王露露 儀子博 王浩哲 能芙蓉 馬新明 張志勇,* 王小純,,*

不同氮利用效率小麥品種TaNRT/TaNPF家族基因表達特點

王露露1儀子博1王浩哲1能芙蓉2馬新明1張志勇1,*王小純1,2,*

1省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室 / 河南農(nóng)業(yè)大學, 河南鄭州 45000;2河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 河南鄭州 450002

氮素是小麥生長發(fā)育的必需元素之一, NO3–-N是小麥從土壤中獲取氮的主要形式。NRT/NPF家族基因編碼膜轉(zhuǎn)運蛋白, 主要參與植物NO3–-N吸收、運輸及分配。為了解小麥NRT/NPF家族基因與氮素利用的關(guān)系, 選用氮高效小麥品種周麥27 (ZM27)和氮低效品種矮抗58 (AK58), 利用二代測序技術(shù), 研究了不同氮水平(N120、N225、N330)開花期TaNRT/TaNPF家族基因在旗葉中的表達特點。結(jié)果表明, 二代測序鑒定到386個TaNRT/TaNPF家族基因; 與AK58相比, ZM27在氮減量(N120)、正常(N225)、過量(N330)條件下差異表達基因分別為27、16和23個, 上調(diào)表達基因分別為16 (59.26%)、12 (75%)和19 (82.61%)個; 減氮條件下ZM27有7個特異下調(diào)表達基因, 氮過量條件下TaNPF8.1表達量最高, 且顯著上調(diào)1.5倍?？梢? TaNRT/TaNPF家族基因表達水平受施氮量及品種調(diào)控。利用小麥網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)TaNRT/TaNPF家族基因表達具有組織特異性及染色體偏好性, 旗葉表達量最高的TaNPF8.1定位于3A染色體, 根系特異表達的TaNRT2.2和TaNRT3.1主要分布于6號染色體, 莖稈特異表達的TaNPF4.5主要分布在2號染色體。qRT-PCR分析顯示TaNRT/TaNPF基因表達特點與二代轉(zhuǎn)錄組及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)結(jié)果一致。TaNPF8.1、TaNPF4.5和TaNRT3.1蛋白互作分析發(fā)現(xiàn), NO3–-N轉(zhuǎn)運可能還需要轉(zhuǎn)錄因子MYB、葉綠素A-B結(jié)合蛋白、伴侶蛋白等協(xié)同參與, 為進一步研究TaNRT/TaNPF家族表達與氮素吸收利用的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

小麥; NRT/NPF; 氮效率; 差異表達; 組織特異性

氮素是小麥生長發(fā)育過程中必需的大量元素之一, 是小麥產(chǎn)量與品質(zhì)形成的重要限制因素[1]。硝態(tài)氮(NO3–-N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)是植物的兩種無機氮源[2], 小麥無機氮吸收轉(zhuǎn)運以NO3–-N為主[3-4]。根系吸收的NO3–一小部分直接同化以支持生長, 大部分通過莖桿運輸?shù)饺~片中同化或儲存于液泡中供以后使用, 完成這些過程需要植物有效地感知外部氮素供應(yīng)水平, 并且通過代謝酶和轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)不同組織的氮需求[2]。

植物體內(nèi)參與NO3–轉(zhuǎn)運的家族包括NPF (Nitrate transporter 1 (NRT1)/Peptide transporter (PTR) family)、NRT2 (Nitrate transporter 2)、NRT3 (Nitrate transporter 3)、CLC (Chloride channel family)和SLAC (Slowly activating anion channel)[5-6]。NPF分為NPF1-NPF8亞家族, 包括低親和力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運體、雙親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運體及多肽轉(zhuǎn)運體[7]。大多數(shù)NPF轉(zhuǎn)運體為低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運體, AtNPF6.3/NRT1.1/CHL1和OsNPF6.5/OsNRT1.1b對NO3?具有雙重親和力[8]。NRT2和NRT3為高親和力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運體[9]。氯離子通道蛋白(CLC)主要轉(zhuǎn)運Cl–, 也轉(zhuǎn)運分子量相近的NO3?; 慢陰離子通道蛋白(SLAC)主要在植物陰離子(Cl–、NO3–等)攝取和氣孔開閉過程中起到重要作用[10]。植物NO3–吸收轉(zhuǎn)運主要由NRT/NPF家族完成。

NRT/NPF家族不同成員組織定位不同, 功能也不盡相同。在擬南芥中, 只有AtNRT2.7定位于種子液泡膜外[11], 其他AtNRT2成員均定位為根系, 參與根系NO3–的吸收, 缺氮誘導AtNRT2.5表達[12]。AtNRT3定位于根系, 是一種高親和力NO3–轉(zhuǎn)運體, 還可以促進NRT2.1的轉(zhuǎn)運活性[13]。AtNPF1定位于展開葉主脈的伴胞中, 參與NO3–向幼葉的分配[14]。AtNPF2分布于擬南芥根系、葉片、花藥及花絲等部位, 參與根系韌皮部NO3–裝載[15]、鹽脅迫下根-莖NO3–轉(zhuǎn)運[16]、根系NO3–外流[12]以及再分配等[17]。AtNPF3定位于葉片次脈、下胚軸、花藥與花絲交界處及根內(nèi)皮層, 與葉片中NO3–積累有關(guān)[18]。AtNPF4定位于根毛和根表皮, 參與NO3–吸收[19]。AtNPF5定位于擬南芥根系和葉片維管束, 參與液泡NO3–外排[20]。AtNPF6主要參與根系NO3–轉(zhuǎn)運[6]。AtNPF7參與木質(zhì)部NO3–轉(zhuǎn)運[21]。AtNPF8與根系小肽吸收密切相關(guān)[22]。OsNPF2定位于根表皮、根木質(zhì)部薄壁組織, 參與根冠NO3–攝取、轉(zhuǎn)運和遠距離運輸[23-24]。OsNPF6定位于水稻根毛、根表皮及維管組織, 決定不同品種水稻的NO3–利用效率[25]。OsNPF7定位于根厚壁組織、皮層、側(cè)根、莖及花柱, 參與細胞內(nèi)及各組織間NO3–分配[26]。OsNPF8.1則調(diào)節(jié)二甲基砷酸鹽在葉、節(jié)、根中的積累[27]。根系可感知外界NO3–濃度并調(diào)節(jié)側(cè)根及根毛發(fā)育, 氮濃度也可作為信號調(diào)控植物體地上與地下部的含氮物質(zhì)運輸[28]。

小麥NRT/NPF基因家族龐大, 包括NPF (NPF1-NPF8)亞家族[8]、NRT2和NRT3, 前人研究表明小麥NPF基因表達受施氮和發(fā)育的調(diào)控[5], 但與氮代謝相關(guān)功能研究較少, 與小麥氮素利用效率相關(guān)的分子機制尚不明確。小麥旗葉與產(chǎn)量形成關(guān)系密切, 開花期旗葉NO3–積累為后期灌漿過程含氮化合物向籽粒運輸提供物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。因此, 本試驗以不同氮處理(N120、N225和N330)的氮高效品種周麥27 (ZM27)和氮低效品種矮抗58 (AK58)開花期旗葉為材料, 通過二代測序分析氮處理對不同氮效率小麥品種NRT/NPF家族基因表達的影響, 并利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫分析NRT/NPF基因家族在小麥不同組織器官中的表達特點, 為進一步深入研究小麥NO3–吸收、轉(zhuǎn)運、分配、同化分子機制奠定基礎(chǔ), 也為氮肥減量及氮高效率小麥品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2018年10月16日滑縣試驗農(nóng)場大田播種, 播種行距20 cm, 基本苗375萬株hm–2。試驗品種是課題組在執(zhí)行國家自然基金(31271650, 2012—2016年)時, 從河南省近10多年來推廣的30個小麥品種中篩選的典型氮高效品種周麥27 (ZM49)和氮低效品種矮抗58 (AK58)。2013—2019年連續(xù)6年大田試驗顯示2個品種的氮效率在不同生態(tài)類型區(qū)表現(xiàn)穩(wěn)定, 氮效率差異顯著。土壤類型為潮土, 含水量14.65%。小麥播種前土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分含量為: 有機質(zhì)20.53 g kg–1、全氮1.01 g kg–1、全磷1.96 g kg–1、全鉀8.43 g kg–1、速效磷55.3 mg kg–1、速效鉀382.85 mg kg–1、硝態(tài)氮17.83 mg kg–1、銨態(tài)氮13.85 mg kg–1。試驗小區(qū)長16 m, 寬7.5 m, 每個小區(qū)設(shè)3個重復。設(shè)置3個施氮處理, 即減氮120 kg hm–2(N120)、正常氮225 kg hm–2(N225)、過量氮330 kg hm–2(N330), P2O5和K2O各225 kg hm–2。肥料在播種前一次施入, 其他管理同一般高產(chǎn)大田。于小麥開花期選取長勢均勻一致的旗葉, 每個處理重復3次, 液氮處理后于–80℃冰箱保存, 用于二代轉(zhuǎn)錄組測序。花后16 d選取N120和N225處理下長勢均勻一致的植株用鐵鍬連根挖出(深40 cm), 用剪刀剪掉所有根系并清洗干凈, 地上部取籽粒(穗中部飽滿的籽粒)、旗葉、旗葉鞘、莖(穗下節(jié)), 液氮處理后于–80℃冰箱保存, 用于qRT-PCR檢驗。

1.2 二代測序

將上述樣品分別于液氮中研磨成粉狀, 將開花期旗葉樣品送百邁客生物科技公司提取RNA并測序。用TRIzol試劑(Thermo Scientific, 美國)提取總RNA, 用安捷倫RNA 6000納米試劑盒及安捷倫2100生物分析儀分析RNA完整性(Agilent Technologies, 美國)[30], 用NEBNext Ultra RNA試劑盒Illumina (New England Biolabs, 美國)建立測序文庫, 用IlluminaHiSeq 4000平臺(Illumina, 美國)進行雙末端測序, 生成150 bp長的reads[31]。通過刪除接頭及含ploy-N的低質(zhì)量reads, 從原始數(shù)據(jù)中獲得約82,011,596個可信reads。用TopHat v2.0.12將這些reads比對到Ensembl Genomes (fttp://ftp.ensemblgenomes. org/pub/plants/release32/fasta/triticum_aestivum/cdna/Triticum_aestivum.TGACv1.cdna.all.fa.gz; release32)的中國春小麥的cDNA數(shù)據(jù)庫中(http://ccb.jhu.edu/ software/tophat/index.shtml)[30]。共獲得78,319個轉(zhuǎn)錄本, 其中24,607個(31.4%)來自A基因組, 25,573個(32.7%)來自B基因組, 24,952個 (31.9%)來自D基因組, 3187個(4.1%)來自未知染色體組。通過下式計算相對表達量。

1.3 熒光定量PCR

為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是否可靠, 采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)對隨機選取的10個基因進行驗證, 包括: 硝酸轉(zhuǎn)運蛋白基因()、()、()、()、()、(); 查耳酮合成酶(); 肽轉(zhuǎn)運蛋白基因(); 過氧化物酶(); 抗病蛋白基因() (表1)。使用TRIzol試劑(Thermo Scientific, 美國)并按照說明書提取不同組織器官總RNA。使用帶有g(shù)DNA Eraser的PrimeScript RT試劑盒(Perfect Real Time) (TaKaRa, 中國大連)進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。用TBGreen Premix ExII (Tli RNase H Plus)試劑盒(TaKaRa, 中國大連)和StepOne Plus Real- Time PCR儀器(Bio-Rad, 美國)進行qRT-PCR, 設(shè)置3個生物學重復。以和為內(nèi)參, 利用2–ΔΔCT方法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 TaNRT/TaNPF鑒定及其表達量分析

基于二代測序數(shù)據(jù)庫, 通過Swiss-Prot注釋檢索Nitrate Transporter關(guān)鍵詞, 查找NRT/NPF基因家族。通過檢索Nitrate Transporter在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(https://www.wheatproteome.org/)查找NRT/NPF基因家族, 下載小麥穗、籽粒、葉、莖、根NRT/NPF家族基因表達量相關(guān)數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)庫屬于源數(shù)據(jù)庫, 由國際小麥測序聯(lián)盟發(fā)布, 收錄了小麥Zadoks在70 (開花后至水熟期前)、71 (水熟期)、75 (乳熟中期)、83 (面團早期)、85 (軟面團期)時期各組織的基因及蛋白表達數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

二代測序數(shù)據(jù)采用DESeq R包(1.18.0)[28]通過比較ZM27和AK58的歸一化數(shù)據(jù)來評估基因表達差異。差異倍數(shù)≥1.5且FDR < 0.05的轉(zhuǎn)錄本被認為是差異表達基因(DEGs)。篩選FPKM≥5的基因, 利用TBtools軟件做熱圖、韋恩圖及TaNRT/TaNPF家族基因染色體定位。利用Cytoscape軟件v3.7.1 (http://www.cytoscape.org/)進行蛋白互作(PPI)分析, 置信得分>0.4, 節(jié)點代表蛋白質(zhì), 節(jié)點間的連線代表PPI網(wǎng)絡(luò)中兩個蛋白間的相互作用。通過AI (Adobe Illustrator 2022)對圖片進行修飾。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaNRT/TaNPF基因家族在不同器官中的表達特點

從二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定到TaNRT/TaNPF家族基因386個, 從網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中鑒定到104個TaNRT/TaNPF家族基因, 選擇FPKM≥5的基因進行差異表達分析。網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫分析顯示(圖1-A), TaNRT/TaNPF在小麥不同組織器官中表達存在差異性, 根系表達量最高, 其次為莖, 葉片中表達量較低。根系中表達量高的基因編碼高親和力和雙親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運體, 包括TaNRT3.1、TaNPF6.3和TaNRT2.2。依據(jù)基因表達豐度, 編碼TaNRT3.1的基因有9個, 據(jù)表達量依次為、、、、、、、及; 編碼TaNPF6.3的基因表達依次為和; 編碼TaNRT2.2的表達量較高, 其他染色體上基因表達量相近。TaNPF4.5主要在莖中表達, 依據(jù)表達量大小依次為和。葉片中主要表達基因是TaNPF6.4, 依據(jù)表達量大小依次為、和基因。二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示(圖1-B), 開花期旗葉是TaNPF2.11、TaNPF6.3、TaNPF8.1和TaNPF8.5基因的主要表達組織, 由1A、1B、2A、3A、5A、5B、5D染色體上基因編碼; 其中TaNPF8.1家族中表達量最高, 其次是。網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫與二代測序相比, 葉片中主要表達基因不完全一致, 可能因為網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中葉片表達量為不同品種、不同生育期及不同處理葉片的多樣品的平均值。

2.2 氮水平對不同氮效率小麥品種TaNRT/TaNPF家族基因表達影響

利用二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定分析了不同氮水平、不同氮效率小麥品種旗葉中TaNRT/TaNPF家族基因的差異表達(DEGs)。與AK58相比, ZM27在氮減量(N120)、正常(N225)及過量(N330)處理的DEGs分別為27、16和23個; 其中, 上調(diào)表達基因分別為16個(59.26%)、12個(75.00%)和19個(82.61%), 下調(diào)表達基因分別為11個(40.74%)、4 (25.00%)和4個(17.39%) (圖2-A)。氮減量、正常及過量處理特異上調(diào)表達基因分別為7個(43.75%)、5個(41.67%)和10個(52.63%), 共同上調(diào)表達基因5個(圖2-B); 不同氮處理共同下調(diào)表達基因4個, 此外, 氮減量(N120)有7個特異性下調(diào)表達基因(圖2-C)。可見, 與氮低效品種AK58相比, 氮高效品種ZM27在不同氮處理下TaNRT/TaNPF家族差異基因大多上調(diào)表達, 減氮處理ZM27有特異的下調(diào)表達基因, 這可能是兩個氮效品種對氮感知及氮效率差異的原因之一。

圖1 TaNRT/TaNPF家族基因差異表達分析

A: 數(shù)據(jù)來自網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(https://www.wheatproteome.org/), 藍-白-紅表示基因表達量由低到高; B: 數(shù)據(jù)來自二代轉(zhuǎn)錄組測序。

A: data are from the online database (https://www.wheatproteome.org/); blue-white-red indicates the relative expression level from low to high, B: data are from the second-generation transcriptome sequencing.

圖2 不同品種不同氮水平下TaNRT/TaNPF家族基因在旗葉中差異表達特點

A: 不同品種不同氮水平下TaNRT/TaNPF家族在旗葉中的差異基因數(shù), 紅箭頭: 上調(diào)基因, 綠箭頭: 下調(diào)基因; B: 不同氮水平下TaNRT/TaNPF上調(diào)表達基因數(shù); C: 不同氮水平下TaNRT/TaNPF下調(diào)表達基因數(shù).

A: the number of TaNRT/TaNPF DEGs. red arrow: the up-regulated gene; green arrow: down-regulated gene. B: the number of up-regulated genes in TaNRT/TaNPF family in different nitrogen levels; C: the number of down-regulated genes in TaNRT/TaNPF family in different nitrogen levels.

兩個不同氮效率小麥品種旗葉TaNRT/TaNPF家族DEGs分析發(fā)現(xiàn)(附表1), 與AK58相比, ZM27所有上調(diào)基因中TaNPF8.1 (和)表達量最高, 且氮過量處理表達量顯著上調(diào)。氮減量、正常及過量處理ZM27均上調(diào)表達基因有TaNPF2.11 (和)、TaNPF4.4 ()、TaNPF8.1 ()及TaNPF8.3 ()。ZM27所有下調(diào)基因的表達量相對較低, 其中TaNPF8.3 ()表達量最高, 在減氮條件下表達量顯著下調(diào)1.5倍; 不同氮處理均下調(diào)表達的基因包括TaNRT2.4 ()、TaNPF5.10 ()、TaNPF4.6 ()和TaNPF8.3 ()。小麥開花期TaNPF8.1主要在旗葉中表達, 在氮過量條件下該基因在ZM27較AK58顯著上調(diào)表達1.5倍。小麥TaNRT/TaNPF基因家族表達水平受品種及施氮量調(diào)控。

為了驗證轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)集的可靠性, 利用qRT-PCR分析從DEGs中選擇的10個基因, 并與RNA-Seq分析獲得的歸一化數(shù)據(jù)進行比較。2個品種3個氮水平的qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致(圖3), 且兩者之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系, 證明RNA-Seq分析結(jié)果可靠。

利用qRT-PCR分析了不同組織器官的TaNRT/ TaNPF家族基因表達, 結(jié)果顯示TaNPF8.1、TaNPF4.5、TaNRT2.2和TaNRT3.1分別在葉、莖、根中表達量最高, 與二代轉(zhuǎn)錄組及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)結(jié)果一致(圖4)。此外, TaNPF8.1、TaNPF4.5、TaNRT2.2和TaNRT3.1還在葉鞘和籽粒中表達, TaNPF8.1在各組織中表達量均較高。TaNPF8.1減氮處理條件下表達量下調(diào); 與AK58相比, ZM27在減氮/正常氮條件下均上調(diào)TaNPF8.1表達量。TaNRT4.5在各組織中表達量較低, 氮處理對其表達量無顯著影響, 且兩品種間表達量亦無顯著差異。TaNRT2.2和TaNRT3.1在減氮處理下表達量上調(diào); 與AK58相比, 減氮處理條件下ZM27中TaNRT2.2和TaNRT3.1表達量上調(diào), 正常氮處理下其在ZM27中表達量下調(diào)。可見, 不同TaNRT/TaNPF基因在不同品種中對氮的響應(yīng)存在顯著差異。

圖3 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

A: 所選差異表達基因qRT-PCR檢測; B: 所選基因?qū)?yīng)的FPKM值。矮抗58: AK58; 周麥27: ZM27。N120: 減氮120 kg hm–2; N225: 正常氮225 kg hm–2; N330: 過量氮330 kg hm–2; NPF5.10-1A、NPF5.10-2D、NPF8.1-3A、NPF8.3-1B、NPF8.3-4A、NPF8.3-4D: 硝酸轉(zhuǎn)運蛋白; CHS2: 查耳酮合成酶2; PR1: 致病相關(guān)蛋白1; POD70: 過氧化物酶70; RPP13: 抗病蛋白。

A: the relative expression level of selected differentially expressed genes detected by qRT-PCR; B: FPKM values corresponding to selected genes. AK58: Aikang 58; ZM27: Zhoumai 27; N120: nitrogen reduction 120 kg hm–2; N225: normal nitrogen 225 kg hm–2; N330: excess nitrogen 330 kg hm?2; NPF5.10-1A, NPF5.10-2D, NPF8.1-3A, NPF8.3-1B, NPF8.3-4A, NPF8.3-4D: nitric acid transporter gene; CHS2: Chalcone synthase2-like; PTR1: Peptide transporter1; POD70: Peroxidase70; RPP13: disease resistance protein RPP13.

藍-白-紅表示基因表達量由低到高。TaNPF8.1、TaNPF4.5、TaNRT2.2、TaNRT3.1: 硝酸轉(zhuǎn)運蛋白; Root: 根系; Peduncle:穂下節(jié); Leaf: 旗葉; Sheat: 旗葉鞘; Grain: 籽粒; 縮寫同圖3。

Blue-white-red indicates gene relative expression level from low to high. TaNPF8.1, TaNPF4.5, TaNRT2.2, TaNRT3.1: nitric acid transporter. Abbreviations are the same as those given in Fig. 3.

2.3 不同氮效率小麥品種旗葉中TaNRT/TaNPF家族差異基因功能分析

由于小麥注釋信息不完整, 將上調(diào)和下調(diào)DEGs的氨基酸序列比對到擬南芥和水稻等基因組上, 根據(jù)Gene Ontology (GO)數(shù)據(jù)庫對其生物學功能進行預測[5](圖5)。發(fā)現(xiàn)TaNRT2.3和TaNRT2.4可能參與小麥根部NO3–吸收, TaNRT2.11參與根部-地上部的NO3–運輸, TaNPF6.2可感知外界硝酸鹽濃度并參與小麥根部NO3–吸收及根部–地上部的NO3–運輸, 這些基因與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫主要組織分布一致。TaNPF5.13可能通過液泡硝態(tài)氮釋放調(diào)控根與地上部之間的硝態(tài)氮分配。TaNPF8.1、TaNPF8.3和TaNPF8.5可能參與根系小肽吸收及營養(yǎng)器官到萌發(fā)花粉的小肽運輸。TaNPF5.8可能與種胚氮積累密切相關(guān)?？梢? TaNRT/ TaNPF廣泛參與小麥NO3–吸收、運轉(zhuǎn)、積累及再分配等過程, 對小麥氮素利用極為重要。

圖5 TaNRT/TaNPF家族差異基因功能預測

藍-白-紅表示基因表達量由低到高。

Blue-white-red indicates gene relative expression level from low to high.

2.4 TaNRT/TaNPF家族差異基因的染色體定位

器官特異表達TaNRT/TaNPF家族差異基因的染色體分布如圖6-A所示, 主要在葉中表達的TaNPF8.1、TaNPF8.3分布在3號和7號染色體長臂上, TaNPF8.5主要由2號染色體表達, 且在長臂及短臂均有表達。主要在莖中表達的TaNPF4.5位于2號染色體長臂靠近著絲粒及7號染色體長臂。主要在根中表達的TaNPF6.3位于1號和4號染色體長臂, TaNRT2.2和TaNRT3.1主要由6號染色體表達, 且在長臂及短臂均有表達。氮響應(yīng)的TaNRT/TaNPF家族差異基因的染色體分布如圖6-B所示, 減氮(N120)條件下TaNRT/ TaNPF家族上調(diào)/下調(diào)表達的基因包括TaNPF5.1、TaNPF5.10、TaNPF5.13、TaNPF6.3、TaNPF7.3、TaNPF8.1及TaNPF8.3; 高氮(N330)條件下上調(diào)/下調(diào)表達基因包括TaNPF2.11、TaNPF5.2、TaNPF5.10、TaNPF6.3、TaNPF8.3及TaNPF8.5; 低/高氮處理下差異表達基因在各染色體上均有分布。不同氮處理均上調(diào)或下調(diào)的基因為TaNPF2.11、TaNRT2.4、TaNPF4.4、TaNPF4.6、TaNPF6.3及TaNPF8.3, 亦分布于各染色體上?？梢? TaNRT/TaNPF基因家族在染色體中分布廣泛, 可能在小麥氮代謝及氮素利用效率過程中相互協(xié)同或補充, 調(diào)節(jié)機制比較復雜。

A: 組織特異表達TaNRT/TaNPF基因染色體定位; B: 氮調(diào)控差異表達TaNRT/TaNPF基因染色體定位。

A: the distribution of tissue-specific TaNRT/TaNPF gene chromosomes; B: the distribution of TaNRT/TaNPF gene regulated by nitrogen chromosomes.

2.5 TaNRT/TaNPF家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape對小麥表達量大且具有組織特異性的基因, 如根系特異表達的TaNRT3.1、莖稈主要表達的TaNPF4.5及花期葉片主要表達的TaNPF8.1, 構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖7)。與TaNRT3.1互作的蛋白有6個, 包括高親和力硝酸轉(zhuǎn)運家族TaNRT2.1/ TaNRT2.3、無機離子轉(zhuǎn)運及代謝蛋白TRIU3_20504及未命名蛋白, 推測根系吸收轉(zhuǎn)運NO3–需要TaNRT2等相關(guān)基因協(xié)同作用。TaNPF8.1互作蛋白有8個, 包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、伴侶蛋白、GPI- anchored蛋白、葉綠素A–B結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子MYB44和藏花酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶, 可見NO3–在葉片中轉(zhuǎn)運十分復雜, 涉及光合作用及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。TaNPF4.5互作蛋白有14個, 包括轉(zhuǎn)錄因子、伴侶蛋白、天冬氨酸蛋白酶、花青素、糖基轉(zhuǎn)移酶、烷烴羥化酶、葉綠素A-B結(jié)合蛋白和蛋白酶抑制劑。分布于根、莖和葉片的主要TaNRT/TaNPF蛋白存在直接或間接的互作關(guān)系, 且不同部位有其特殊的互作蛋白。

圖7 組織特異表達的TaNRT/TaNPF的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)用節(jié)點表示, 相互作用用連線表示. 灰色: 轉(zhuǎn)錄因子; 黃色: 無機離子轉(zhuǎn)運及代謝蛋白; 草綠色: 天冬氨酸蛋白酶; 紅色: 葉綠素A-B結(jié)合蛋白; 紫色: 蛋白酶抑制劑; 綠色: 藏花酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶; 黑色: GPI-anchored蛋白; 藍色: 花青素; 寶石藍: 伴侶蛋白; 玫紅色: 烷烴羥化酶; 淺黃色: 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶; 淺綠色: 高親和力硝酸轉(zhuǎn)運蛋白; 淺粉色: 糖基轉(zhuǎn)移酶。

Proteins are represented by nodes and interactions by wires. Gray: transcription factors; Yellow: inoraganicion transport and metabolism; Prasinous: aspartic acid protease; Red: light-inducible protein; Purple: Bowman-Birk type proteinase inhibitor; Green: crocetin glucosyltransferase; Black: GPI-anchored protein; Blue: cytochrome; Sapphire: chaperone protein; Rosy: MAH1; Buff: NAD kinase; Reseda: nitric acid transporter; Indipink: Cyanidin 3-O-rutinoside 5-O-glucosyltransferase.

3 討論

NO3–是植物生長發(fā)育的主要氮源, 亦是植物體內(nèi)無機氮運輸?shù)闹饕问健O3–的吸收、運轉(zhuǎn)及其同化是小麥蛋白質(zhì)形成的基礎(chǔ), 了解NO3–的吸收、轉(zhuǎn)運及同化機制是提高小麥氮素利用效率的理論基礎(chǔ)。TaNRT/TaNPF家族基因編碼膜轉(zhuǎn)運蛋白, 參與NO3–吸收轉(zhuǎn)運過程。小麥NO3–分配隨生育時期變化, 開花前NO3–從根部運往地上部, 多儲存于旗葉中; 開花后旗葉中NO3–輸出速率不斷升高, 并在灌漿后期達到最大, 隨后降低[31]。本文研究發(fā)現(xiàn), 氮高效品種ZM27花期旗葉TaNPF8.1表達量在不同氮水平下均高于氮低效品種AK58, 且N22處理達到顯著水平。小麥旗葉與產(chǎn)量形成關(guān)系密切, 開花期旗葉NO3–積累為后期灌漿過程含氮化合物向籽粒運輸提供物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。氮高效小麥品種開花期旗葉NO3–積累多, 可能與TaNPF8.1表達量較高有關(guān)[29]。qRT- PCR結(jié)果顯示, ZM27各組織中TaNPF8.1基因表達量比AK58高, 這可能是ZM27氮素高效利用原因之一。

PPI分析發(fā)現(xiàn)TaNPF8.1與伴侶蛋白、葉綠素A–B結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子MYB44和藏花酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶等存在互作關(guān)系。葉綠素A-B結(jié)合蛋白參與光合作用; 轉(zhuǎn)錄因子MYB44觸發(fā)氣孔關(guān)閉維持水分水平和調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài), 應(yīng)對干旱和熱激聯(lián)合反應(yīng)[32], 推測TaNPF8.1涉及光合作用和脅迫應(yīng)答機制, 但它們之間如何互作參與氮代謝過程尚需深入研究。

NO3–吸收、轉(zhuǎn)運、同化及再分配過程十分復雜, 受植物內(nèi)外界環(huán)境調(diào)控。植物體內(nèi)外NO3–濃度通過調(diào)節(jié)NRT/NPF家族基因表達影響根系對NO3–的吸收[28]、調(diào)節(jié)各組織間硝酸鹽的分配[25]。OsNPF6.5定位于水稻根部, 決定不同水稻品種硝酸鹽利用效率[22]。AtNPF6.2定位于葉柄[2], 參與NO3–從根到葉的運輸[33]。OsNPF7.3定位于莖和側(cè)根, 參與氮素分配和籽粒產(chǎn)量[25]。TaNRT/TaNPF家族也具有組織特異性, TaNRT2.2、TaNPF6.3和TaNRT3.1主要在小麥根系中表達, TaNPF4.5主要在莖中表達, TaNPF8.1主要在旗葉中表達。依據(jù)GO數(shù)據(jù)庫對DEGs進行功能分析發(fā)現(xiàn)TaNRT/TaNPF家族基因廣泛參與小麥NO3–吸收、轉(zhuǎn)運、再分配及多肽的運輸?shù)冗^程。結(jié)合前人研究推測TaNRT2.2、TaNPF6.3和TaNRT3.1可能影響不同氮效率小麥品種對NO3–吸收和轉(zhuǎn)運。因此, 深入研究TaNRT/TaNPF家族基因功能及表達特點有利于解析氮高效的分子機制。

Okamoto等[13]研究發(fā)現(xiàn), 高親和力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運體都依賴NRT3基因表達, 而低親和力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運體并不需要。擬南芥AtNRT3.1與AtNRT2互作促進AtNRT2的轉(zhuǎn)運活性[13]。本研究通過PPI分析發(fā)現(xiàn)小麥TaNRT3.1與TaNRT2亦存在互作關(guān)系, TaNRT3.1是否促進TaNRT2的轉(zhuǎn)運活性, 從而從NO3–吸收和轉(zhuǎn)運方面促進小麥氮素利用還需進一步研究。

4 結(jié)論

小麥TaNRT/TaNPF基因家族存在組織器官特異性表達, 其表達水平受施氮量及品種調(diào)控。與氮低效品種AK58相比, 氮高效品種ZM27的差異基因多上調(diào)表達, TaNPF8.1在差異基因中表達量最高, TaNRT/TaNPF家族差異表達基因在各個染色體上均有分布。蛋白質(zhì)互作分析顯示不同組織間TaNRT/ TaNPF互作蛋白存在直接或間接關(guān)系, NO3–轉(zhuǎn)運過程除需要TaNRT/TaNPF家族協(xié)同作用外, 還需轉(zhuǎn)錄因子MYB、葉綠素A–B結(jié)合蛋白、伴侶蛋白等共同調(diào)節(jié)。

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附表1 不同氮效率小麥品種差異基因表達量分析

Table S1 Analysis of differential gene expression in wheat cultivars with different nitrogen efficiency

類型Type基因名稱Gene nameAK58 N120AK58 N225AK58 N330ZM27 N120ZM27 N225ZM27 N330 Up-regulated DEGsNPF2.3TraesCS4A03G10989000.140.290.030.690.350.50 NPF2.11TraesCS5A03G00089002.793.032.195.705.645.08 TraesCS5B03G00016002.392.122.065.866.845.24 TraesCS5B03G01028008.116.376.5211.2911.949.35 NPF4.4TraesCS4A03G05997000.280.410.360.730.751.01 NPF5.1TraesCS7A03G11199002.332.782.503.053.923.64 TraesCS7D03G10674000.500.820.560.640.791.05 NPF5.8TraesCS7B03G02658000.280.390.270.560.500.56 TraesCS7D03G04408000.601.170.911.281.371.45 NPF5.10TraesCS3A03G09038000.590.750.430.711.010.93 NPF5.13TraesCS2D03G13237000.881.191.231.111.581.93 NPF6.2TraesCS1B03G00779000.330.390.370.190.230.95 NPF7.3TraesCS6D03G05935000.210.290.160.440.370.40 NPF8.1TraesCS3A03G092290035.4437.4534.9651.5652.5253.18 TraesCS3A03G09232003.283.043.175.676.215.36 TraesCS3D03G08526000.820.770.620.720.630.96 TriticumnewGene_808717.3616.6315.8625.2825.2724.94 NPF8.3TraesCS7A03G12901000.090.130.581.020.541.13 TraesCS7B03G08353001.981.991.652.602.772.73 Down-regulated DEGsNRT2.4TraesCS7B03G08824005.314.374.390.190.090.25 NPF2.11TraesCS5D03G00109002.531.531.671.491.421.41 NPF4.6TraesCS5D03G01632002.171.201.821.290.500.44 NPF5.2TraesCS4D03G07794001.791.321.561.070.981.37 NPF5.10TraesCS2A03G13507001.892.302.510.991.331.26 TraesCS2B03G15407001.551.391.800.941.091.21 TraesCS3A03G09029000.930.830.890.520.720.64 NPF8.3TraesCS6B03G11469001.100.981.380.540.790.92 TraesCS7B03G08390001.561.532.330.240.430.56 TraesCS7B03G08392007.127.146.784.815.004.94 NPF8.5TraesCS2D03G00168002.021.591.791.081.521.51

Gene expression characteristics of TaNRT/TaNPF family in wheat cultivars with different nitrogen efficiency

WANG Lu-Lu1, YI Zi-Bo1, WANG Hao-Zhe1, NAI Fu-Rong2, MA Xin-Ming1, ZHANG Zhi-Yong1,*, and WANG Xiao-Chun1,2,*

1Co-constuction State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Department of Biochemistry, College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

Nitrogen is one of the essential elements for wheat growth and development, and NO3–-N is the main form of nitrogen that wheat obtains from soil. NRT/NPF genes family encode membrane transporters, which are mainly involved in NO3–-N absorption, transport, and allocation in plants. In order to understand the relationship between NRT/NPF family and nitrogen utilization in wheat, the relative expression characteristic of TaNRT/TaNPF family in flag leaves of N-efficient wheat cultivars Zhoumai 27 (ZM27) and N-inefficient wheat cultivars Aikang 58 (AK58) at flowering stage were studied with the second-generation sequencing technology. The results showed that 386 genes of TaNRT/TaNPF family were identified in the second generation transcriptome database. Compared with AK58, there were 27, 16, and 23 differentially expressed genes in ZM27 in reducing (N120), normal (N225), and excessive (N330) nitrogen treatments. There were 16 (59.26%), 12 (75%), and 19 (82.61%) up-regulated genes in ZM27, respectively. Seven genes were down-regulated in ZM27 in reducing nitrogen treatment. The relative expression level of TaNPF8.1 was the highest and significantly up-regulated by 1.5 times in nitrogen excessive condition. In conclusion, the relative expression of TaNRT/TaNPF family genes was regulated by nitrogen application rate and cultivar. Wheat network database showed that the relative expression of TaNRT/TaNPF family had tissue specificity and chromosomal preference. The highest expression level of TaNPF8.1 in flag leaf was located on chromosome 3A, and the root specific expression TaNRT2.2 and TaNRT3.1 were mainly distributed on chromosome 6. The stem specific expression of TaNPF4.5 was mainly distributed on chromosome 2. The qRT-PCR of TaNRT/TaNPF genes were consistent with the results of the second-generation transcriptome and network data. Interaction analysis of TaNPF8.1, TaNPF4.5, and TaNRT3.1 revealed that NO3–-N transport may also require the collaborative participation of transcription factor MYB, chlorophyll A-B binding protein, and chaperone protein. These findings laid a foundation for further studies on the relationship between TaNRT/TaNPF family expression and nitrogen uptake and utilization.

wheat; NRT/NPF; nitrogen use efficiency; different expression; tissue specificity

10.3724/SP.J.1006.2023.21063

本研究由國家自然科學基金項目(32071956)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32071956).

王小純, E-mail: xiaochun.w@163.com; 張志勇, E-mail: zhiyongzhang@henau.edu.cn

E-mail: wanglulu9501@163.com

2022-09-13;

2023-04-17;

2023-05-16.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230515.1731.002.html

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