(tài)研究所標本室（XZE）。

1.2 花粉形態(tài)觀察

每種在3 個不同植株的花序上分別選取5 朵成熟花，在解剖鏡下，用鑷子和解剖針將花藥挑破置于載玻片上，滴上體積分數(shù)95%乙醇，等待干燥后，將飽滿花粉均勻散布在貼有導電雙面膠的樣品臺上，在離子濺射儀（SBC-12，產(chǎn)地）中真噴鍍金膜，再利用電子掃描電鏡（JCM-6000 型，產(chǎn)地）觀察、拍照記錄花粉形態(tài)特征。

1.3 花粉粒特征描述及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每種植物取20 粒花粉，使用SMILE VIEW Standard 軟件測量其極軸長（P）、赤道軸長（E）、萌發(fā)孔寬（G）、萌發(fā)溝長（S）、體積（V）、網(wǎng)眼寬（M）、網(wǎng)脊寬（W）、刺數(shù)/400 μm2（NS）、刺寬（WS）、刺長（LS）等數(shù)量性狀，花粉形態(tài)學描述術語參考王伏雄等［16］、王開發(fā)等［17］和韋仲新［29］。利用Excel 2016軟件將數(shù)據(jù)處理成電子表格，花粉形狀以P/E來表示，計算各項指標的平均值±標準誤及偏差系數(shù)（Cv），根據(jù)公式πPE2/6［30］計算各個種的花粉體積。隨后，采用SPSS 27 軟件進行多重比較與聚類分析。依據(jù)P/E、花粉粒形狀、萌發(fā)孔寬/萌發(fā)溝長（G/S）、刺寬/刺長（WS/LS）、萌發(fā)溝數(shù)量5 個數(shù)量性狀，完成數(shù)據(jù)標準化處理，采用組間連接與歐氏距離法對23種植物花粉進行聚類分析［31］。

2 結果與分析

2.1 花粉形態(tài)

掃描電鏡下，23種植物的花粉均為單?；ǚ?，花粉極軸和赤道軸范圍為11.927～47.233 μm 和10.970～62.303 μm，其中極軸最短的花粉出現(xiàn)在寶璐雪蓮（11.927 μm），極軸最長的見于毛背雪蓮（47.233 μm）；赤道軸最短者為寶璐雪蓮（10.970 μm），赤道軸最長者為紫苞風毛菊（62.303 μm）。供試花粉中寶璐雪蓮的極軸與赤道軸均為最小，大部分不同種間花粉粒極軸與赤道軸均存在顯著差異（表2～3 和圖版：I～V）。在花粉外觀形態(tài)上寶璐雪蓮的花粉粒體積最?。?51.503 μm3），紫苞風毛菊的花粉粒體積最大（87 802.105 μm3），兩者大小差異明顯。寶璐雪蓮的花粉為小型花粉；紫苞風毛菊和川滇風毛菊（78 456.015 μm3）為大型花粉；其他屬于中等型花粉，體積大小在17 905.204～50 765.823 μm3。

表2 23種植物花粉形態(tài)特征（1）Table 2 Morphological characteristics of pollen from 23 plant species（1）

表3 23種植物花粉形態(tài)特征（2）Table 3 Morphological characteristics of pollen from 23 plant species（2）

花粉的形狀根據(jù)P/E值大小來表示，當0.88≤P/E＜1.14 為近球形，0.50≤P/E＜0.88 為扁球形［17］。23 種植物花粉粒P/E值在0.692～1.123，分為扁球形和近球形。扁球形花粉見于：尖葉風毛菊、川滇風毛菊、紫苞風毛菊。其中，川滇風毛菊的花粉P/E值最小，僅為0.692。近球形花粉見于20 種，P/E值在0.88～1.14。其中，綿頭雪兔子的花粉P/E值最大為1.123。23 種植物都為單粒花粉，極面觀多為近圓形，赤道面觀為近球形。說明風毛菊屬植物花粉形態(tài)大小較為相似，可以作為該屬花粉的普遍特征。

2.2 花粉萌發(fā)溝

花粉萌發(fā)孔溝在23種植物里除薄苞風毛菊為4孔溝外，其余22種植物的花粉均為3孔溝?；ǚ哿Ｃ劝l(fā)溝長度為7.680～46.893 μm，在種間具顯著差異性，最長和最短的長度的差值為39.213 μm，接近7 倍左右。其中，平均萌發(fā)溝最短見于寶璐雪蓮，為（7.680±0.548）μm；最長的出現(xiàn)在川滇風毛菊，為（46.893±0.948）μm?；ǚ哿Ｃ劝l(fā)孔寬度范圍為2.603～12.588 μm，種間也有顯著差異，花粉粒萌發(fā)孔寬差值為9.985 μm，其中平均萌發(fā)孔寬度最短的是尖葉風毛菊和寶璐雪蓮，分別為（2.603±0.059）、（2.709±0.268）μm；平均萌發(fā)孔寬最長的是鼠曲雪兔子，為（12.588±0.880）μm。因此，花粉萌發(fā)孔溝的長度和寬度在種間差異明顯。

2.3 花粉粒外壁紋飾特征

花粉粒外壁紋飾在種間差異明顯，可分為7類［16-17，29］（表2～3 和圖版Ⅰ～Ⅴ）：網(wǎng)狀、網(wǎng)狀—顆粒狀、穴狀、光滑狀、刺基穴狀及刺間具皺波狀、顆粒狀、褶皺狀?，F(xiàn)在的網(wǎng)狀7 種（圖版Ⅰ：A～E，圖版Ⅱ：F～G），有鼠曲雪兔子、碩首雪兔子、毛背雪蓮、尖葉風毛菊、薄苞風毛菊、川滇風毛菊和革苞風毛菊；網(wǎng)狀—顆粒狀6 種（圖版Ⅱ：H～J，圖版Ⅲ：K～M），有拉薩雪兔子、綿頭雪兔子、倒披針葉風毛菊、獅牙草狀風毛菊、松潘風毛菊和彎齒風毛菊；穴狀6 種（圖版Ⅲ：N～O，圖版Ⅳ：P～S），有苞葉雪蓮、錐葉風毛菊、蒲公英風毛菊、紫苞風毛菊、粗裂風毛菊和白背須彌菊；光滑狀1 種（圖版Ⅳ：T），為黑苞風毛菊；刺基穴狀及刺間具皺波狀1 種（圖版Ⅴ：U），為多鞘雪蓮；顆粒狀1種（圖版Ⅴ：V），為寶璐雪蓮；褶皺狀1種（圖版Ⅴ：W），為星狀雪兔子。

20 種花粉粒外壁具網(wǎng)眼、網(wǎng)脊，網(wǎng)眼大小在0.297～1.200 μm，多鞘雪蓮網(wǎng)眼（1.200 μm）最大，白背須彌菊網(wǎng)眼（0.297 μm）最小，二者相差0.903 μm；網(wǎng)脊大小在1.104～0.202 μm，彎齒風毛菊網(wǎng)脊（1.104 μm）最大，白背須彌菊網(wǎng)脊（0.202 μm）最小，最大與最小網(wǎng)脊之間相差0.902 μm；星狀雪兔子、寶璐雪蓮和黑苞風毛菊3 種不具網(wǎng)眼與網(wǎng)脊。網(wǎng)眼差（0.903 μm）與網(wǎng)脊差（0.902 μm）相近。同樣的，通過網(wǎng)眼與網(wǎng)脊的大小還不能將風毛菊屬內(nèi)各亞屬清晰地區(qū)別開，但仍可作為各種間的鑒定依據(jù)，值得注意的是白背須彌菊在網(wǎng)脊網(wǎng)眼特征方面與風毛菊屬其他種出現(xiàn)了明顯的差異。

23 種植物的花粉外壁均有刺狀突起，外壁刺長度為1.356～10.105 μm，其中刺長度最小的是川滇風毛菊，刺長度最大的是寶璐雪蓮；表面刺基部直徑在2.129～15.150 μm，其中表面刺基部直徑最小的是星狀雪兔子，表面刺基部直徑最大的是寶璐雪蓮。觀察400 μm2面積的刺數(shù)，綿頭雪兔子、星狀雪兔子、寶璐雪蓮、尖葉風毛菊、蒲公英風毛菊、彎齒風毛菊等相對較大（NS≥20），苞葉雪蓮、白背須彌菊、錐葉風毛菊、紫苞風毛菊相對較?。∟S≤10）。從刺狀突起的3 項指標來看，植物花粉存在種間差異。白背須彌菊刺狀突起與風毛菊屬其他種相近似，該特征尚不能將其與風毛菊屬區(qū)分開，但其刺突密度偏小，可作參考。

2.4 基于花粉性狀的聚類分析

經(jīng)聚類分析（圖1）可知，在輔助線1（遺傳距離4.0）處，將23種植物的花粉形態(tài)分為7類。第一類為雪兔子亞屬中的碩首雪兔子、綿頭雪兔子、拉薩雪兔子、星狀雪兔子、鼠曲雪兔子性狀接近；第二類為雪蓮亞屬（寶璐雪蓮、苞葉雪蓮、多鞘雪蓮、毛背雪蓮）、風毛菊亞屬羽裂組（倒披針葉風毛菊、松潘風毛菊、獅牙草狀風毛菊、彎齒風毛菊、蒲公英風毛菊、革苞風毛菊）、風毛菊亞屬無莖組的黑苞風毛菊、風毛菊亞屬風毛菊組的粗裂風毛菊聚集在一起；第三類為風毛菊亞屬羽裂組的川滇風毛菊和紫苞風毛菊，因性狀相似，都為扁球形且G/S較小聚為一類。其他4 種則單獨聚為一類。以輔助線2（遺傳距離11.0）來看，研究材料聚集分成3個類群，其中風毛菊亞屬羽裂組的薄苞風毛菊花粉粒具4 條萌發(fā)溝，單獨聚合為一類；風毛菊亞屬羽裂組的川滇風毛菊、紫苞風毛菊與風毛菊亞屬裸托組因性狀相似，都為扁球形且G/S較小聚為第二類；風毛菊亞屬無莖組錐葉風毛菊P/E值較大、G/S較大，其他性狀與前面17 種風毛菊屬植物相近，首先與之聚合，其次須彌菊屬的白背須彌菊具備P/E較小、WS/LS較大隨之聚合，形成第三類。在輔助線3（遺傳距離24.0），將試供材料分成了2 個類群，其中風毛菊亞屬裸托組尖葉風毛菊的P/E較小、橢圓形、G/S較小與風毛菊亞屬羽裂組川滇風毛菊、紫苞風毛菊花粉特征上相似聚合在一起形成一類，另外20 種聚為一類。說明了風毛菊屬花粉根據(jù)P/E、花粉粒形狀、G/S、WS/LS和萌發(fā)溝數(shù)量特征，可為風毛菊屬植物進行傳統(tǒng)分類提供重要劃分依據(jù)。

圖1 23種植物花粉形態(tài)聚類圖Fig.1 Pollen morphology clustering map of 23 plant species

3 討論

（1）從花粉體積演化趨勢的一般特征來看［16-17，29，32］，寶璐雪蓮體積最小，應為較進化類型；紫苞風毛菊體積最大，應為較原始類型。本次研究觀測到的23種植物，除寶璐雪蓮為小型花粉，紫苞風毛菊和川滇風毛菊具大型花粉，其余20 種植物的花粉極軸與赤道軸大小在25～50 μm，均屬于中型花粉［17］。供試植物花粉在不同種間均有不同程度差異，花粉的極軸與赤道軸大小可作為種間劃分的依據(jù)，但亞屬間未表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，這可能與風毛菊屬植物的快速輻射與趨同進化有關［33-34］，23 種植物花粉極軸、赤道軸長度和花粉粒大小呈現(xiàn)出一定的分異，但在亞屬間界限并不分明。

（2）花粉的萌發(fā)溝類型都是赤道延伸向兩極并且在兩極不發(fā)生聯(lián)合的萌發(fā)溝，薄苞風毛菊為4 孔溝花粉，屬于較為進化的種類［17，35］，其余22 種花粉具3 個萌發(fā)孔溝。23 種植物花粉的在萌發(fā)溝長與萌發(fā)孔寬之間具有一定的區(qū)別，可以為該屬植物系統(tǒng)分類提供有效的依據(jù)。

（3）花粉外壁表面紋飾是植物分類和系統(tǒng)發(fā)育的重要特征之一［15-17］。本研究的23 種植物花粉為風毛菊屬22 種和須彌菊屬1 種，通過電鏡掃描發(fā)現(xiàn)其花粉粒外壁紋飾在3 個亞屬內(nèi)、4 個組內(nèi)具有多個紋飾類型，根據(jù)目前對花粉微形態(tài)研究結果，外壁紋飾不同的花粉是可能存在于同一科、屬、亞屬及種內(nèi)［23，31］。研究材料各亞屬內(nèi)均出現(xiàn)多個紋飾類型，而亞屬間部分種紋飾卻有類似，這可能與屬內(nèi)種的分化受環(huán)境變化影響有關［36］。23種植物花粉刺狀突起的形態(tài)、大小和密度等各項指標在種間均存在不同程度的變異，在個別亞屬間也存在顯著差異，如雪兔子亞屬的刺密度較風毛菊亞屬的刺密度明顯偏小，可作為該屬植物進行系統(tǒng)分類的重要依據(jù)。

（4）根據(jù)P/E、花粉粒形狀、G/S、WS/LS和萌發(fā)溝數(shù)量特征進行聚類，聚類結果與供試風毛菊屬植物的系統(tǒng)分類位置表現(xiàn)出了一定的一致性，較大程度上支持傳統(tǒng)分類處理。23種植物花粉性狀聚類沒有完全將不同亞屬（組）之間清晰區(qū)分開來，白背須彌菊與風毛菊屬植物之間暫不能通過花粉形態(tài)以及聚類結果將其徹底區(qū)分，但在網(wǎng)脊、網(wǎng)眼、刺突密度特征方面與風毛菊屬其他種出現(xiàn)了明顯的分化，可以為其從風毛菊屬劃出，置于須彌菊屬提供部分證據(jù)支持。

（5）本研究中風毛菊屬植物花粉形態(tài)與前人對其觀測的結果［23］基本吻合，23 種植物花粉表現(xiàn)出一定的共性，都屬于單?；ǚ?，且為等極的輻射對稱類型，形狀為近球形或扁球形，與其同為菊科的絹蒿屬植物和蒿屬植物的花粉形態(tài)［21-22］也較為相似，故該區(qū)域的研究結果可以為本屬植物的分類提供參考。

總的來說，本研究觀察的23 種植物的花粉形態(tài)特征在種間存在一定差異，對本風毛菊屬植物分類有積極的參考價值，但植物分類不能僅僅依靠孢粉學上的特征，在進行分類時仍需結合宏觀形態(tài)特征、種子特征、分子生物學等多方面研究的結果進行綜合考量。

圖版Ⅰ 掃描電鏡下的5種風毛菊屬植物花粉微形態(tài)A.鼠曲雪兔子；B.碩首雪兔子；C.毛背雪蓮；D.尖葉風毛菊；E.薄苞風毛菊；1～3分別為花粉粒極面觀、赤道面觀及花粉表面紋飾Plate Ⅰ Pollen micromorphology of five Saussurea species by scanning electron microscope A.S. gnaphalodes；B.S. grandiceps；C.S. pubifolia；D.S. ciliaris；E.S. leptolepis；1-3 were polar view，equatorial view and ultrastructural view respectively

圖版Ⅱ 掃描電鏡下的5種風毛菊屬植物花粉微形態(tài)F.川滇風毛菊；G.革苞風毛菊；H.拉薩雪兔子；I.綿頭雪兔子；J.倒披針葉風毛菊；示花粉粒的極面觀（J1），赤道面觀（J2）和花粉表面紋飾（J3）Plate Ⅱ The pollen micromorphology of 5 Saussurea species by scanning electron microscope F.S. wardii；G.S. coriacea；H.S. kingii；I.S. laniceps；J.S. nimborum；J1-3 were polar view，equatorial view and ultrastructural view respectively

圖版Ⅳ 掃描電鏡下的5種風毛菊屬植物花粉微形態(tài)P.蒲公英風毛菊；Q.紫苞風毛菊；R.粗裂風毛菊；S.白背須彌菊；T.黑苞風毛菊；示花粉粒的極面觀（T1），赤道面觀（T2）和花粉表面紋飾（T3）Plate Ⅳ Pollen micromorphology of 5 Saussurea species under SEM P.S. taraxacifolia；Q.S. purpurascens；R.S. grosseserrata；S.H. auriculata；T.S. melanotricha；T1-3 were polar view，equatorial view and ultrastructural view respectively

圖版Ⅴ 掃描電鏡下的3種風毛菊屬植物的花粉形態(tài)U.多鞘雪蓮；V.寶璐雪蓮；W.星狀雪兔子；示花粉粒的極面觀（W1），赤道面觀（W2）和花粉表面紋飾（W3）Plate Ⅴ Pollen micromorphology of 3 Saussurea species under SEM U.S. polycolea；V.S. luae；W.S. stella；W1-3 were polar view，equatorial view and ultrastructural view respectively