丁孟麗 王茹茵 施棟晟 李瑩博 雷 潔 陳洪宇 申清文 王桂鳳

研究簡(jiǎn)報(bào)

玉米小籽粒突變體的基因克隆與轉(zhuǎn)錄組分析

丁孟麗 王茹茵 施棟晟 李瑩博 雷 潔 陳洪宇 申清文*王桂鳳

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / CIMMYT-中國(guó)(河南)小麥玉米聯(lián)合研究中心, 河南鄭州 450046

玉米籽粒大小是影響產(chǎn)量形成的關(guān)鍵因素。本研究鑒定了一個(gè)轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入的小籽粒突變體; 該突變體相較野生型籽粒變小、種皮皺縮、淀粉含量下降, 而醇溶蛋白含量升高。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)突變體胚乳發(fā)育遲緩, 胚乳基底轉(zhuǎn)移層細(xì)胞發(fā)育缺陷。遺傳分析表明是由隱性單基因控制的突變, 通過(guò)圖位克隆將突變基因定位在2號(hào)染色體57.83～61.91 Mb的區(qū)間, 其中已克隆的編碼細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的(,)基因在第5個(gè)外顯子上存在一個(gè)1442 bp的轉(zhuǎn)座子插入。等位測(cè)試證實(shí),為一個(gè)新的基因等位突變體。轉(zhuǎn)錄組分析表明,基因功能缺失影響碳水化合物代謝、儲(chǔ)藏物質(zhì)積累、糖基轉(zhuǎn)移酶活性、細(xì)胞壁生物合成和細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。本研究鑒定的新的等位突變體為深入解析籽粒發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的遺傳材料。

玉米; 籽粒發(fā)育;; 圖位克隆; 細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶; 轉(zhuǎn)錄組分析

玉米(L.)是世界三大糧食作物之一, 主要用于食品、畜禽飼料和工業(yè)原料, 在保障世界糧食安全中舉足輕重[1]。籽粒大小(包括粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚)是影響玉米產(chǎn)量的重要因素, 因此解析籽粒大小的遺傳基礎(chǔ)對(duì)玉米高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種極其重要[2]。成熟玉米籽粒中, 胚乳約占總重的80%～85%, 是玉米籽粒的最大部分, 主要儲(chǔ)存早期幼苗發(fā)育所需的大部分蛋白質(zhì)和碳水化合物, 其次是胚(9%～10%)和種皮(5%～6%)[3]。玉米胚乳發(fā)育的分子機(jī)制研究對(duì)于玉米籽粒相關(guān)性狀的遺傳改良至關(guān)重要。

玉米小籽粒突變體特征是胚乳重量和大小急劇減少, 而胚發(fā)育以及隨后的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。玉米小籽粒突變體可分為2類, 一類是輕微缺陷型(,), 例如[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]和[10]。、、、編碼35肽重復(fù)序列(pentatricopeptide repeat, PPR)蛋白, 作用于線粒體基因轉(zhuǎn)錄本的剪接或編輯[4,7-8,10]。編碼維生素B6合成途徑中的磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate, PLP)合成酶復(fù)合體的谷氨酰胺酶亞基[5]。基因編碼產(chǎn)物為包含2個(gè)mTERF (mitochondrial transcription termination factor)基序的線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子, 參與線粒體復(fù)合物I編碼基因內(nèi)含子4和內(nèi)含子1的剪接過(guò)程[6]。編碼RNA聚合酶III的第2大亞基NRPC2,的突變導(dǎo)致由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的tRNAs和5S核糖體RNA的豐度顯著降低[9]。另一類是微型種子(,)突變體, 目前已經(jīng)分離出6個(gè)玉米突變體, 分別命名為～, 其中～突變體已經(jīng)進(jìn)行了表型分析, 但其突變基因尚未被克隆[11-12]。編碼胚乳特異性細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶2 (CELL WALL INVERTASE 2, INCW2), 細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖不可逆水解為葡萄糖和果糖, 在玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物的源庫(kù)轉(zhuǎn)化[13]。純合突變體是非致死的, 這可能是由于其同源蛋白INCW1 轉(zhuǎn)化酶活性的低水平殘留所致[14]。編碼的蛋白為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型信號(hào)肽酶(ZmSigp1), 主要參與碳水化合物合成相關(guān)蛋白的加工過(guò)程, 且在突變體中的mRNA與蛋白積累都顯著減少[15]。

已有研究表明單基因突變引起的改變具有多效性。Lowe和Nelson首次分離到突變體, 隱性純合突變體籽粒易于區(qū)分, 其為種皮折皺呈紙狀的小籽粒,成熟時(shí)種子重量約為正常()種子重量的1/5[11]。發(fā)育中的突變籽粒胎座-合點(diǎn)區(qū)(placento-chalazal region, PC)細(xì)胞退化, 導(dǎo)致在籽粒小穗柄(pedicel, PED)母體組織的維管束和胚乳之間形成間隙, 且胚乳基底轉(zhuǎn)移層(basal endosperm transfer layer, BETL)細(xì)胞壁內(nèi)增生發(fā)育受阻[13,16]。相比野生型,突變體的胚乳細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞體積變小[17]。隨后的研究表明突變體內(nèi)生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素含量較野生型大幅降低[14,18-21], 其胚乳和胚中蔗糖、葡萄糖、果糖及山梨醇含量相比野生型均有不同程度的下降[22-23]。這些研究表明Mn1參與母體組織到子代組織的蔗糖卸載過(guò)程, 在籽粒發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。此外, 超表達(dá)可以顯著改良玉米籽粒灌漿, 從而大幅提高籽粒產(chǎn)量[24]。

本研究以轉(zhuǎn)座子插入的玉米籽粒突變體為研究對(duì)象。通過(guò)遺傳分析和基因定位, 發(fā)現(xiàn)是一個(gè)新的玉米基因等位突變體, 進(jìn)一步分析了突變對(duì)籽粒儲(chǔ)藏物質(zhì)與轉(zhuǎn)錄組的影響, 揭示了籽粒突變的分子機(jī)理, 為深入解析Mn1在籽粒發(fā)育中的功能提供了新的遺傳材料和線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米籽粒突變體(UFMu-02056)與突變體(,)均從美國(guó)玉米種質(zhì)中心(Maize Genetics Cooperation stock center, http://maizecoop.cropsci.uiuc. edu/)獲得, 其中為轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變體, 該突變體籽粒發(fā)育存在缺陷, 但大部分可以正常萌發(fā), 其苗期長(zhǎng)勢(shì)較弱, 成熟植株可以授粉結(jié)實(shí)。使用雜合子()與自交系鄭58雜交產(chǎn)生的F2群體進(jìn)行基因定位。所有玉米植株夏季種植于河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū), 冬季種植于海南省樂(lè)東黎族自治縣河南農(nóng)業(yè)大學(xué)南繁基地。

1.2 突變體的表型鑒定和遺傳分析

將雜合植株()與自交系鄭58雜交, 自交一代得到成熟的F2代分離果穗, 脫粒后觀察其野生型和突變體籽粒在粒長(zhǎng)、粒寬等方面的差異; 取3個(gè)結(jié)實(shí)飽滿的F2分離果穗, 分別統(tǒng)計(jì)3個(gè)果穗上野生型和突變體籽粒的數(shù)目, 并利用卡方測(cè)驗(yàn)進(jìn)行分離比檢驗(yàn)。

1.3 玉米籽粒總淀粉和蛋白含量測(cè)定

對(duì)于總淀粉和儲(chǔ)藏蛋白含量的測(cè)定, 取3個(gè)F2果穗上的成熟籽粒, 去除胚和種皮后, 將胚乳部分在液氮中用研缽研磨至粉末。一部分研磨后的粉末立即用于蛋白質(zhì)提取, 并通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)醇溶蛋白與非醇溶蛋白的積累, 方法參照Tian等[25]; 另一部分研磨的粉末干燥至恒重, 過(guò)100目網(wǎng)篩, 并使用淀粉總量檢測(cè)試劑盒(Megazyme, K-TSTA-100A)按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總淀粉含量測(cè)定。

1.4 玉米籽粒石蠟切片觀察

將授粉后18 d的籽粒沿縱軸切成3個(gè)部分, 將含有胚的中心部分在FAA溶液(38%甲醛5 mL, 冰醋酸5 mL, 70%乙醇90 mL)中固定, 抽真空15 min, 2次后, 4℃保存。固定后的樣品經(jīng)乙醇梯度(50%、60%、70%、85%、95%、100%)脫水后, 使用石蠟進(jìn)行包埋。切片(10 μm)置于盛放二甲苯的染缸中進(jìn)行脫蠟, 然后使用0.1%甲苯胺藍(lán)溶液對(duì)切片進(jìn)行染色, 依次在100%乙醇、50%乙醇和水中洗去浮色后進(jìn)行封片并使用體視顯微鏡(ZEISS, Stemi508)觀察照相。

1.5 候選基因的定位及遺傳分析

取F2分離群體的成熟果穗上野生型與突變籽粒各12粒, 用TPS法抽提胚乳基因組DNA[25], 并分別等量混合以構(gòu)建突變體DNA池和野生型DNA池, 利用實(shí)驗(yàn)室已有的覆蓋玉米全基因組的240個(gè)InDel (insertion/deletion) 標(biāo)記, 對(duì)這2個(gè)DNA混池分別進(jìn)行擴(kuò)增, 篩選在2個(gè)DNA混池之間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記, 并進(jìn)行連鎖分析。通過(guò)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)提供的玉米基因組DNA序列在2號(hào)染色體26.11～83.16 Mb區(qū)間內(nèi)開(kāi)發(fā)新的InDel標(biāo)記(表1), 用于候選基因的定位克隆, InDel標(biāo)記名稱中數(shù)字代表該標(biāo)記所在染色體上的物理位置。

表1 基因定位及克隆引物序列

根據(jù)基因的定位區(qū)間, 在Gramene網(wǎng)站檢索該區(qū)間內(nèi)基因, 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)()基因?yàn)橐褕?bào)道的籽粒發(fā)育相關(guān)基因[12]。為了探究的籽粒缺陷表型是否由基因功能缺失導(dǎo)致, 以自交系B73中的基因序列為參考, 設(shè)計(jì)了覆蓋全基因組的2對(duì)引物(表1), 分別擴(kuò)增野生型和突變體的基因片段并測(cè)序。通過(guò)鑒定并種植基因突變體(,)雜合體與的雜合體, 將2個(gè)材料進(jìn)行正反交, 并對(duì)成熟果穗進(jìn)行表型觀察。

1.6 轉(zhuǎn)錄組分析

將雜交、回交自交系鄭58構(gòu)建BC4F2近等基因材料, 分別取授粉后15 d雜合果穗上共分離的野生型和突變籽粒, 去除種皮后立即在液氮中冷凍并儲(chǔ)存于–80℃。將上述樣品使用研缽在液氮中研磨成粉末, 取約0.1 g粉末使用總RNA提取試劑盒(TIANGEN, DP441)用于總RNA的提取。RNA質(zhì)檢、文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析均委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)使用R語(yǔ)言edgeR包進(jìn)行分析, 以表達(dá)差異倍數(shù)|log2(Fold Change)|>1和差異顯著性adj<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因, 并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO (gene ontology) 功能注釋和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體mn-Mu的表型和遺傳分析

將突變體雜合子與自交系鄭58雜交以產(chǎn)生遺傳群體, 其F2代的成熟果穗上面呈現(xiàn)正常籽粒與缺陷籽粒表型3︰1的分離規(guī)律(χ2<3.84) (圖1-A和表2), 表明為單基因控制的隱性遺傳突變。與野生型相比, 成熟的籽粒較小, 胚乳發(fā)育不良、胚凹陷, 胚乳外圍呈玻璃質(zhì), 種皮折皺松散, 且突變體籽粒粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚相較野生型均降低(圖1-B～E), 其百粒重僅為野生型的26.82% (圖1-F)。

對(duì)授粉后18 d的野生型與突變籽粒取樣并進(jìn)行組織學(xué)切片觀察, 結(jié)果表明野生型籽粒填充飽滿, 而突變籽粒較小且胚乳發(fā)育不完全, 胚乳與種皮之間存在明顯間隙(圖2-A, B), 其基底轉(zhuǎn)移層與小穗柄連接不如野生型緊密, 中間出現(xiàn)較大空腔, 且BETL細(xì)胞壁內(nèi)增生發(fā)育存在缺陷, 細(xì)胞排列紊亂(圖2-B, E, F)。此外,突變籽粒中胚體較野生型變小, 但可以正常分化出盾片、葉原基和根原基(圖2-C, D)。以上結(jié)果表明突變對(duì)胚乳發(fā)育存在嚴(yán)重影響, 而對(duì)胚發(fā)育影響較小。

表2 F2成熟果穗正常和突變籽粒分離比

c2(0.05)(1)=3.84.

圖1 玉米mn-Mu籽粒的表型特征

A: F1自交成熟果穗; B: 野生型(上排)和(下排)粒長(zhǎng)對(duì)比; C: 野生型(上排)和(下排)粒寬對(duì)比; D: 單粒野生型(左)和突變體(右)籽粒對(duì)比; E: 野生型(左)和(右)籽?？v切; F: 野生型和籽粒百粒重統(tǒng)計(jì)。**表示Student’s檢驗(yàn)在0.01概率水平差異顯著, 圖中標(biāo)尺為1 cm。

A: the typical self-cross mature ear of F1plant; B–C: the comparison of kernel length (B) and kernel width (C) of the wild type (the upper row) and(the lower row) kernels; D: phenotype of the wild type (the left one) and(the right one) kernels; E: the longitudinal-sectional view of of the wild type (left) and(right) kernels; F: the comparison of 100-kernel weight of randomly selected mature wild type andkernels in the segregated ears. Values are means ±SDs. (**:< 0.01, Student’s-test). Bar: 1 cm.

圖2 玉米mn-Mu突變體籽粒的組織學(xué)觀察

A: 野生型籽粒, 標(biāo)尺為1 mm; B:突變體籽粒, 標(biāo)尺為1 mm; C: 野生型籽粒胚, 標(biāo)尺為1 mm; D:突變體籽粒胚, 標(biāo)尺為500 μm; E: 野生型籽粒BETL觀察, 標(biāo)尺為200 μm; F:突變體籽粒BETL觀察, 標(biāo)尺為200 μm。樣品為授粉后18 d發(fā)育中籽粒。

A–B: the longitudinal paraffin sections observation of developing wild-type (A) andmutant (B) kernels, Bar: 1 mm; C–D: the embryos of the wild-type (C) andmutant (D) kernels, Bar: 1 mm (C) and 500 μm (D); E–F: the basal endosperm transfer layer of the wild-type (E) andmutant (F) kernels, Bar: 200 μm. Samples were collected at 18 days after pollination.

2.2 突變體mn-Mu的儲(chǔ)藏物質(zhì)分析

由于成熟的突變籽粒皺縮且相比野生型籽粒較小, 我們對(duì)其主要儲(chǔ)藏物質(zhì)淀粉和蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明突變籽粒胚乳淀粉含量相比野生型略低, 但是差異不顯著(圖3-A)。玉米籽粒中儲(chǔ)藏蛋白分為醇溶蛋白(zein)和非醇溶蛋白(non-zein protein), 醇溶蛋白占總蛋白的60%以上[26]。突變籽粒中醇溶蛋白含量明顯高于野生型, 其中19 kD和22 kD α-zein含量顯著提升, 16 kD和27 kD γ-zein、15 kD β-zein及10 kD δ-zein含量也有一定程度的升高, 而非醇溶蛋白含量相比野生型籽粒差異不明顯(圖3-B, C)。以上結(jié)果表明突變影響籽粒中儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累。

2.3 mn-Mu基因定位

為了克隆突變基因, 我們將雜合植株與自交系鄭58雜交, 獲得F2分離群體用于基因定位。利用240個(gè)覆蓋玉米10對(duì)染色體的InDel標(biāo)記對(duì)突變體DNA池和野生型DNA池進(jìn)行篩選, 將突變基因初步定位在2號(hào)染色體。隨后利用F2群體中的587個(gè)突變籽粒將目的基因定位到2號(hào)染色體57.83～61.91 Mb范圍約4.08 Mb大小區(qū)間內(nèi), 2端分別有1個(gè)和3個(gè)交換籽粒(圖4-A)?；谟衩谆蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)信息, 該區(qū)間內(nèi)包含已發(fā)表的(), 鑒于與突變體表型相似, 故將該基因作為候選基因并對(duì)其進(jìn)行后續(xù)分析。

為了驗(yàn)證突變體是否由基因突變導(dǎo)致, 我們?cè)O(shè)計(jì)了覆蓋全基因組的2對(duì)引物PDC1F/2R和PDC1R/2F, 分別擴(kuò)增野生型和突變體的基因片段。PDC1F/2R引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1670 bp, 在野生型與突變體間沒(méi)有差異; PDC1R/2F引物以野生型DNA為模板獲得1524 bp大小片段, 而以突變體DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2966 bp (圖4-C)。由于為轉(zhuǎn)座子插入突變體, 故對(duì)擴(kuò)增出有差異的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析, 結(jié)果表明突變體中基因的第5個(gè)外顯子上存在1442 bp的片段插入(圖4-B)。序列比對(duì)分析表明該插入片段為來(lái)源于座位的轉(zhuǎn)座子。

A: 野生型和籽粒的總淀粉含量測(cè)定; B: 野生型和成熟籽粒醇溶蛋白含量對(duì)比; C: 野生型和成熟籽粒非醇溶蛋白含量對(duì)比。M: 蛋白分子量標(biāo)記; WT: 野生型; Re1/Re2/Re3代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

A: starch contents of the wild type andmutant kernels; B–C: zein (B) and non-zein (C) accumulation pattern of wild type andmutant kernels by 15% SDS-PAGE. M: marker; WT: wild type; Re1/Re2/Re3 represent three biological replicants.

圖4 玉米mn-Mu的基因定位與克隆

A: 玉米的圖位克隆。: 定位所用的群體數(shù)目, 與InDel標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的數(shù)值為交換籽粒數(shù)目; B:基因結(jié)構(gòu)示意圖。三角符號(hào)代表中轉(zhuǎn)座子插入位置; C:基因DNA全長(zhǎng)擴(kuò)增。M: DNA分子量標(biāo)記; WT: 野生型; Z58: 自交系鄭58對(duì)照。

A: gene mapping of.: the number of individuals for gene mapping, the number under each InDel marker indicates recombinants in the population. B: schematic diagram ofgene with the indicated mutator insertion site inby a triangle. C: PCR amplification ofgene using genomic DNA to detect the mutator insertion inmutant. M: marker; WT: wild type; Z58: the inbred line Zheng 58 as a control.

2.4 mn-Mu和mn1突變體的等位測(cè)試

為了驗(yàn)證基因上轉(zhuǎn)座子的插入是的突變本質(zhì), 利用實(shí)驗(yàn)室已確定的基因突變體(,)雜合體與雜合突變體進(jìn)行正反交。結(jié)果顯示雜交果穗上均呈現(xiàn)正常和突變籽粒3∶1的分離規(guī)律(圖5-A, B), 等位測(cè)試結(jié)果表明是的等位突變體。已報(bào)道的基因突變體多為EMS誘變獲得[14,27], 而突變體由轉(zhuǎn)座子插入基因?qū)е? 因此為一個(gè)新的基因等位突變體。

A:×雜交果穗表型, 標(biāo)尺為1 cm; B:×雜交果穗表型, 標(biāo)尺為1 cm。

A–B: the self-pollinated ears of the reciprocally crossed ears between heterozygousandsegregate defective kernels at a ratio of 25%. Bar: 1 cm.

2.5 突變體mn-Mu的轉(zhuǎn)錄組分析

已有研究分析了突變對(duì)籽粒中糖代謝、激素含量的影響, 并通過(guò)蛋白組學(xué)的研究揭示了在BETL發(fā)育及籽粒發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制[18,22-23,28]。然而糖與激素作為信號(hào)分子, 其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程涉及廣泛的基因表達(dá)調(diào)控, 但目前仍未有基于轉(zhuǎn)錄組水平解析Mn1功能的報(bào)道。為了研究突變?cè)谧蚜０l(fā)育過(guò)程中對(duì)轉(zhuǎn)錄組的影響, 我們使用授粉后15 d雜合果穗上共分離的野生型和突變籽粒進(jìn)行RNA-seq分析。與野生型相比, 在中共鑒定出1357個(gè)差異表達(dá)基因, 包括868個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和489個(gè)下調(diào)表達(dá)基因(圖6-A)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn), 遺傳信息處理(genetic information processing)、碳水化合物代謝(carbohydrates metabolic)、DNA復(fù)制與修復(fù)(replication and repair)過(guò)程、代謝(metabolism)與次級(jí)代謝物生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)途徑被顯著富集(圖6-B)。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析, 結(jié)果表明, 與代謝途徑(metabolic process)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)(carbohydrate transport)、蛋白復(fù)合體寡聚化(protein complex oligomerization)、脂滴(lipid droplet)和脂肪酸結(jié)合(fatty acid binding)相關(guān)過(guò)程被顯著富集(圖6-C), 表明基因的缺失與籽粒儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累有關(guān)。UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶活性(UDP-glycosyltransferase activity)、糖基轉(zhuǎn)移酶活性(glycosyltransferase activity)、轉(zhuǎn)移己糖基團(tuán)活性(transferase activity, transferring hexosyl groups)、糖基水解酶活性(hydrolase activity, acting on glycosyl bonds)等過(guò)程也被富集(圖6-C), 這可能與Mn1作為細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的活性有關(guān), 在突變體中蔗糖卸載過(guò)程受阻, 胚乳中蔗糖、葡萄糖與果糖含量相比野生型均有下降, 可能影響下游糖基轉(zhuǎn)移過(guò)程[23,29]。此外, 多個(gè)與細(xì)胞壁功能相關(guān)條目也被富集, 包括植物型細(xì)胞壁(plant-type cell wall)、細(xì)胞壁大分子物質(zhì)代謝過(guò)程(cell wall macromolecule catabolic process)、多聚糖代謝過(guò)程(polysaccharide catabolic process) (圖 6-C), 可能與突變體BETL細(xì)胞壁內(nèi)增生發(fā)育缺陷直接相關(guān)。細(xì)胞周期相關(guān)的復(fù)制前起始復(fù)合物裝配(pre-replicative complex assembly involved in nuclear cell cycle DNA replication)、DNA復(fù)制起始(DNA replication initiation)、DNA復(fù)制(DNA replication)、姊妹染色單體的結(jié)合(sister chromatid cohesion)、3￠–5￠DNA解旋酶活性(3￠–5￠DNA helicase activity)這些與DNA復(fù)制及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的過(guò)程也被富集(圖 6-C), 表明在調(diào)控細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮功能。后續(xù)通過(guò)遺傳材料深入解析轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能有望豐富玉米籽粒發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3 討論

編碼BETL特異表達(dá)的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶INCW2, 已報(bào)道的多個(gè)突變體均導(dǎo)致籽粒發(fā)育缺陷。等位基因是由自然突變引起的, 該突變導(dǎo)致基因表達(dá)完全喪失, 授粉后12 d的籽粒中總轉(zhuǎn)化酶活性損失98%, 成熟種子重量減少近70%[30]。半顯性等位基因是由EMS誘導(dǎo)的堿基變化產(chǎn)生, 該堿基變化導(dǎo)致脯氨酸到亮氨酸的替換, 并可能影響INCW2蛋白的穩(wěn)定性[27]。籽粒總轉(zhuǎn)化酶活性損失94%, 種子重量減少33%[13,27]。突變體為基因第5個(gè)外顯子上一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致, 該突變體表型與相似, 其成熟籽粒較小、種皮折皺呈紙狀, 種子重量減少70% (圖1), BETL細(xì)胞發(fā)育缺陷, 細(xì)胞壁內(nèi)增生不明顯, 且在胚乳與母體組織維管系統(tǒng)間存在空隙(圖2-B)。突變體表現(xiàn)為典型的缺失突變表型, 由于其為轉(zhuǎn)座子插入突變體, 使用PDC1R/PDC2F共顯性標(biāo)記可以方便地鑒定其基因型(圖4-C), 相比和的基因型鑒定更為便捷, 為深入研究基因功能提供了新的遺傳材料。

圖6 玉米mn-Mu突變體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

A: RNA-seq檢測(cè)差異表達(dá)基因; B: 差異表達(dá)基因KEGG富集分析; C: 差異表達(dá)基因GO富集分析。

A: the volcano plot for differentially expressed genes (DEGs) (Fold change > 2 and adjusted-value < 0.05) between the wild type andmutant; B: significant KEGG pathways in DEGs; C: significant GO terms in DEGs.

催化蔗糖水解是細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的主要生化功能, 代謝釋放的己糖既是母體組織供給子代細(xì)胞發(fā)育的能量物質(zhì), 又是重要的信號(hào)分子, 協(xié)同調(diào)控胚乳和胚的發(fā)育[31-32]。發(fā)育中的突變籽?；颗呷橹衅咸烟?、果糖等己糖含量相比野生型顯著降低, 但蔗糖含量增加[19,22-23]。功能缺失影響籽粒中淀粉的積累[22], 本研究中突變體成熟籽粒中淀粉含量相比野生型也有輕微的降低, 然而醇溶蛋白積累相比野生型卻明顯增加(圖3)。蛋白組分析表明突變體籽粒中碳水化合物代謝相關(guān)蛋白普遍表現(xiàn)出較低的積累或糖基化水平[29,33], 本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集于儲(chǔ)藏物質(zhì)代謝途徑和糖基轉(zhuǎn)移等過(guò)程(圖6-C), 這些結(jié)果均表明Mn1在籽粒儲(chǔ)藏物質(zhì)積累過(guò)程中的重要作用。此外,功能缺失影響發(fā)育籽粒中激素穩(wěn)態(tài),突變體籽粒中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素含量均比野生型降低, 細(xì)胞分裂活性也有降低, 相應(yīng)地胚乳細(xì)胞數(shù)目與細(xì)胞體積也都下降[17-18], 本研究中轉(zhuǎn)錄組分析也表明突變體中DNA復(fù)制及細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程受到較大影響(圖6-C)。已有研究證實(shí)葡萄糖作為信號(hào)分子正調(diào)控細(xì)胞分裂過(guò)程[32,34], 因此, 推測(cè)Mn1水解產(chǎn)生的己糖在調(diào)控籽粒細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

BETL位于胚乳最底部, 緊鄰母體維管組織, 主要負(fù)責(zé)將氨基酸、蔗糖和單糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從母體組織運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｖ? 因此其對(duì)玉米籽粒的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[35]。BETL向內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞壁形成壁內(nèi)突, 增加了質(zhì)膜的表面積, 從而提高了這些細(xì)胞的運(yùn)輸能力[36]。編碼的INCW2蛋白免疫定位于BETL細(xì)胞壁,基因突變引起B(yǎng)ETL細(xì)胞發(fā)育受到影響, 細(xì)胞壁內(nèi)增生產(chǎn)生缺陷[28](圖2)。在突變體中, 與BETL發(fā)育相關(guān)的Myb轉(zhuǎn)錄因子和BETL標(biāo)記基因的表達(dá)量相比野生型顯著提高[37], 許多同細(xì)胞壁發(fā)育相關(guān)的基因也在突變體籽粒差異表達(dá)基因中被富集(圖6), 表明細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)控的糖穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及BETL發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶負(fù)責(zé)光合產(chǎn)物的源庫(kù)轉(zhuǎn)化, 其活性直接影響作物產(chǎn)量。超量表達(dá)水稻細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶()導(dǎo)致種子變小, 而使用栽培稻自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)可以提高種子產(chǎn)量, 表明水稻灌漿過(guò)程中的表達(dá)受到精細(xì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[38]。番茄中細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶LIN5 (LYCOPERSICUM INVERTASE 5)的活性下降也導(dǎo)致結(jié)實(shí)減少和種子變小[39], 而使用RNA干擾沉默細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶抑制子INVINH1后, 番茄細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性明顯提升, 且種子變大, 果實(shí)己糖含量提高[40]。在玉米中通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子超量表達(dá)擬南芥、水稻或玉米均可以顯著增加玉米籽粒灌漿, 提高籽粒產(chǎn)量[24]。細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在擬南芥和水稻中已有部分研究[41-42], 后續(xù)開(kāi)展玉米中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與翻譯后調(diào)控研究有望揭示籽粒產(chǎn)量形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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Map-based cloning and transcriptomic analysis of a maize miniature kernel mutant

DING Meng-Li, WANG Ru-Yin, SHI Dong-Sheng, LI Ying-Bo, LEI Jie, CHEN Hong-Yu, SHEN Qing-Wen*, and WANG Gui-Feng

College of Agronomy, Henan Agricultural University / State Key Laboratory of Wheat and Maize Crops Science / CIMMYT-China (Henan) Joint Research Center of Wheat and Maize, Zhengzhou 450046, Henan, China

Kernel is the main storage organ, which accumulates nutritional compounds and determinates maizeyield. In this study, we identified a miniature kernel mutant,, caused by a random mutator’s insertion. Compared with wild type,had smaller kernels, shrunken pericarp, and decreased significantlykernel weight. Compared with wild type, starch content ofkernels decreased slightly, while zein content increased. Cytological observation showed that the development of the central endosperm and the basal endosperm transfer layer (BETL) was impaired inmutant compared with the wild type. Genetic analysis revealed thatwas a single gene-controlled recessive mutant. Map-based cloning indicated that the mutant gene was positioned in 57.83–61.91 Mbon chromosome 2. In this interval,gene, which encoded CELL WALL INVERTASE 2 (INCW2, Miniature 1, Mn1) previously reported, was found that a 1442 bp transposon derived fromlocus inserted into its 5th exon. Allelic test validated thatwas a new allelic mutant of. Furthermore, transcriptomic analysis revealed that the loss ofaffected gene expression in the processes of carbohydrate metabolism, storage material accumulation, glycosyltransferase activity, cell wall biosynthesis, and cell cycle regulation. In conclusion, a new allelic mutant of maize() was identified and transcriptomic analysis was further performed, which providing a novel maize germplasm and clues toward comprehensive understanding of molecular regulation mechanism ofon kernel development.

maize; kernel development;; gene mapping; cell wall invertase; transcriptomic analysis

10.3724/SP.J.1006.2023.23076

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32001562, U22A20466)和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(KJCX2020A04)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32001562, U22A20466) and the Science and Technology Innovation Fund of Henan Agricultural University (KJCX2020A04).

申清文, E-mail: shenqingwen@henau.edu.cn

E-mail: 1669279049@qq.com

2022-11-14;

2023-05-24;

2023-05-31.

URL: https://kns.cnki.net/kcms2/detail/11.1809.S.20230530.1451.002.html

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