王帆，雷蕙疑，馮皓，曠文安,2*，賀靈芝

（1.衡陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；3.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421005)

腺嘌呤(Adenine)，即維生素B4，又稱6-氨基嘌呤，是4種常見(jiàn)核堿基的一種，分子式為C5H5N5。腺嘌呤是一種嘌呤衍生物，抗代謝物核苷的類似物，是所有生物體內(nèi)核酸組成的最小單元之一，主要以結(jié)合態(tài)的形式存在，在遺傳物質(zhì)的合成中發(fā)揮著重要作用，參與人體的多種生命活動(dòng)及新陳代謝等，還可以抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[1]。腺嘌呤能促進(jìn)白細(xì)胞增殖，增加體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量，當(dāng)生物體中的腺嘌呤含量變化異常時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)可能會(huì)發(fā)生缺陷和突變，更會(huì)伴隨著某些疾病的產(chǎn)生，例如癌癥、艾滋病、白血病、心肌梗塞以及急性粒細(xì)胞減少癥等[2]。因此，開(kāi)發(fā)靈敏、高效的方法來(lái)監(jiān)測(cè)生物組織中的腺嘌呤對(duì)于疾病預(yù)防意義重大。

目前，報(bào)道的檢測(cè)腺嘌呤的方法主要有：高效液相色譜法[3]、液質(zhì)聯(lián)用法[4]、毛細(xì)管電泳法[5]、熒光光譜法[6]。這些方法存在著檢測(cè)準(zhǔn)確度低、可重復(fù)性較差、步驟繁瑣、設(shè)備儀器昂貴等諸多不足。電化學(xué)檢測(cè)方法不僅成本低廉、操作簡(jiǎn)單、靈敏性高且易于小型化，其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面有更加廣泛的應(yīng)用前景[7]。

在電化學(xué)檢測(cè)應(yīng)用研究中，催化活性高、選擇性好的電極材料直接決定電化學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性。目前，報(bào)道的用于腺嘌呤檢測(cè)的電極材料主要有納米Fe3O4修飾多層碳納米管[8]、納米銅[9]、銀-氯化銀[10]等。盡管這些材料在靈敏度和穩(wěn)定性上有較好的表現(xiàn)，但是開(kāi)發(fā)性能更優(yōu)越的電極材料滿足電化學(xué)傳感的更高要求仍是一種挑戰(zhàn)。

碳納米材料以其獨(dú)特的低維結(jié)構(gòu)、奇特的電氣、機(jī)械和力學(xué)性能以及量子尺寸效應(yīng)，在能源、環(huán)境、生物、醫(yī)藥和微波吸收等新興領(lǐng)域具有許多突出的特性。碳納米管是由碳原子形成的石墨烯片層卷成的無(wú)縫、中空的管體，目前研究較多的是單壁碳納米管、多壁碳納米管和雙壁碳納米管[11]，而螺旋碳納米管(HMWCNTs)研究較少。

本實(shí)驗(yàn)首先合成Ag負(fù)載螺旋碳納米管(Ag/HMWCNTs)的新型材料，發(fā)現(xiàn)其催化性能優(yōu)于HMWCNTs。因此將Ag/HMWCNTs分散涂滴在玻碳電極(GCE)表面，再修飾全氟磺酸樹(shù)脂(Nafion)防止材料掉落，制備Ag負(fù)載螺旋碳納米管修飾玻碳電極(Ag/HMWCNTs/GCE)?；谠撾姌O構(gòu)建的電化學(xué)傳感方法在腺嘌呤的檢測(cè)中展示了較寬的檢測(cè)范圍和較低的檢出限，且能用于實(shí)際樣品中腺嘌呤的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)儀器見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑

1.2 電極材料制備方法

Ag/HMWCNTs的制備：稱取HMWCNTs 20 mg，加入10 mL水進(jìn)行超聲分散。稱取0.1 g AgNO3，加入5 mL水使之溶解，再加入0.55 mol/L的氨水混合均勻形成銀氨溶液。將生成的銀氨溶液在攪拌下滴加入HMWCNTs分散液中形成溶液A。稱取0.75 g葡萄糖，加入5 mL水使之溶解形成溶液B。在攪拌條件下將溶液B緩慢加入溶液A中，至少攪拌40 min后，再靜置60 min，離心、水洗、烘干后得到Ag/HMWCNTs。

1.3 修飾電極的制備

電化學(xué)性能的檢測(cè)采用傳統(tǒng)的三電極體系：在處理過(guò)的玻碳電極(GCE)(先在打磨臺(tái)上進(jìn)行打磨拋光，分別用硝酸、乙醇和水超聲，在紅外燈下干燥)上均勻涂覆 1 μL Ag/HMWCNTs，后修飾1 μL Nafion 作為工作電極(Ag/HMWCNTs/GCE)。以類似的方法制備螺旋碳納米管修飾玻碳電極(HMWCNTs/GCE)。以Pt電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極進(jìn)行測(cè)試。每次測(cè)試前先將修飾電極通過(guò)三組循環(huán)伏安法(CV)進(jìn)行電極的活化，再進(jìn)行CV、方波伏安法(SWV)、電化學(xué)阻抗法(EIS)、計(jì)時(shí)電量法(CC)的測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 物相分析

選用X射線衍射（XRD）分別對(duì)Ag/HMWCNTs和HMWCNTs進(jìn)行物相表征。見(jiàn)圖1。將Ag/HMWCNTs圖譜與HMWCNTs圖譜對(duì)比，可以清楚看出，Ag/HMWCNTs與 Ag標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS 87-0717)和C標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS 41-1487)匹配很好，沒(méi)有出現(xiàn)多余的雜質(zhì)峰，特征峰強(qiáng)且窄，即說(shuō)明該材料除了具有與HMWCNTs的特征峰外，還具有Ag的強(qiáng)烈特征峰；證實(shí)了Ag/HMWCNTs的成 功合成；沒(méi)有其他雜峰說(shuō)明合成產(chǎn)品的純度較高。

圖1 Ag/HMWCNTs和HMWCNTs的X射線衍射圖

2.2 形貌分析

選用掃描電子顯微鏡（SEM）分別表征HMWCNTs和Ag/HMWCNTs的形貌特征，見(jiàn)圖2。相對(duì)于HMWCNTs(圖2（A）),可以明顯看到Ag/HMWCNTs(圖 2（B）)在螺旋管狀的 HMWCNTs上附著有粒徑約200 nm的納米級(jí)金屬銀。納米銀粒子與HMWCNTs的結(jié)合增大了比表面積，高催化活性的Ag納米粒子可提供更多的催化活性位點(diǎn)。

圖2 HMWCNTs和Ag/HMWCNTs的SEM圖

2.3 Ag/HMWCNTs/GCE的電化學(xué)性能表征

以 5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和 0.1 mol/L KCl為電化學(xué)探針，采用EIS對(duì)GCE、HMWCNTs/GCE和Ag/HMWCNTs/Ag負(fù)載螺旋碳進(jìn)行電化學(xué)表征，結(jié)果見(jiàn)圖3。比較3個(gè)電極的阻抗半圈直徑的大小可以表征電極材料導(dǎo)電性能的強(qiáng)弱。從圖3(A)中可以看出，Ag/HMWCNTs/GCE相比其他兩種修飾電極的阻抗最小。同時(shí)表明，該材料成功地附著在裸電極表面，大大提升了電子轉(zhuǎn)移的能力，改善了其電化學(xué)性能，因此Ag/HMWCNTs/GCE的電子傳遞性能最好。同樣，以 5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]和 0.1 mol/L KCl為電化學(xué)探針，采用EIS對(duì)GCE、HMWCNTs/GCE和Ag/HMWCNTs/GCE進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試,結(jié)果見(jiàn)圖3(B)，然后得到 Q-t1/2圖3(C)。根據(jù) Anson 公式[12]計(jì)算電極活化表面積(A)。

圖3 （A）三種電極的電化學(xué)阻抗譜；（B）三種電極的計(jì)時(shí)電量圖；（C）三種電極的Q-t1/2線性關(guān)系圖

Q與t1/2的回歸線性關(guān)系見(jiàn)表3。從表3中數(shù)據(jù)可知，Ag/HMWCNTs/GCE的電極表面積比GCE電極表面積大很多(約為GCE的2倍)，并且也比HMWCNTs的電極表面積大。因此，可以得出將Ag/HMWCNTs修飾在GCE表面后會(huì)大大提高電極的活性比表面積。

表3 電極表面積計(jì)算

2.4 Ag/HMWCNTs/GCE的電催化性能

為考察Ag/HMWCNTs/GCE對(duì)腺嘌呤氧化還原的電催化活性，將 GCE(A)、HMWCNTs/GCE(B)、和 Ag/HMWCNTs/GCE(C)在 1.0×10-3mol/L腺嘌呤溶液中以50 mV/s在-0.5～2.0 V范圍作CV掃描，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可知，HMWCNTs/GCE和GCE對(duì)腺嘌呤的氧化還原產(chǎn)生的催化作用較弱，氧化峰電流分別為 141 μA 和 113 μA；而 Ag/HMWCNTs/GCE具有明顯的氧化峰，其峰電流為315 μA，且峰電流增加最為明顯，說(shuō)明Ag/HMWCNTs/GCE對(duì)腺嘌呤產(chǎn)生了最優(yōu)異的催化性能，即可利用該峰對(duì)腺嘌呤進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖4 （A→C）不同電極在不含（a）和含有（b）1.0×10-3mol/L腺嘌呤溶液中的循環(huán)伏安圖；（D）不同電極在1.0×10-3mol/腺嘌呤溶液中的循環(huán)伏安圖

2.5 pH和富集時(shí)間的優(yōu)化

為了探究腺嘌呤在不同pH條件下在Ag/MWCNT/GCE上的電化學(xué)響應(yīng)效果，將1×10-3mol/L腺嘌呤的B-R緩沖溶液調(diào)成不同pH，在0.6～1.2 V的電位范圍分別對(duì)修飾電極進(jìn)行SVW，如圖5(A)所示。從圖5(B)曲線(a)峰電流與pH的變化關(guān)系可以看出，在pH=2.0時(shí)其峰值最大，故選擇pH為2.0。后面的變富集、變掃速時(shí)間都以該pH為標(biāo)準(zhǔn)。從圖5(B)曲線(b)可知，峰電位Ep與pH成較好的線性關(guān)系，Ep=-0.05655 pH+1.16098，該線性關(guān)系斜率與Nerst理論值接近，說(shuō)明腺嘌呤在Ag/MWCNT/GCE上的質(zhì)子數(shù)(m)與電子數(shù)(n)的比例為1:1。

圖5 (A)Ag/HMWCNTs/GCE 在不同 pH(a→f：1、2、3、4、5、6)中的 SWV 疊圖；(B)pH 與峰電流(a)、峰電壓(b)的變化關(guān)系圖；(C)Ag/HMWCNTs/GCE在不同富集時(shí)間的峰電流的變化關(guān)系圖；(D)Ag/HMWCNTs/GCE 在不同富集時(shí)間的 SWV 對(duì)比關(guān)系圖(a→e：2 s、30 s、60 s、90 s、120 s)

同樣，在1.0×10-3mol/L、pH=2.0的腺嘌呤溶液中以50 mV/s在-0.6～1.4 V范圍作CV，在此條件下通過(guò)改變富集時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，富集時(shí)間為2～120 s(每隔30 s測(cè)試一次)，最終檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5(C)。由圖5(D)可得在2 s時(shí)峰電流最大，當(dāng)富集時(shí)間增加，峰電流隨之下降。因此最終確定本實(shí)驗(yàn)的最佳富集時(shí)間為2 s。

2.6 電極過(guò)程動(dòng)力參數(shù)計(jì)算

使用CV法在不同掃描速率下進(jìn)行CV掃描，研究Ag/HMWCNTs/GCE修飾電極在腺嘌呤上的電化學(xué)參數(shù)。圖6(A)是在濃度為1×10-3mol/L、pH=2的腺嘌呤溶液中，掃描速率從10 mV/s增加至300 mV/s，對(duì)腺嘌呤的CV響應(yīng)曲線。在掃描過(guò)程中，隨著速率的增加，電位向正向移動(dòng)，腺嘌呤的氧化還原峰電流也相應(yīng)地增加。利用氧化峰的峰電位作線性關(guān)系圖，見(jiàn)圖6(B)，得到線性關(guān)系Ep=0.0277 ln V+1.12936，相關(guān)系數(shù)為0.97817，斜率為0.0277，其中 R=8.314 J·mol-1·K-1，F(xiàn)=96480 C/mol，α=0.7，由公式計(jì)算得n=1.58，將計(jì)算結(jié)果取整數(shù)后，電子轉(zhuǎn)移數(shù)為2，所以得到腺嘌呤是2電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。根據(jù)實(shí)驗(yàn)之前優(yōu)化條件pH的計(jì)算可知，m與n的比例為1:1，由此可知腺嘌呤電極可能的反應(yīng)機(jī)理見(jiàn)圖7。

圖6 (A)Ag/HMWCNTs/GCE 修飾電極在腺嘌呤溶液(1×10-3mol·L-1、pH=2)不同掃速下的 CV 圖；(B)峰電壓與掃速的自然對(duì)數(shù)的線性關(guān)系

圖7 腺嘌呤可能的反應(yīng)機(jī)理

2.7 線性關(guān)系和檢出限

利用修飾電極Ag/HMWCNTs/GCE在pH為2.0條件下對(duì)腺嘌呤進(jìn)行濃度梯度檢測(cè)見(jiàn)圖8(A)，發(fā)現(xiàn)其濃度在 6.0×10-5～8.0×10-3mol/L 之間與氧化峰電流的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系，見(jiàn)圖8(B)，其線性方程為：log ip=0.3697logC-3.9583。根據(jù)公式DL=KSb/r，在計(jì)算中K取3；DL為檢出限；r為靈敏度；Sb為標(biāo)準(zhǔn)偏差；可算得檢出限為9.0×10-6mol/L。

圖8 (A)Ag/HMWCNTs/GCE在不同濃度腺嘌呤中的方波伏安圖；(B)峰電流的對(duì)數(shù)值與濃度對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系

2.8 干擾物對(duì)檢測(cè)的影響

采用SWV法，以0.01 mol/L B-R緩沖液作為支持電解質(zhì)，對(duì)1×10-4mol/L的腺嘌呤進(jìn)行干擾測(cè)試。將加入最大干擾物質(zhì)穩(wěn)定的峰電流值與腺嘌呤的穩(wěn)定峰電流相對(duì)比較，求出標(biāo)準(zhǔn)偏差百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果說(shuō)明這些物質(zhì)對(duì)腺嘌呤的電化學(xué)檢測(cè)影響不大。

2.9 電極的重現(xiàn)性

采用SWV法，對(duì)Ag/HMWCNTs修飾電極重現(xiàn)性進(jìn)行考察。取同一支Ag/HMWCNTs修飾電極平行檢測(cè)pH=2.0的1×10-4mol/L腺嘌呤6次，RSD值為2.54%；說(shuō)明Ag/MWCNT/GCE對(duì)腺嘌呤檢測(cè)具有良好的重現(xiàn)性。

2.10 實(shí)際樣品測(cè)定

取雞肝和雞血為實(shí)際樣品，加入適量0.01 mol/L B-R緩沖液，對(duì)樣品中的腺嘌呤進(jìn)行加標(biāo)檢測(cè)，計(jì)算出回收率結(jié)果見(jiàn)表5。雞肝中腺嘌呤的回收率為107.7%，雞血中腺嘌呤的回收率為90.8%；兩種實(shí)際樣品的平均回收率為99.3%；說(shuō)明此方法可用于實(shí)際樣品的定量檢測(cè)。

表5 實(shí)際樣品回收率

3 結(jié)論

基于Ag/HMWCNTs成功地構(gòu)建了電化學(xué)傳感方法，并應(yīng)用腺嘌呤的電化學(xué)響應(yīng)研究，腺嘌呤在Ag/HMWCNTs修飾電極的檢測(cè)下發(fā)現(xiàn)有明顯的氧化峰，最終確定了測(cè)定腺嘌呤的最佳pH為2.0，最佳富集時(shí)間為2 s。在最佳檢測(cè)條件下，腺嘌呤濃度在6.0×10-5～8.0×10-3mol/L之間與其氧化峰電流有良好的線性關(guān)系；檢出限為9.0×10-6mol/L。研究方法可用于檢測(cè)實(shí)際樣品腺嘌呤的含量，平均回收率為99.3%。