水曲柳FmCCoAOMT基因在木質(zhì)素合成及非生物脅迫中的功能分析

單超然 陳曉慧 丁云飛 趙 威 盧 晗 高尚珠齊鳳慧 詹亞光 曾凡鎖*

（1.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040；2.黑龍江省海林市林業(yè)和草原局，牡丹江 157100）

細胞壁是構(gòu)成植物細胞最重要的結(jié)構(gòu)之一，同時細胞壁還是地球上最豐富的可再生能源庫［1］。細胞壁是植物體抵御外部危害的重要屏障，包括各種生物和非生物脅迫。細胞壁可分為初生細胞壁和次生細胞壁，次生細胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成［2］。木質(zhì)素是僅次于纖維素的第二大陸生聚合物，在植物抗擊外來侵襲、抵御病害襲擊、維持正常生長等方面發(fā)揮著重要作用［3］。木質(zhì)素主要由苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生，作為一種重要的次級代謝產(chǎn)物，其生物合成過程及其復雜，涉及一系列的脫氨基、羥基化和甲基化，最后木質(zhì)素單體在細胞質(zhì)中產(chǎn)生。目前，已有研究表明調(diào)控木質(zhì)素生物合成代謝的關鍵酶和基因已被成功分離和克隆，其中咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）是木質(zhì)素生物合成途徑中的一種關鍵酶［4］。它可以催化咖啡酰輔酶A（caffeoyl CoA），甲基化為阿魏酰輔酶A（feruloyl-CoA）［5］?？Х弱］o酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）首先是在歐芹（Petroselinum crispum）的懸浮細胞中發(fā)現(xiàn)的［6］，目前，在綠竹（Bambusa oldhamii）［7］、慈竹（Sinocalamus affinis）［8］、白樺（Betula platyphylla）［9］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）［10］、青 楊（Populus cathayana）［11］、煙草（Nicotiana tabacum）［12］等植物中都已經(jīng)成功獲取了CCoAOMT基因。此外，已有研究報道CCoAOMT基因的下調(diào)會導致木質(zhì)素含量降低［13］，而CCoAOMT基因的過表達會使木質(zhì)素含量增加，這表明咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶在木質(zhì)素生物合成過程中具有重要作用。

木質(zhì)素在植物生長發(fā)育過程中起著關鍵作用，它可以增強植物細胞壁的疏水性，促進植物組織、器官的發(fā)育，對植物適應環(huán)境具有重要意義。此外，木質(zhì)素的生物合成與各種生物和非生物脅迫密切相關。當植物感染病原菌時，體內(nèi)的細胞壁會積累大量的木質(zhì)素用于抵御病原菌的侵害。例如，百合（Lilium browniivar.viridulum）中的LrCCoAOMT基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥，使維管組織中的木質(zhì)素發(fā)生沉積，從而增強轉(zhuǎn)基因植株對病原菌的抗性［14］。在玉米（Zea mays）中發(fā)現(xiàn)ZmCCoAOMT2基因與多種病原體的耐藥性有關［15］，這些結(jié)果表明木質(zhì)素生物合成途徑基因在植物防御中發(fā)揮著重要作用。重金屬脅迫可以增加細胞壁中木質(zhì)素的含量，從而增加細胞壁的厚度。最新研究表明，鐵脅迫可以增加苯丙烷代謝途徑中HCT、CCoAOMT、POD 的表達從而增加木質(zhì)素的含量［16］。此外，木質(zhì)素的生物合成在干旱脅迫下明顯增強。例如，當大豆（Glycine max）受到干旱脅迫時，CCoAOMT基因的表達量在大豆根的伸長區(qū)明顯增強，木質(zhì)素的含量也隨之增加，從而減少大豆根系水分的流失［17］。最新研究表明，在干旱脅迫條件下，葡萄（Vitis vinifera）中的VvCCoAOMT基因的轉(zhuǎn)錄水平增加，有助于葡萄中花青素的甲基化活性［18］。此外，擬南芥CCoAOMT1基因積極響應鹽脅迫且表達水平顯著上調(diào)［19］，同時CCoAOMT1還可以通過ROS 和ABA 信號響應干旱脅迫［20］。以上研究結(jié)果充分表明CCoAOMT基因通過改變木質(zhì)素的生物合成、增加木質(zhì)素的含量來抵御生物和非生物脅迫，從而適應逆境。

水曲柳（Fraxinus mandshurica）系木犀科（Oleaceae）梣屬（Fraxinus）喬木，是東北地區(qū)三大珍貴硬闊葉樹種之一［21］，屬于環(huán)孔材，具有高大挺拔、耐低溫、高韌性、抗干旱等優(yōu)良性狀，在林業(yè)生產(chǎn)上具有重要經(jīng)濟價值。水曲柳在生長過程中經(jīng)常遭受各種環(huán)境危害，如寒冷，干旱，蟲害等。這些環(huán)境脅迫對于水曲柳木質(zhì)部的發(fā)育以及木質(zhì)素的生物合成造成了巨大的影響。近年來多種研究表明，CCoAOMT基因通過調(diào)節(jié)木質(zhì)素的沉積來響應多種環(huán)境脅迫。因此，探究FmCCoAOMT基因在水曲柳木質(zhì)素生物合成以及響應逆境脅迫中的功能具有重要意義。本研究以水曲柳人工林為材料，利用qRT-PCR 技術檢測FmCCoAOMT基因在脅迫處理后的表達水平，揭示生物脅迫和激素誘導后FmCCoAOMT基因的表達模式，通過農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染方法獲得FmCCoAOMT轉(zhuǎn)基因煙草植株，觀察轉(zhuǎn)基因煙草及對照在NaCl、甘露醇（Mannitol，Man）和ABA 3 種脅迫后的生長發(fā)育表型，分析木質(zhì)素、纖維素及半纖維素含量差異，同時測定過氧化物酶活性等生理指標，解析FmCCoAOMT基因在木質(zhì)素合成和植物抗逆反應中的功能。這些結(jié)果將為深入研究FmCCoAOMT基因家族的功能和水曲柳抗逆遺傳改良奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為東北林業(yè)大學實驗林場1951年營建的水曲柳人工林。2018年在實驗林場內(nèi)隨機選取長勢良好且相對一致的雌株水曲柳和雄株水曲柳各3 株作為取樣對象。選取距地面5 m 左右枝條上的葉片，每株5 片；同樣選取距地面5 m 左右的3～5 年生枝條的木質(zhì)部、表皮樣本。收集表皮，同時刮取未成熟木質(zhì)部組織進行收集，收集量為5 g。分別在5 月8 日、6 月22 日、7 月22 日、8 月22日和9 月26 日對上述組織部位重復取樣，并分別標記雌株和雄株水曲柳。全部樣品于冰箱中-80 ℃保存待用。

FmCCoAOMT轉(zhuǎn)基因煙草植株“A-11”為b 株系擴繁得到，其中A為FmCCoAOMT基因的簡稱。

1.2 研究方法

1.2.1 FmCCoAOMT基因表達模式分析

利用CTAB［22］法提取水曲柳葉、葉柄、表皮和木質(zhì)部RNA，將檢測可用的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行RT-PCR。模板為稀釋10 倍的cDNA，以水曲柳微管蛋白Tu 作為參照基因，內(nèi)參基因引物為F：5′-AGGACGCTGCCAACAACTTT-3′，R：5′-TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG-3′；FmCCoAOMT引 物為F：5′-TTGTGGAACGGGTCTGTG-3′，R：5′-AGCTCCAACACGAAATCTCTG-3′。熒 光 定 量 使 用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒，利用Roche Light Cycler 480 進行擴增，反應程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s（共40個循環(huán)）；95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃15 s。每份樣品重復3次。

1.2.2 FmCCoAOMT 基因非生物脅迫和激素誘導

將水曲柳15 d組培實生苗［23］分別用低溫（4 ℃）、NaCl（200 mmol·L-1）、甘露醇（200 mmol·L-1）、ABA（脫落酸，100 μmol·L-1）、GA3（赤霉素，100 μmol·L-1）和IAA（吲哚乙酸，100 μmol·L-1）處理，分別在處理的1、3、6、12 h 后取樣，取樣量為5 g，將樣品提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用qRT-PCR方法分析FmCCoAOMT基因在脅迫處理后的表達水平，反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR方法同上。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導煙草遺傳轉(zhuǎn)化

采用葉盤法獲取轉(zhuǎn)基因煙草植株［24］。（1）預培養(yǎng)：將無菌煙草用刀具將其葉片切割成葉盤，置于Murashige-Skoog（MS）培 養(yǎng) 基（MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+20 g·L-1蔗糖+5.4 g 瓊脂，pH=5.8）上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d；（2）浸染：在無菌條件下將預培養(yǎng)的煙草葉片放置工程菌液中，輕輕振蕩，浸染10～15 min；（3）共培養(yǎng)：將浸染后的葉片放到共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中 （MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+20g·L-1蔗糖+5.4 g 瓊脂，pH=5.8）；（4）脫菌與篩選獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定

基因水平檢測隨機選取在抗性培養(yǎng)基中生根的轉(zhuǎn)基因煙草株系，采用CTAB法分別提取葉片總DNA 作為模板，以FmCCoAOMT基因全長引物進行PCR擴增，F(xiàn)mCCoAOMT基因全長引物為F：5′-ATGAGACCAGTACAAGGAGGA-3′，R：5′-TGACGAGGTAACAAAAGCAA-3′，陰性對照為野生型煙草。

轉(zhuǎn)錄水平檢測以DNA水平檢測為陽性的煙草植株葉片為材料，利用CTAB 法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR 方法同上，煙草內(nèi)參引物為F：5′-CATTGGCGCTGAGAGATTCC-3′，R：5′-GCAGCTTCCATTCCGATCA-3′。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的測定

分別取野生型和轉(zhuǎn)FmCCoAOMT煙草莖的部位各10 g 作為待測樣品。采用分光光度計法測定木質(zhì)素含量：木質(zhì)素含量=吸收值×100/吸收系數(shù)×樣品濃度，吸收系數(shù)=20.2 L/（g·cm）-1。采用72%濃硫酸水解法測定纖維素［25］，纖維素含量：X=K（a-b）/（n×24），K為硫代硫酸鈉濃度（mol·L-1）；24為1 mol C6H10O5相當于Na2S2O3的當量數(shù)；a為空白滴定所消耗Na2S2O3體積，單位為mL；b為溶液所耗硫代硫酸鈉體積，單位為mL；n為樣品質(zhì)量，單位為g。采用鹽酸水解法結(jié)合DNS法測定半纖維素：用DNS 法測定溶液中的還原糖，對照葡萄糖標準曲線計算含量，乘上系數(shù)0.9得半纖維素含量。

1.2.6 非生物脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草酶活性以及生理指標的測定

分別配制含有150 mmol·L-1NaCl、250 mmol·L-1甘露醇、75 mmol·L-1ABA 的MS 培養(yǎng)基，進行非轉(zhuǎn)基因以及轉(zhuǎn)基因煙草的非生物脅迫處理。每隔10 d 拍照觀察轉(zhuǎn)基因與非基因植株的表型。硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）濃度；氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性。

1.2.7 脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草NBT染色

取脅迫處理以及空白對照的葉片（大小盡可能相同），分別置于潔凈干燥的50 mL 離心管中，加入NBT 染液浸沒葉片，避光放置12 h。倒出染液后加入無水乙醇于80 ℃水浴中脫色30 min（每10 min換1次無水乙醇）。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

本試驗熒光定量數(shù)據(jù)采用2-△Ct和2-△△Ct的計算方法。利用office365 進行數(shù)據(jù)整理，所有基因表達數(shù)據(jù)均為3 次生物重復和3 次技術重復的平均值。使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件制圖并對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多重比較，分別分析了不同組織部位和不同月份FmCCoAOMT基因表達量之間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 FmCCoAOMT在水曲柳中的表達模式分析

2.1.1 FmCCoAOMT基因的時空表達模式

根據(jù)課題組前期對水曲柳木質(zhì)部干旱轉(zhuǎn)錄組的分析表明，F(xiàn)mCCoAOMT基因表達水平上調(diào)，基于與擬南芥和楊樹（Populus）的進化關系以及序列同源性比對結(jié)果，推測FmCCoAOMT基因參與木質(zhì)素生物合成，因此對其表達模式進行分析。對水曲柳雌株和雄株的木質(zhì)部（多年生）、木質(zhì)部（1年生）、枝皮（多年生）、枝皮（新生）、葉柄、小葉6個部位進行FmCCoAOMT基因表達量的檢測，結(jié)果表明FmCCoAOMT基因在水曲柳不同部位的表達量不同（圖1），該基因在多年生雌株和雄株木質(zhì)部中相對表達量最高。在雄株水曲柳中，F(xiàn)mCCoAOMT在枝皮（新生）中相對表達量最低，F(xiàn)mCCoAOMT表達量在木質(zhì)部（多年生）是在枝皮（新生）表達量的9.4 倍；在雌株水曲柳中，F(xiàn)mCCoAOMT在葉中相對表達量最低，F(xiàn)mCCoAOMT表達量在木質(zhì)部（多年生）是在葉片表達量的13.1倍。對5～9 月的雌株和雄株水曲柳實生苗取材，比較不同月份水曲柳木質(zhì)部和葉片中FmCCoAOMT基因的表達量，結(jié)果表明FmCCoAOMT基因在不同月份的表達量差異較顯著（圖2），其中在7 月雌株水曲柳木質(zhì)部中表達量達到了峰值，而9 月FmCCoAOMT在雄株水曲柳木質(zhì)部中表達量降到了最低，幾乎不再表達，這與水曲柳本身的生長發(fā)育時段密切相關，因此，以上結(jié)果表明該基因具有時空表達和組織表達特異性。

圖1 FmCCoAOMT基因在水曲柳不同部位的表達量柱形圖上用不同小寫字母標識表示不同組織部位FmCCoAOMT 基因表達量的差異顯著性（P＜0.05）Fig.1 Expression level of FmCCoAOMT gene in different tissues of F. mandshurica Different lowercase letters indicated the significant difference of FmCCoAOMT gene expression in different tissue（sP＜0.05）

圖2 不同月份水曲柳木質(zhì)部、葉中FmCCoAOMT 基因的表達量柱形圖上用不同小寫字母標識表示不同月份FmCCoAOMT 基因表達量的差異顯著性（P＜0.05）Fig.2 Expression level of FmCCoAOMT gene in xylem and leaves of F. mandshurica in different months Different lowercase letters indicated the significant difference of FmCCoAOMT gene expression in different month（sP＜0.05）

2.1.2 FmCCoAOMT 基因在非生物脅迫下的表達模式

以水曲柳15 d幼苗為材料分別進行低溫和NaCl 2種非生物脅迫處理，以及IAA，ABA 和GA33種激素誘導，結(jié)果顯示FmCCoAOMT基因的表達量隨處理時間的變化而出現(xiàn)波動的現(xiàn)象（圖3）。在低溫處理中，以內(nèi)參基因TU 的表達量作為對照，F(xiàn)mCCoAOMT的表達量先上調(diào)，1 h 時，為0 h 的11.04 倍，然后在3 h 時下降，隨即在6 h 時基因的表達量達到峰值，為0 h 的23.18 倍，12 h 時降到最低值。NaCl處理后，3 h時出現(xiàn)1個表達量小高峰，是0 h 的14.77 倍，然后逐漸上升，直到12 h 表達量達到最高峰值，為0 h 的17.42 倍。上述結(jié)果表明，F(xiàn)mCCoAOMT基因均響應這2 種非生物脅迫，但FmCCoAOMT基因響應低溫脅迫比NaCl 脅迫更迅速。

圖3 非生物脅迫和植物激素誘導下FmCCoAOMT 基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of FmCCoAOMT gene induced by abiotic stress and plant hormones

在IAA、ABA 和GA33 種激素誘導后，F(xiàn)mCCoAOMT基因的表達量均出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢，以內(nèi)參基因TU 的表達量作為對照，經(jīng)IAA激素處理后，F(xiàn)mCCoAOMT基因的表達量在1 h 后就出現(xiàn)了顯著的上升，在3 h 時表達量達到峰值，為0 h 的55.07 倍，隨即表達量下降，但均高于對照組；經(jīng)ABA 處理后，在3 h 時達到峰值，為0 h 的40.73 倍，之后表達量下降，在12 h 時低于對照組；經(jīng)GA3處理后，在3 h時達到峰值，為0 h的42.41倍，之后基因的表達量出現(xiàn)了波動，但均高于對照組，綜合比較3 種植物激素對FmCCoAOMT基因表達的影響，IAA 處理時水曲柳中FmCCoAOMT基因表達（12 h 的平均值）高于ABA 和GA3。同時結(jié)果也表明FmCCoAOMT基因可以被激素信號快速誘導表達，從而抵抗非生物脅迫。

2.2 FmCCoAOMT轉(zhuǎn)基因煙草的遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定

利用農(nóng)桿菌法侵染大地煙草葉片，利用分化培養(yǎng)基將煙草葉片分化出芽，最終篩選獲得FmCCoAOMT轉(zhuǎn)基因煙草植株，轉(zhuǎn)基因過程如圖4 所示，圖4A 為預培養(yǎng)階段，圖4B 為侵染脫菌后在脫菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，圖4C 為葉片為愈傷組織誘導出叢生芽，圖4D 為出芽后的煙草叢生苗的不同時期，圖4E為生根培養(yǎng)基中煙草成苗。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草再生過程A.預培養(yǎng)階段；B.煙草葉片侵染脫菌后在脫菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)；C.葉片為愈傷組織誘導出叢生芽；D.出芽后的煙草叢生苗的不同時期；E.生根培養(yǎng)基中煙草成苗Fig.4 Regeneration process of transgenic tobacco A.Pre-culture stage；B.Leaves infected with and cultured in the culture medium；C.The leaves clustered buds induced by callus；D.The different stages of tobacco clusters after budding；E.Tobacco seedling in rooting medium

通過CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草DNA，從DNA水平驗證轉(zhuǎn)基因煙草植株，結(jié)果顯示，泳道1和2無條帶出現(xiàn)，泳道3出現(xiàn)目的條帶，（其中泳道1 為陰性對照，泳道2 模板為野生型煙草，泳道3 模板為轉(zhuǎn)基因煙草），表明轉(zhuǎn)基因成功；同時從RNA 水平驗證轉(zhuǎn)基因煙草植株，以非轉(zhuǎn)基因煙草CK 作為對照，橫坐標為不同的株系，縱坐標為相對表達量，結(jié)果表明FmCCoAOMT基因在非轉(zhuǎn)基因煙草中幾乎不表達，而在轉(zhuǎn)基因煙草中大量表達，進一步說明煙草再生植株為轉(zhuǎn)基因植株（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草FmCCoAOMT 基因的PCR 和RT-PCR鑒定泳道1.陰性對照；泳道2.野生型煙草；泳道3.轉(zhuǎn)基因煙草Fig.5 Identification of transformed tobacco FmCCo-AOMT gene by PCR and RT-PCR Lane 1.Negative control；Lane 2.Wild-type tobacco；Lane 3.Overexpressed tobacco

2.3 FmCCoAOMT基因功能分析

2.3.1 FmCCoAOMT 基因?qū)δ举|(zhì)素、纖維素和半纖維素合成的影響

木質(zhì)素、纖維素和半纖維素是植物細胞壁的重要組成部分。以野生型煙草為對照，F(xiàn)mCCoAOMT轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的測定結(jié)果表明（圖6），轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素含量高于野生型煙草，比野生型煙草的含量高出41%，而轉(zhuǎn)基因煙草的纖維素和半纖維素含量比野生型煙草低，纖維素含量比野生型煙草低了32%，半纖維素含量比野生型煙草低了52%，因此可以推測FmCCoAOMT基因與木質(zhì)素的合成相關。

圖6 轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量測定***.P＜0.001，差異極顯著；*.0.01＜P＜0.05，差異顯著Fig.6 Determination of lignin，cellulose and hemicellulose in transgenic tobacco***.P＜0.001，extremely significant difference；*.0.01＜P＜0.05，significant difference

2.3.2 FmCCoAOMT 基因在非生物脅迫中的功能分析

對長勢一致的野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草幼苗進行NaCl、甘露醇、ABA 3 種處理，分別對10、20、30 d 的表型進行拍照記錄，根據(jù)照片結(jié)果顯示（圖7），在150 mmol·L-1NaCl 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因煙草A-11和野生型煙草均長出根系并且狀態(tài)良好，并且轉(zhuǎn)基因株系明顯要高于野生型。在250 mmol·L-1甘露醇培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因煙草A-11 在10 d 時長出了根系，而野生型煙草在20 d 時才長出根系，但是它們的生長狀態(tài)與對照組相比均受到了抑制，并且出現(xiàn)了枯黃萎蔫的現(xiàn)象。在75 mmol·L-1ABA 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因A-11 與野生型煙草均未生根。同時可以看出在3 種脅迫處理下轉(zhuǎn)基因植株A-11 相比野生型植株均有不同程度的生長恢復現(xiàn)象，因此可以推測FmCCoAOMT參與了煙草植株抵抗非生物脅迫和激素信號的誘導。

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草脅迫處理Fig.7 Transgenic tobacco under stress treatments

過氧化物酶（POD）參與植物的生長發(fā)育過程，并且與植物木質(zhì)素合成相關，根據(jù)轉(zhuǎn)基因煙草POD 活性測定結(jié)果可知（圖8），在轉(zhuǎn)基因煙草受到NaCl、ABA 和Man 3 種脅迫處理后，POD 活性與對照組相比顯著增加，其中在NaCl處理后，POD活性增加得最為明顯，比對照組活性高83%，表明轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)化程度較高，進一步推測FmCCoAOMT基因參與木質(zhì)素的合成。超氧化物歧化酶（SOD）是一種存在于植物體內(nèi)可以抑制細胞膜中不飽和脂肪酸過氧化作用的酶，當植物在逆境條件下，SOD 活性迅速增強，從而起到保護細胞膜的作用，根據(jù)轉(zhuǎn)基因煙草SOD 活性測定結(jié)果可知（圖8），在NaCl、ABA 和Man 3 種脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因煙草的SOD 活性高于野生型煙草，分別比對照組的活性升高56.6%、44.2%和19.0%，轉(zhuǎn)基因煙草SOD 活性的顯著升高表明比野生型煙草受到的毒害作用更小。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其濃度的高低可以體現(xiàn)植物在脅迫條件下細胞氧化受損傷的程度，根據(jù)轉(zhuǎn)基因煙草MDA的含量結(jié)果可知（圖8），未經(jīng)脅迫處理以及脅迫處理后的轉(zhuǎn)基因煙草MDA 濃度均小于野生型，其中在NaCl 處理后表現(xiàn)極為明顯，MDA 濃度顯著下降，下降了77.2%，因此可以推測轉(zhuǎn)基因煙草受到的過氧化損傷程度要小于野生型。綜上所述，F(xiàn)mCCoAOMT基因在植物抗逆過程中發(fā)揮著正向調(diào)控作用。

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草POD活性、SOD活性和MDA濃度Fig.8 POD activity，SOD activity and MDA concentration of transgenic tobacco

2.3.3 FmCCoAOMT 基因?qū)χ参锘钚匝鹾亢铣傻挠绊?/p>

植物細胞在生命活動過程中不斷地進行氧化還原反應，研究結(jié)果顯示活性氧在植物對環(huán)境脅迫信號感受、傳遞和適應過程有重要作用，因此測定植物活性氧含量在植物抗逆研究中有著非常重要的作用。本研究采用氮藍四唑（NBT）染色的方法來測定植物體的活性氧，染色結(jié)果顯示（圖9），與對照組相比，未經(jīng)脅迫處理以及脅迫處理后的轉(zhuǎn)基因煙草A-11 葉片藍色沉淀面積均小于野生型，從而得知轉(zhuǎn)基因煙草植株體內(nèi)活性氧含量較少，表明FmCCoAOMT基因的過表達導致脅迫下的損傷減少，因此推測FmCCoAOMT基因參與植物抗逆反應。

圖9 轉(zhuǎn)基因煙草NBT染色Fig.9 NBT staining of transgenic tobacco

3 討論

木質(zhì)素是所有維管植物細胞內(nèi)細胞壁所必需的組分，它廣泛參與植物生長發(fā)育過程，提高植物體的機械強度并增強了其抗逆性。木質(zhì)素由S-木質(zhì)素、G-木質(zhì)素和H-木質(zhì)素3 類單體聚合成酚類多聚體［26］，其中CCoAOMT基因?qū) 型木質(zhì)素合成有特異調(diào)節(jié)作用［27］。本研究分析了水曲柳FmCCoAOMT基因的組織表達模式，結(jié)果表明FmCCoAOMT基因具有組織特異性，其中在木質(zhì)部中表達量較高，因此推測該基因參與了水曲柳中木質(zhì)素的生物合成。此外，我們又分析了水曲柳FmCCoAOMT基因的時空表達模式，結(jié)果顯示在7 月木質(zhì)部中FmCCoAOMT基因的表達量達到峰值，而到9 月時，F(xiàn)mCCoAOMT基因的表達量降到最低值。據(jù)研究表明，CCoAOMT的下調(diào)會導致木質(zhì)素含量降低［28］，而CCoAOMT的過表達導致木質(zhì)素含量增加［29］。例如，甜菜（Beta vulgaris）CCoAOMT轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型相比木質(zhì)素含量明顯增加［30］。本試驗通過測定轉(zhuǎn)基因煙草纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量明顯高于對照組，而纖維素和半纖維素含量有所降低，這與先前研究報道［30］一致，表明FmCCoAOMT基因在木質(zhì)素生物合成中發(fā)揮重要作用，也說明轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素和纖維素的合成可能存在著互相補償關系［31］。

CCoAOMT基因是木質(zhì)素生物合成過程中的一個關鍵酶，其表達水平受到多種環(huán)境脅迫的調(diào)控［32］。對擬南芥的研究表明，AtCCoAOMT1的轉(zhuǎn)錄水平在鹽脅迫時顯著上調(diào)，在甜菜的研究中也有相同的結(jié)論，當甜菜受到鹽脅迫后，CCoAOMT的表達水平明顯增加［33］。此外，對洋麻（Hibiscus cannabinus）CCoAOMT基因的研究表明，其表達水平均響應寒冷、ABA 處理［34］。Liu 等［35］發(fā)現(xiàn)，對柳枝稷（Panicum virgatum）進行干旱、寒冷和機械損傷處理后，CCoAOMT在葉片和莖中的表達水平上調(diào)。綜上所述，不同植物的CCoAOMT基因可以響應多種非生物脅迫。本文研究了FmCCoAOMT基因在非生物脅迫和植物激素誘導下的表達模式，結(jié)果表明FmCCoAOMT基因的表達水平隨著處理時間的增加出現(xiàn)明顯波動，這與上述結(jié)果研究一致，證明FmCCoAOMT基因響應非生物脅迫和激素誘導，從而參與植物抗逆適應過程。植物木質(zhì)部中木質(zhì)素含量的增加可提高植物抵御環(huán)境脅迫的能力。例如，通過觀察外源施加NaCl、Man 和ABA 處理的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的表型發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型有更高的耐鹽和抗旱性，并且隨著處理時間的增加，轉(zhuǎn)基因植株的生根速率要高于野生型，生長狀態(tài)更具有優(yōu)勢。脅迫處理后，對野生型和轉(zhuǎn)基因植株POD、SOD 酶活性分析表明，轉(zhuǎn)基因株系POD、SOD 酶活性均高于野生型，這降低了超氧陰離子對細胞的氧化損傷，同時POD 參與細胞壁木質(zhì)素單體聚合反應［36］，增加了次生細胞壁木質(zhì)素的沉積，進而提高了轉(zhuǎn)基因株系抵御非生物脅迫的能力。另一方面，通過測定過表達植株中MDA 含量，結(jié)果與象草（Pennisetum purpureum）的研究結(jié)果［37］一致，MDA 含量降低，并且過表達植株木質(zhì)素含量增加，使細胞壁硬化，避免細胞脫水，進而降低對細胞的損傷。這些結(jié)果表明，F(xiàn)mCCoAOMT基因的過表達增加了轉(zhuǎn)基因株系中木質(zhì)素的沉積，對于鹽脅迫，干旱脅迫和激素誘導有保護作用。

綜上，F(xiàn)mCCoAOMT基因參與水曲柳的木質(zhì)素生物合成，通過轉(zhuǎn)基因煙草的表型特征以及生理指標的測定，證明FmCCoAOMT基因的過表達可以增強植物體內(nèi)木質(zhì)素的含量，從而提高抵御非生物脅迫的能力。FmCCoAOMT基因抗逆功能的探究為水曲柳的遺傳改良奠定了基礎。