劉小花,蔣 萍,連 穎,余 楊,王桂香,何 幸,蔣華英,陳 濤

成都市新都區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,四川成都 610500

乙型病毒性肝炎是一種由乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝炎病毒感染,主要以肝臟病變?yōu)橹?可經(jīng)血液傳播、性傳播和母嬰垂直傳播,病毒主要感染肝細胞,是一種容易變異的DNA病毒[1]。乙型肝炎(簡稱乙肝)常分為急性和慢性兩種,急性乙肝患者一般經(jīng)過1～3個月就能徹底清除體內(nèi)病毒,同時其肝功能也隨之恢復正常。慢性乙肝患者體內(nèi)病毒難以清除,同時伴有肝功能異常反復,病毒核酸呈陽性,病程長,反復發(fā)作,難以痊愈,慢性感染可以持續(xù)多年或終身,而且常常沒有明顯癥狀。HBV感染呈世界性流行,它可以導致肝炎、肝硬化、肝癌等嚴重健康問題[2]。據(jù)統(tǒng)計,我國人群中乙肝患者達8千萬人,全世界乙肝患者超過20億人,全球約有2億人感染HBV并有60萬人死于HBV相關的肝炎或肝癌,HBV感染已經(jīng)成為全世界人共同關注的問題[3-4],現(xiàn)有的抗病毒治療藥物難以在短期內(nèi)達到治療乙肝的效果。

研究發(fā)現(xiàn),共價閉合環(huán)狀DNA分子(cccDNA)是HBV的復制中間體,與HBV復制密切相關,HBV顆粒進入機體后,脫去衣殼,在相關酶的催化下,形成環(huán)狀雙鏈DNA,進而轉錄形成病毒前基因組(pgRNA),HBV pgRNA是cccDNA的直接轉錄體,其值可以準確反映體內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA分子的水平[5-6]。血清中的HBV RNA多來自于未逆轉錄的pgRNA,故肝臟中HBV RNA直接來源于cccDNA轉錄,其水平可以反映cccDNA的轉錄活性及轉錄水平[7]。研究表明,HBV pgRNA是乙肝E抗原(HBeAg)的翻譯模板,故二者表達水平具有一定相關性,在HBeAg陽性的乙肝患者中,HBV RNA水平與肝臟中HBV cccDNA水平呈正相關[8]。血清中HBV RNA水平能夠反映乙肝患者抗病毒治療后的治療效果、預測NAs治療停藥后的復發(fā)情況。

近年來,臨床上多采用血清學、病毒學方法檢測患者HBV復制情況,血清學檢測多采用乙肝兩對半[9],其中HBeAg是HBV在體內(nèi)復制過程中產(chǎn)生的抗原,HBeAg檢測是評估HBV感染活動性和繁殖能力的一種手段。對于急性乙肝,大多數(shù)患者可以通過充分的支持治療恢復;如若HBeAg持續(xù)陽性3個月以上可能發(fā)展為慢性乙肝,慢性乙肝患者當前主要治療方法包括抗病毒治療和免疫修復治療[10]。轉氨酶主要存在于患者肝細胞內(nèi),是常規(guī)的肝功能指標,主要包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST),ALT和AST是評估乙肝早期肝細胞損傷的更加敏感的指標,其水平增高往往是乙肝早期最早的提示。HBV DNA水平是直接檢測HBV在體內(nèi)復制情況的指標,也是反映病毒繁殖活躍度的關鍵指標,常常采用分子生物學技術進行檢測。HBV RNA可以反映病毒感染的活躍度、繁殖程度及患者的治療效果等,在乙肝表面抗原(HBsAg)、HBeAg和HBV DNA病毒載量等指標受到干擾的情況下,HBV RNA可以提供更敏感和準確的HBV感染活躍度評估[11]。為此,HBV RNA成為了近幾年臨床上治療乙肝的試驗熱點。本次研究通過分析HBeAg陽性及陰性的乙肝患者體內(nèi)HBV RNA水平、HBV DNA水平、轉氨酶(ALT和AST)水平,探討HBV RNA與HBV DNA和轉氨酶水平之間的變化關系,研究其對于乙肝患者臨床診斷臨床價值,為臨床診斷和治療乙肝患者提供新的檢測方向,進一步治療和預防HBV感染。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2022年11月至2023年4月在本院門診及住院部就診的乙肝患者共108例,其中HBeAg陽性患者25例,男17例,女8例,平均年齡(48.17±9.02)歲;HBeAg陰性患者83例,男53例,女30例,平均年齡(48.15±9.11)歲。兩組患者性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。納入標準:(1)診斷滿足臨床乙肝患者診斷標準,其中HBeAg陽性乙肝指患者血清HBsAg陽性、HBeAg陽性,伴有ALT持續(xù)或反復異?；蚋谓M織學檢查有明顯炎癥壞死;HBeAg陰性乙肝指患者血清HBsAg陽性、HBeAg持續(xù)陰性,多同時伴有乙肝E抗體陽性,伴有ALT持續(xù)或反復異?；蚋谓M織學檢查有明顯炎癥壞死[12];(2)準備接受或正在接受乙肝NAs治療的患者。排除標準:(1)肝功能損傷;(2)肝細胞癌;(3)自身免疫性肝病或肝細胞代謝異常;(4)其他不適于納入以上各組情況。本研究符合倫理標準,經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準,并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 HBV RNA檢測采用全自動核酸檢測分析系統(tǒng)(AutoSAT),試劑盒由上海仁度生物科技股份有限公司提供;HBV DNA檢測采用SLAN-96P全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng),試劑盒由湖南圣湘生物科技有限公司提供;AST、ALT檢測測定采用貝克曼庫爾特AU生化分析系統(tǒng),試劑盒由美國貝克曼生物科技有限公司提供;HBeAg檢測采用i3000全自動化學發(fā)光免疫分析儀,試劑盒由四川邁克生物科技股份有限公司提供,嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.3方法

1.3.1HBV RNA檢測 首先取250 μL待測血清樣本與病毒核酸提取液進行混合;置于60 ℃下孵育10 min;待其室溫冷卻之后進行雜交捕獲;吸附于磁珠上后棄除多余廢液;使用洗滌液清洗磁珠;將含有純凈RNA靶標的磁珠顆粒放入有擴增檢測液1、2及酶液組成的擴增體系中,42 ℃反應40 min;采用實時熒光核酸恒溫擴增技術檢測。HBV RNA檢測下限為100 copies/mL,HBV RNA陰性為HBV RNA<100 copies/mL。

1.3.2HBV DNA檢測 根據(jù)待測樣本、陰性、陽性對照以及參考品,按比例配制混勻成PCR混合液,瞬時離心以備用;樣本釋放劑提取樣本核酸;每管各加入40 μL PCR混合液,離心30 s;采用實時熒光定量PCR技術定量檢測。HBV DNA檢測下限為500 IU/mL,HBV DNA陰性為HBV DNA<500 IU/mL。

1.3.3HBeAg和AST、ALT檢測 HBeAg檢測方法為化學發(fā)光法,AST、ALT檢測方法為雙試劑速率法,計算各樣本中AST、ALT水平,檢測均在儀器維護、校準、質(zhì)量控制完成后進行檢測。

2 結 果

2.1兩組乙肝患者HBV RNA、HBV DNA與ALT、AST表達水平比較 HBeAg陽性組乙肝患者HBV RNA、HBV DNA以及ALT、AST水平表達明顯高于HBeAg陰性組乙肝患者(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者HBV RNA、HBV DNA與ALT、AST表達水平比較

2.2兩組乙肝患者HBV RNA與HBV DNA和ALT、AST的相關性分析 HBeAg陽性乙肝患者中,HBV DNA表達與HBV RNA表達呈正相關(r=0.424,P<0.05);ALT、AST水平與HBV RNA表達無相關性(P>0.05)。

HBeAg陰性乙肝患者中,HBV DNA表達與HBV RNA表達呈正相關(r=0.461,P<0.05);ALT、AST水平與HBV RNA表達無相關性(P>0.05)。

2.3兩組乙肝患者HBV RNA、HBV DNA表達情況比較 HBeAg陽性組HBV RNA陽性率和HBV DNA陽性率與HBeAg陰性組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 兩組患者HBV RNA和HBV DNA表達情況比較[n(%)]

3 討 論

慢性HBV感染是一個主要的公共衛(wèi)生問題,全球約有2.4億慢性HBV感染者[13-14],由于HBV cccDNA的持續(xù)存在,即HBV RNA的真正轉錄模板,會導致病毒抗原如HBeAg和HBsAg及子代病毒的產(chǎn)生。對于HBV感染者的抗病毒治療只能達到對病毒的抑制作用,而不能徹底清除病毒[15]。目前,臨床上還不能將肝內(nèi)HBV cccDNA檢測作為常規(guī)診斷方法,因此有必要開發(fā)非侵入性的替代標志物來監(jiān)測HBV cccDNA的數(shù)量或活性。在過去,一些血清學標志物,包括HBV DNA、HBsAg和乙肝核心相關抗原等幾種血清學標志物已被證明與乙肝的關聯(lián)性[16-17]。最近,血清HBV RNA已被認為是評估HBV cccDNA的一個新的生物標志物,乙肝患者血清中HBV RNA轉陰可能意味著患者肝細胞內(nèi)HBV cccDNA的清除或轉錄活性的沉默,也可能提示乙肝患者可以在實現(xiàn)臨床治愈之前,安全地停用NAs抗病毒治療[18]。

本研究通過分析HBeAg陽性和陰性乙肝患者血清HBV RNA與HBV DNA和轉氨酶表達水平的變化發(fā)現(xiàn),HBeAg陽性組HBV RNA、HBV DNA和ALT、AST表達水平明顯高于HBeAg陰性組(P<0.05),與其他學者的研究結果一致[6,19];同時兩組乙肝患者HBV RNA表達水平與HBV DNA表達水平均呈正相關(P<0.05)。張榮芳等[20]發(fā)現(xiàn),乙肝患者HBV RNA與HBV DNA在治療前和治療初期有明顯相關性[20]。羅小露等[21]發(fā)現(xiàn),在乙肝患者HBeAg血清學轉變期,HBV RNA表達水平與HBV DNA表達水平在反映病毒復制活躍性方面具有一致性,在病毒活躍性高的時期,HBV RNA和HBV DNA的相關性更高;當對乙肝患者采用NAs抗病毒治療后,二者的相關性可能會發(fā)生變化。在臨床實踐中,HBV RNA有助于更準確地評估病毒復制水平和預測治療效果,與本研究結果一致。

本研究發(fā)現(xiàn),HBeAg陽性組HBV RNA、HBV DNA陽性率與HBeAg陰性組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。乙肝感染分為兩期,復制期和非復制期,當HBeAg出現(xiàn)血清學轉變,由陽性轉變?yōu)殛幮灾?HBV會隨之停止復制[22]。并且由于蛋白質(zhì)的半衰期比DNA長,故當HBV DNA被抑制或減弱消失時,HBeAg仍可存在一定的時間,故有些乙肝患者HBeAg表達陽性,但是其HBV DNA表達陰性。當HBeAg表達由陽性轉為陰性時,HBV cccDNA仍然可以逆轉錄形成HBV RNA,提示HBV RNA比HBV DNA更能準確反映HBeAg轉陰的情況[23];有文獻報道,在接受治療的乙肝患者中,HBV DNA均低于檢測下限的患者中發(fā)現(xiàn)有35例HBV RNA呈陽性,提示HBV RNA比HBV DNA更能準確反應病毒的存在狀態(tài)。[24]。HBV DNA陽性可以判別乙肝患者或者攜帶者傳染性情況,通過定期HBV DNA定量檢測,可判斷HBV的增長、臨床病情是否穩(wěn)定,還可直接監(jiān)測抗病毒治療的療效[25]。研究表明,HBV RNA可以反映乙肝患者體內(nèi)HBV cccDNA的轉錄活性,也是反映HBV感染活躍度的另一重要指標,此外,HBV RNA對于乙肝患者在抗病毒治療后的療效監(jiān)測、預測疾病轉歸等方面具有重要意義[26-27],ALT、AST是能夠及時反映肝臟發(fā)生不同程度實質(zhì)性病變的關鍵指標[28]。

綜上所述,HBeAg陽性乙肝患者與HBeAg陰性乙肝患者的HBV RNA、HBV DNA和轉氨酶表達水平存在明顯差異,部分HBV DNA陰性乙肝患者,HBV RNA檢測為陽性,因此,可以常規(guī)開展HBV RNA檢測,為早期診斷、病變程度及臨床治療指導等提供診斷依據(jù)。