徐歡 周濤 孫悅 王木妹 楊亞春 馬卉 李浩 徐大偉 周海 楊劍波 倪金龍,*

水稻穎殼類(lèi)病斑突變體的鑒定與基因定位

徐歡1,#周濤2,#孫悅1王木妹3楊亞春2馬卉2李浩2徐大偉1周海3楊劍波2倪金龍2,*

(1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，合肥 230036；2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，合肥 230001；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；#共同第一作者；*通信聯(lián)系人，email: jlni09@163.com)

【目的】鑒定水稻穎殼類(lèi)病斑突變體，并進(jìn)行基因定位，為基因克隆及其分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繉?duì)野生型材料LR005和經(jīng)EMS誘變得到的穎殼類(lèi)病斑突變體（）進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析、掃描電鏡分析、DAB染色和全硅含量測(cè)定。與廣親和材料L422雜交獲得的F2群體用于遺傳分析，利用圖位克隆和BSA-seq方法進(jìn)行基因定位?！窘Y(jié)果】突變體在抽穗10 d后穎殼和葉片逐漸出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，成熟后穎殼完全呈現(xiàn)褐色。與野生型相比，突變體的株高、穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等都極顯著降低。DAB染色表明穎殼和葉片的活性氧含量增多；掃描電鏡顯示突變體穎殼和葉片表面硅質(zhì)細(xì)胞皺縮。遺傳分析結(jié)果表明，突變體的穎殼類(lèi)病斑表型受到一對(duì)隱性基因控制。利用與L422的F2分離群體，通過(guò)圖位克隆和BSA-seq等策略將定位在水稻第2染色體上68 kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)有10個(gè)候選基因。序列分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間僅有一個(gè)SNP位點(diǎn)，位于基因（）的第5個(gè)外顯子上，導(dǎo)致第238位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸。對(duì)穎殼和葉片全硅含量的測(cè)定表明，突變體中硅的積累減少，說(shuō)明可能是的等位突變。【結(jié)論】是新的等位突變基因，該突變?cè)斐芍仓旯韬康慕档秃突钚匝醯姆e累，致使穎殼和葉片產(chǎn)生褐色類(lèi)病斑。

水稻；突變體；類(lèi)病斑；硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；基因定位

類(lèi)病斑（lesion mimic）是植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中未受到脅迫而自發(fā)產(chǎn)生的壞死斑，在形態(tài)上類(lèi)似于植物遭受病原菌侵染引起過(guò)敏反應(yīng)而產(chǎn)生的病斑，常見(jiàn)于植物的葉片、葉鞘、莖稈和種皮上[1, 2]。類(lèi)病斑突變體在高等植物中廣泛存在。水稻中已報(bào)道了100多個(gè)類(lèi)病斑突變體，主要以葉片類(lèi)病斑居多，如～[3]，[4]，[5]，[6]和[7]等。類(lèi)病斑突變體往往表現(xiàn)發(fā)育遲緩或早衰，嚴(yán)重影響產(chǎn)量的形成；另一方面，大多數(shù)類(lèi)病斑突變體體內(nèi)防御基因的表達(dá)水平顯著提高，植株抗病性增強(qiáng)[8]。因此，對(duì)水稻類(lèi)病斑突變體的研究能促進(jìn)人們對(duì)水稻產(chǎn)量形成與抗病性的協(xié)同調(diào)控機(jī)制的深入理解。

隨著對(duì)水稻類(lèi)病斑突變體研究的深入，越來(lái)越多的基因被定位和克隆。這些基因的不同功能決定了類(lèi)病斑發(fā)生機(jī)制的差異?？共』蚴撬镜挚共≡秩竞蛿U(kuò)展的重要基因，其突變可能會(huì)導(dǎo)致類(lèi)病斑產(chǎn)生。編碼一個(gè)典型的CC-NB-LRR蛋白，其突變導(dǎo)致過(guò)氧化氫和水楊酸過(guò)量積累，在水稻葉鞘上出現(xiàn)自發(fā)壞死斑[9]。細(xì)胞程序性死亡失控同樣能導(dǎo)致水稻類(lèi)病斑的產(chǎn)生。編碼E3泛素連接酶[4]，該基因突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡調(diào)控失效，出現(xiàn)大面積的細(xì)胞死亡，產(chǎn)生斑點(diǎn)葉。光合色素含量的下降會(huì)影響正常的光合作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡產(chǎn)生類(lèi)病斑。水稻突變體中葉綠體嚴(yán)重降解，葉綠素含量下降，光合蛋白活性變?nèi)酰绊懝夂献饔煤腿~綠素生物合成，導(dǎo)致活性氧的積累和類(lèi)病斑的形成[10]。一些信號(hào)分子的大量積累也會(huì)導(dǎo)致類(lèi)病斑發(fā)生，如活性氧[11]、水楊酸[12]和一氧化氮[13]等。

水稻是典型的“喜硅作物”，在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中硅元素的重要性不言而喻。硅是土壤中含量第二的元素[14]，它主要以單硅酸的形式存在于土壤中。雖然硅并非水稻的必需營(yíng)養(yǎng)元素，但硅在水稻逆境調(diào)節(jié)中發(fā)揮著非常重要的作用，能很好地抵御真菌、害蟲(chóng)等生物脅迫以及鹽脅迫、金屬毒害、干旱脅迫、輻射損傷、營(yíng)養(yǎng)失衡、高溫、冰凍等多種非生物脅迫[15]。硅的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)是通過(guò)硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)的，是高等植物中第一個(gè)被鑒定出來(lái)的硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，它主要定位于根的外皮層和內(nèi)皮層外側(cè)細(xì)胞膜，它的突變會(huì)導(dǎo)致硅吸收缺陷[16, 17]。基因?yàn)楣柰馀呸D(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在大田環(huán)境下，突變體植株矮化，穎殼顏色稍有變化，結(jié)實(shí)率降低，地上部分和穎殼中硅積累量下降[18]。突變體地上部硅沉積混亂，導(dǎo)致硅酸鹽作為硅質(zhì)體在劍葉中重新沉積從而使葉片上的硅濃度比野生型高很多，而在穎殼中的沉積減少，導(dǎo)致穗部的水分散失，最終表現(xiàn)為白穗[19, 20]。根吸收的硅被硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lsi1運(yùn)進(jìn)植物體內(nèi)，然后硅外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lsi2負(fù)責(zé)將硅外排到中柱細(xì)胞，通過(guò)裝載進(jìn)入木質(zhì)部，最終通過(guò)Lsi1蛋白進(jìn)入水稻各組織[21, 22]。硅以單硅酸Si(OH)4被植物吸收，然后以水合二氧化硅（SiO2·H2O）的形式留存在表皮和維管束等組織中形成植硅石[23]。植硅石的研究測(cè)試手段包括光學(xué)顯微鏡、X射線衍射、透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡等[24]。

在眾多水稻類(lèi)病斑突變體中，穎殼類(lèi)病斑突變體鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究從穩(wěn)定遺傳的甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate, EMS）誘變材料中發(fā)現(xiàn)一個(gè)穎殼類(lèi)病斑突變體，該突變體在抽穗10 d后，穎殼和葉片逐漸出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，成熟后顏色更深，通過(guò)基因定位和MutMap分析發(fā)現(xiàn)，是基因突變引起的，而基因編碼一種硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，我們推測(cè)突變體穎殼類(lèi)病斑的出現(xiàn)可能與硅的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本研究對(duì)該突變體進(jìn)行表型鑒定、基因定位、理化分析和組織微觀結(jié)構(gòu)觀察，旨在為解析水稻類(lèi)病斑形成的分子機(jī)制提供更多的線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用試驗(yàn)材料包括安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所自育材料秈稻LR005和粳型常規(guī)稻L422，以及LR005經(jīng)EMS誘變獲得的突變體(穎殼類(lèi)病斑突變體，)。材料種植于安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所廬江試驗(yàn)基地，每行種10株，株行距16.5 cm×25 cm，合理施肥和排灌水，抽穗期前后考查穎殼顏色和取樣，成熟期隨機(jī)取20株考查株高、穗長(zhǎng)、有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等農(nóng)藝性狀。

1.2 DAB染色法

利用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）能和H2O2發(fā)生反應(yīng)生成紅褐色物質(zhì)的特性，參考沈旺鑫的方法[25]，進(jìn)行活性氧的染色。1％DAB溶液配制：將DAB粉末溶于pH為3.8的Tris-HCl，4℃下遮光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。取抽穗期野生型和突變體劍葉放入1%的DAB溶液中，真空處理15 min，后室溫暗處理20 h。將DAB溶液倒出加入無(wú)水乙醇，沸水浴褪色至無(wú)色。將葉片轉(zhuǎn)移到提前配制好的固定液（等體積的無(wú)水乙醇甘油乳酸混合）中固定8 h后，取出觀察是否有紅褐色出現(xiàn)并拍照。

1.3 遺傳分析及定位群體的構(gòu)建

以為母本與正常材料L422雜交獲得F1，收獲F1種子，種植于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所廬江試驗(yàn)基地。觀察F1植株表型并自交得到F2種子。將F2材料種植于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所廬江試驗(yàn)基地，觀察F2群體表型，統(tǒng)計(jì)F2群體中野生型和突變體分離比，利用F2群體進(jìn)行遺傳分析及基因定位。

1.4 精細(xì)定位和候選基因確定

以F2群體為定位群體，采用改良的CTAB法[26]提取DNA。從F2群體中分別選取30株正常植株與30株極端突變表型植株，分單株提取DNA并等量混合，構(gòu)建野生型池和突變型池。然后使用120個(gè)InDel和180個(gè)SSR標(biāo)記在雙親間進(jìn)行多態(tài)性篩選，再利用篩選出的均勻分布于水稻12條染色體的多態(tài)性標(biāo)記擴(kuò)增兩個(gè)混池，選擇突變型池與突變體親本帶型相同而與野生型池帶型不同的標(biāo)記，為可能的連鎖標(biāo)記，完成初步定位。再根據(jù)雙親的變異信息在初步定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)高密度InDel引物進(jìn)一步縮小定位區(qū)間，進(jìn)行精細(xì)定位（表1）。

表1 InDel標(biāo)記引物信息

取穎殼類(lèi)病斑表型植株30株提取DNA，等量混合，構(gòu)建突變型池并隨雙親進(jìn)行二代測(cè)序，用于MutMap分析和預(yù)測(cè)候選基因。

1.5 掃描電鏡觀察

使用鋒利的刀片將野生型和突變體的穎殼和葉片切成小塊，固定在2.5%的戊二醛溶液里，再用30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、100 %乙醇梯度脫水。將脫水的穎殼和葉片冷凍干燥并鍍金。使用掃描電鏡（Zeiss，EVO MA 15型）觀察野生型和突變體的穎殼和葉片。

1.6 硅含量測(cè)定

采集成熟后的野生型和突變體的穎殼和葉片進(jìn)行全硅含量的測(cè)定，每個(gè)樣本3次重復(fù)。采用硅鉬藍(lán)比色法[27]測(cè)定硅含量。首先將水稻組織經(jīng)強(qiáng)堿消煮，將浸出的硅酸與鉬試劑反應(yīng)生成硅鉬酸，再將硅鉬酸還原為硅鉬藍(lán)，在分光光度計(jì)上比色，通過(guò)與硅標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比來(lái)測(cè)定硅含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體glmm1的表型特征

突變體在幼苗期和成熟期都比野生型矮（圖1-A, B）。在抽穗初期，和野生型的穎殼和葉片上均未出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)（圖1-F, I）；抽穗10 d后突變體的穎殼和葉中部逐漸開(kāi)始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，葉尖開(kāi)始干枯（圖1-G, J）；至成熟期，葉中部的褐色斑點(diǎn)不斷延伸，葉尖干枯更加嚴(yán)重，穎殼布滿褐色斑點(diǎn)（圖1-E, H, K）。成熟期的性狀調(diào)查表明，突變體的分蘗數(shù)與野生型無(wú)顯著差異，但株高、穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等都極顯著降低（表2），并且粒長(zhǎng)變短，粒寬變窄（圖1-C, D）。

A, B?苗期和成熟期的野生型(WT)和glmm1的表型；C, D, E?WT和glmm1的籽粒；F, I?抽穗初期；G, J?抽穗中期；H, K?成熟期。標(biāo)尺分別為15 cm（A, B）, 1 cm（C, D, E）和4 cm（F, G, H, I, J, K）。

Fig. 1. Phenotypic comparison of WT and mutant.

2.2 活性氧染色

活性氧具有很強(qiáng)的氧化能力，它的積累會(huì)損害細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)造成細(xì)胞的死亡。類(lèi)病斑的出現(xiàn)往往與活性氧過(guò)度積累引起的細(xì)胞程序性死亡有關(guān)[8]。為了探究穎殼和葉片類(lèi)病斑是否也與活性氧過(guò)度積累有關(guān)，采用DAB染色法分析突變體H2O2在穎殼和葉片中的積累情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，與野生型相比，的穎殼和葉片均被染上褐色（圖2-A, B），表明穎殼和葉片有大量H2O2的積累。由此推測(cè)，穎殼和葉片出現(xiàn)的類(lèi)病斑癥狀可能是活性氧的過(guò)度積累所致。

圖2 野生型和突變體glmm1的穎殼和葉片DAB染色

Fig. 2. DAB staining results of glumes and leaves of the wild-type and its mutant.

2.3 基因定位及候選基因確定

2.3.1 遺傳分析

2.3.2 精細(xì)定位

選取120個(gè)InDel和180個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)親本L422和進(jìn)行多態(tài)性篩選，共選出覆蓋在水稻12條染色體上的多態(tài)性標(biāo)記91個(gè)。利用這91個(gè)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行初定位，結(jié)果顯示位于第2染色體標(biāo)記X1和X6之間，物理距離約為2.48 Mb（圖3-A）。通過(guò)在該區(qū)間設(shè)計(jì)高密度標(biāo)記（表1），并結(jié)合染色體步移策略，將精細(xì)定位在標(biāo)記Y3和Y5之間，物理距離為68 kb，覆蓋10個(gè)編碼基因（圖3-B和圖3-C）。根據(jù)水稻基因組注釋計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.uga.edu/）提供的信息，對(duì)該區(qū)間的10個(gè)基因進(jìn)行注釋分析（表4），其中（）和（）已被克隆。編碼硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的突變會(huì)導(dǎo)致地上部組織硅含量的減少[16]；編碼Cullin蛋白，是RING型E3泛素連接酶的一部分，該基因突變體的葉片表面會(huì)出現(xiàn)淺紅色褐斑，葉片中積累更多過(guò)氧化氫[28]。由于突變體穎殼和葉片表面植硅石結(jié)構(gòu)和二氧化硅細(xì)胞均發(fā)生了變異，同時(shí)穎殼和葉片活性氧也均出現(xiàn)了過(guò)度積累，這暗示和都有可能是的候選基因。

表2 野生型與突變體glmm1的主要農(nóng)藝性狀比較

表中各數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式呈現(xiàn)。**代表野生型與突變體間的差異達(dá)0.01顯著性水平。樣本量：株高=20，穗長(zhǎng)=20，有效穗數(shù)=20，每穗總粒數(shù)=10，結(jié)實(shí)率=10，千粒重=4。

The data in the table are listed as means ± standard deviation. **Difference between WT and mutant is significantat0.01 level. Sample size: for plant height,=20; for panicle length,=20; for grain number per panicle,=20; for seed-setting rate,=10; for thousand grain weight,=4.

表3 glmm1穎殼類(lèi)病斑性狀的遺傳分析

2.3.3 MutMap分析

通過(guò)對(duì)親本L422、LR005和突變體混池高通量測(cè)序（MGI-DNB Seq測(cè)序平臺(tái)），共獲得34.6G數(shù)據(jù)，GC含量為43%～44%。參考基因組為日本晴，基因組大小365M，來(lái)源于Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站(http://rice.uga.edu/)。三個(gè)樣本的GC含量分別為43.95%、43.3%和44%，Q30分別為91.22%、91.5%和89.59%。表明測(cè)序質(zhì)量高，一致性好，可用于MutMap分析。

采用YuSugihara的MutMap分析腳本，將滑動(dòng)窗口(slide windou)設(shè)置為2M、以步長(zhǎng)100 k，利用QTL-seq（https://github.com/YuSugihara/mutmap）進(jìn)行分析。根據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第2染色體上檢測(cè)到一個(gè)超過(guò)0.99閾值線的正態(tài)分布峰，該區(qū)域與之前定位的結(jié)果一致（圖3-D）。在該區(qū)域內(nèi)僅有1個(gè)SNP的SNP指數(shù)達(dá)到了1，位于基因（）上。通過(guò)對(duì)該基因測(cè)序，結(jié)果表明該突變位于基因的第5個(gè)外顯子上（圖3-F），突變?cè)斐删幋a的第238位氨基酸從異亮氨酸（Ile）變?yōu)樘K氨酸（Thr）（圖3-E），與之前SNP指數(shù)為1的位點(diǎn)一致；而基因組序列在野生型和突變體之間沒(méi)有差異。根據(jù)以上結(jié)果我們推測(cè)，突變體表型可能是基因突變所致。

2.4 掃描電鏡分析

為了探究穎殼和葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)的原因，對(duì)野生型和突變體的穎殼及葉片進(jìn)行了掃描電鏡分析。穎殼掃描電鏡結(jié)果表明，與野生型雙乳突狀的結(jié)構(gòu)相比（圖4-A, B和圖4-E, F），在突變體植株出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)前后，穎殼表面植硅石結(jié)構(gòu)遭到破壞，表現(xiàn)為粗糙和皺縮（圖4-C, D和圖4-G, H）。葉片的掃描電鏡結(jié)果顯示，野生型正常（圖4-I, J和圖4-M, N），葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)前后表面的啞鈴型二氧化硅細(xì)胞也遭到了破壞（圖4-K, L和圖4-O, P）。這表明基因的突變導(dǎo)致了水稻穎殼植硅石結(jié)構(gòu)和葉片表面硅質(zhì)細(xì)胞的破壞。

表4 候選區(qū)間基因注釋

圖3 水稻GLMM1基因的精細(xì)定位

Fig. 3. Fine mapping of ricegene.

2.5 全硅含量的測(cè)定

由于編碼產(chǎn)物為硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為了探討該突變是否會(huì)造成植株硅含量的變化，對(duì)成熟后的野生型和突變體的穎殼和葉片進(jìn)行全硅含量的測(cè)定。結(jié)果顯示，的穎殼和葉片的全硅含量和野生型比較均顯著降低（圖5），野生型中穎殼的全硅含量為23.00 g/kg，突變體中葉片的全硅含量為3.43 g/kg；野生型中葉片的全硅含量為31.23 g/kg，突變體中葉片的全硅含量為4.82 g/kg。表明的基因突變導(dǎo)致了其體內(nèi)全硅含量的降低，進(jìn)一步表明即為。

A, C, I, K?抽穗初期野生型(WT)和glmm1的穗和葉片的表型特征；B, D, J, L?抽穗初期WT和glmm1的穗和葉片的掃描電鏡觀察；E, G, M, O?成熟期WT和glmm1的穗和葉片的表型特征；F, H, N, P?成熟期WT和glmm1的穗和葉片的掃描電鏡觀察。標(biāo)尺為4 cm（A, C, E, G, I, K, M, O），40 μm(B, D, F, H, J, L, N, P)。紅色箭頭指向植硅石和二氧化硅細(xì)胞。

Fig. 4. Scanning electron microscopy observation of rice glumes and leaves.

3 討論

在已發(fā)現(xiàn)的100多個(gè)類(lèi)病斑突變體中，大多數(shù)的斑點(diǎn)出現(xiàn)在葉片上，但它們出現(xiàn)的時(shí)間各不相同，[29]、[30]、[31]和[32]等突變體分別在播種10、14、20和30 d后葉片開(kāi)始出現(xiàn)斑點(diǎn)，[33]在3～4葉期，[34]在開(kāi)花期，[6]在分蘗后期。本研究的突變體在抽穗前不出現(xiàn)類(lèi)病斑，抽穗10 d后逐漸出現(xiàn)褐色病斑，隨著水稻的不斷成熟，褐色病斑的數(shù)量不斷增多，并且這些褐斑不僅出現(xiàn)在葉片上還出現(xiàn)在穎殼表面。這表明類(lèi)病斑的出現(xiàn)依賴于一定的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。

A?穎殼；B?葉片。**代表野生型與突變體間的差異達(dá)0.01顯著水平(n=3)。

Fig. 5. Determination of total silicon content of the wild type (WT) and its mutant.

水稻類(lèi)病斑發(fā)生過(guò)程中活性氧發(fā)揮著重要作用。活性氧物質(zhì)主要存在于細(xì)胞的線粒體和葉綠體中，通常在植物體內(nèi)維持低濃度的動(dòng)態(tài)平衡，在受到病原菌侵害時(shí)，激活植物的免疫反應(yīng)，抵御病原菌的侵染，是植物限制病原菌侵染的重要途徑[35]。然而，大量積累的活性氧會(huì)影響細(xì)胞正常的生理活動(dòng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而引起細(xì)胞程序性死亡，產(chǎn)生褐色類(lèi)病斑[36]。Lin等[37]發(fā)現(xiàn)的類(lèi)病斑突變體由于體內(nèi)活性氧含量升高，激活了硝酸還原酶的活性，造成一氧化碳的大量積累，產(chǎn)生類(lèi)病斑。本研究的穎殼類(lèi)病斑突變體不僅在葉片上檢測(cè)到活性氧積累，而且在穎殼上同樣檢測(cè)到大量的活性氧存在?；钚匝醯姆e累通常是由于細(xì)胞內(nèi)活性氧清除機(jī)制受到干擾，如細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽等含量或活性降低，導(dǎo)致不足以清除新產(chǎn)生的活性氧。水稻缺硅會(huì)導(dǎo)致抗氧化能力的降低和活性氧的積累。前人研究表明，過(guò)表達(dá)的水稻比野生型和轉(zhuǎn)基因水稻擁有更多的抗氧化酶類(lèi)，如抗壞血酸過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等，在應(yīng)對(duì)紫外線輻射時(shí)表現(xiàn)出更好的耐受性[38]，推測(cè)突變體可能對(duì)硅元素吸收減弱導(dǎo)致抗氧化能力衰退，進(jìn)而引起活性氧的積累。

本研究對(duì)突變體進(jìn)行了遺傳分析和基因定位，發(fā)現(xiàn)受單隱性基因控制，通過(guò)精細(xì)定位和MutMap分析預(yù)測(cè)該基因可能為（），測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)突變體在基因的第5個(gè)內(nèi)含子的堿基由T變?yōu)镃，造成編碼的第238位氨基酸從異亮氨酸Ile變?yōu)樘K氨酸Thr；而突變體是單堿基突變,由G變?yōu)锳，造成第132位的丙氨酸變成蘇氨酸。這兩種突變都會(huì)降低硅元素積累，但其他性狀不盡相同，可能是突變位點(diǎn)不同所致。由此推測(cè)，是基因的新等位型。

水稻是典型的“喜硅作物”，硅元素在水稻表皮細(xì)胞的硅質(zhì)化，病蟲(chóng)害的防御和養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)等方面都發(fā)揮著重要的作用[39]。植硅石廣泛存在于水稻的穎殼表皮，它的中空狀隆起體區(qū)別于別的禾本科植物，具有光滑的外壁丘形隆起和雙乳狀突起。植硅石的形成主要是通過(guò)“硅質(zhì)化”代謝產(chǎn)生的，水稻由根部吸收的硅酸通過(guò)蒸騰作用至地上部，然后沉積在葉片和穎殼等器官的表皮細(xì)胞上[40-43]。這種沉積與水稻的硅元素吸收情況密切相關(guān)，水稻的新嫩葉片在缺硅處理后未出現(xiàn)明顯的硅化細(xì)胞并且乳突較小，而供硅處理的情況則截然不同，呈現(xiàn)均勻分布的硅化細(xì)胞和較大的乳突[44]。本研究發(fā)現(xiàn)穎殼和葉片表面的植硅石形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常，均出現(xiàn)了不同程度的皺縮和破損。對(duì)野生型LR005和突變體穎殼和葉片的全硅含量檢測(cè)結(jié)果表明，硅元素在的吸收和積累受到抑制，從而導(dǎo)致了植硅石形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異常。初步闡釋了水稻突變體的表型及候選基因，為解析穎殼類(lèi)病斑的基因克隆和分子機(jī)理的解析提供理論基礎(chǔ)。

謝辭：本研究二代測(cè)序工作得到了國(guó)家基因庫(kù)的支持，特此致謝。

[1] 孫志廣, 代慧敏, 陳庭木, 李景芳, 遲銘, 周振玲, 劉艷, 劉金波, 徐波, 邢運(yùn)高, 楊波, 李健, 盧百關(guān), 方兆偉, 王寶祥, 徐大勇. 水稻類(lèi)病斑突變體的鑒定與基因定位 [J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2022, 36(4): 357-366.

Sun Z G, Dai H M, Chen T M, Li J F, Chi M, Zhou Z L, Liu Y, Liu J B, Xu B, Xing Y G, Yang B, Li J, Lu B G, Fang Z W, Wang B X, Xu D Y. Phenotypic identification and gene mapping of a lesion mimic mutantin rice [J]., 2022, 36(4): 357-366. (in Chinese with English abstract)

[2] Kelly D, Vatsa A, Mayham W, Kazic T. Extracting complex lesion phenotypes in[J]., 2016, 27(1): 145-156.

[3] Wu C, Bordeos A, Madamba M R, Baraoidan M, Ramos M, Wang G L, Leach J E, Leung H. Rice lesion mimic mutants with enhanced resistance to diseases [J]., 2008, 279(6): 605-619.

[4] Liu J, Park C H, He F, Nagano M, Wang M, Bellizzi M, Zhang K, Zeng X, Liu W, Ning Y, Kawano Y, Wang G L. The RhoGAP SPIN6 associates withandand negatively regulates programmed cell death and innate immunity in rice [J]., 2015, 11(2): e1004629.

[5] Shen X, Liu H, Yuan B, Li X, Xu C, Wang S.negatively regulates rice bacterial resistance via activation of ethylene biosynthesis [J]., 2011, 34(2): 179-191.

[6] Zeng L, Yin Z, Chen J, Leung H, Wang G L. Fine genetic mapping and physical delimitation of the lesion mimic geneto a 160-kb DNA segment of the rice genome [J]., 2002, 268(2): 253-261.

[7] Hong Y, Zhang Y, Sinumporn S, Yu N, Zhan X, Shen X, Chen D, Yu P, Wu W, Liu Q, Cao Z, Zhao C, Cheng S, Cao L. Premature leaf senescence 3, encoding a methyltransferase, is required for melatonin biosynthesis in rice [J]., 2018, 95(5): 877-891.

[8] 焦然, 徐娜, 胡娟, 宋周琳, 胡佳青, 饒玉春, 王躍星. 水稻類(lèi)病變突變體性狀及分子機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2018, 32(3): 285-295.

Jiao R, Xu N, Hu J, Song Z L, Hu J Q, Rao Y C, Wang Y X. Advances in traits of lesion mimic mutants and its molecular mechanisms in rice [J]., 2018, 32(3): 285-295. (in Chinese with English abstract)

[9] Tang J, Zhu X, Wang Y, Liu L, Xu B, Li F, Fang J, Chu C. Semi-dominant mutations in the CC-NB-LRR-typegene,, lead to constitutive activation of defense responses in rice [J]., 2011, 66(6): 996-1007.

[10] Cui Y, Peng Y, Zhang Q, Xia S, Ruan B, Xu Q, Yu X, Zhou T, Liu H, Zeng D, Zhang G, Gao Z, Hu J, Zhu L, Shen L, Guo L, Qian Q, Ren D. Disruption of, encoding a cytochrome P450 monooxygenase, induces ROS accumulation and cell death in rice[J]., 2021, 105(4): 942-956.

[11] Wei Q, Yan Z, Xiong Y, Fang Z. Altered expression ofinfluences rice lesion mimic and leaf senescence by regulating arginine transport and nitric oxide pathway [J]., 2021, 22(4): 2181.

[12] Liu X, Li F, Tang J, Wang W, Zhang F, Wang G, Chu J, Yan C, Wang T, Chu C, Li C. Activation of the jasmonic acid pathway by depletion of the hydroperoxide lyasereveals crosstalk between the HPL and AOS branches of the oxylipin pathway in rice[J]., 2012, 7(11): e50089.

[13] Lin A, Wang Y, Tang J, Xue P, Li C, Liu L, Hu B, Yang F, Loake G J, Chu C. Nitric oxide and protein-nitrosylation are integral to hydrogen peroxide-induced leaf cell death in rice [J]., 2011, 158(1): 451-464.

[14] Ingestad T. Mineral Nutrition of Plants: Principles and Perspectives [J]., 1973, 19(2): 156.

[15] Ma J F. Role of silicon in enhancing the resistance of plants to biotic and abiotic stresses [J]., 2004, 50(1): 11-18.

[16] Ma J F, Tamai K, Yamaji N, Mitani N, Konishi S, Katsuhara M, Ishiguro M, Murata Y, Yano M. A silicon transporter in rice [J]., 2006, 440(7084): 688-691.

[17] Azeem S, Li Z, Zheng H, Lin W, Arafat Y, Zhang Z, Lin X, Lin W. Quantitative proteomics study onin regulation of rice (L.) cold resistance [J]., 2016, 78(3): 307-323.

[18] Ma J F, Yamaji N, Mitani N, Tamai K, Konishi S, Fujiwara T, Katsuhara M, Yano M. An efflux transporter of silicon in rice [J]., 2007, 448(7150): 209-212.

[19] Yamaji N, Ma J F. A transporter at the node responsible for intervascular transfer of silicon in rice [J]., 2009, 21(9): 2878-2883.

[20] Yamaji N, Mitatni N, Ma J F. A transporter regulating silicon distribution in rice shoots[J]., 2008, 20(5): 1381-1389.

[21] Mitani N, Ma J F, Iwashita T. Identification of the silicon form in xylem sap of rice (L.)[J]., 2005, 46(2): 279-283.

[22] Huang S, Yamaji N, Sakurai G, Mitani-Ueno N, Konishi N, Ma J F. A pericycle-localized silicon transporter for efficient xylem loading in rice [J]., 2022, 234(1): 197-208.

[23] Currie H A, Perry C C. Silica in plants: Biological, biochemical and chemical studies[J]., 2007, 100(7): 1383-1389.

[24] 崔鵬，苑世領(lǐng)，徐桂英. 玉米植株中的植硅石及其納米SiO2的制備 [J]. 無(wú)機(jī)材料學(xué)報(bào), 2009, 24(3): 512-516.

Cui P, Wan S L, Xu G Y. Phytoliths in mealies corns and preparation of SiO2nano-materials[J]., 2009, 24(3): 512-516. (in Chinese with English abstract)

[25] 沈旺鑫, 史小品, 杜海波, 馮志明, 陳宗祥, 胡珂鳴, 范江波, 左示敏. 水稻類(lèi)病斑突變體基因克隆及發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2022, 38(03): 837-48.

Sen W X, Shi X P, Du H B, Feng Z M, Chen Z X, Hu K M, Fan H B, Zuo S M. Research advances in gene cloning and occurrence mechanism of rice lesion mimic mutants[J]., 2022, 38(3): 837-848. (in Chinese with English abstract)

[26] Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues[J]., 1985, 5(2): 69-76.

[27] 華海霞, 于慧國(guó), 劉德君. 硅鉬藍(lán)比色法測(cè)定植株中的硅[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2013(24): 173-4.

Bi H X, Xu H G, Liu D J. Determination of silicon concentration in the plants by colorimetric molybdenum blue method[J]., 2013(24): 173-174. (in Chinese with English abstract)

[28] Liu Q, Ning Y, Zhang Y, Yu N, Zhao C, Zhan X, Wu W, Chen D, Wei X, Wang G L, Cheng S, Cao L.negatively regulates cell death and immunity by degradingin rice[J]., 2017, 29(2): 345-359.

[29] 奉保華, 楊楊, 施勇烽, 林璐, 陳潔, 黃奇娜, 魏彥林, Leung H, 吳建利. 水稻淡褐斑葉突變體的遺傳分析與基因定位[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2012, 26(3): 297-301.

Feng B H, Yang Y, Shi Y F, Lin L Chen J, Huang Q N, Wei Y L, Leung H, Wu J L. Genetic analysis and gene mapping of a light brown spotted leaf mutant() in rice[J]., 2012, 26(3): 297-301. (in Chinese with English abstract)

[30] Tong X, Qi J, Zhu X, Mao B, Zeng L, Wang B, Li Q, Zhou G, Xu X, Lou Y, He Z. The rice hydroperoxide lyasefunctions in defense responses by modulating the oxylipin pathway[J]., 2012, 71(5): 763-775.

[31] Chen X, Hao L, Pan J, Zheng X, Jiang G, Jin Y, Gu Z, Qian Q, Zhai W, Ma B., a cell death and defense-related gene, encodes a putative splicing factor 3b subunit 3 () in rice[J]., 2012, 30(2): 939-949.

[32] Takahashi A, Agrawal G K, Yamazaki M, Onosato K, Miyao A, Kawasaki T, Shimamoto K, Hirochika H. Ricenegatively regulates-dependent defense responses [J]., 2007, 19(9): 2940-2951.

[33] 王建軍, 朱旭東, 王林友, 張利華, 薛慶中, 何祖華. 水稻類(lèi)病斑突變體的生理與遺傳分析[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2004(3): 331-338.

Wang J J, Zhu X D, Wang L Y, Zhang L H, Xue Q Z, He Z H. Physiological and genetic analysis of the disease-like mutant of rice[J]., 2004(3): 331-338. (in Chinese with English abstract)

[34] Yoshimura A, Ideta O, Iwata N. Linkage map of phenotype and RFLP markers in rice[J]., 1997, 35(1-2): 49-60.

[35] 錢(qián)婧雅, 劉芬, 屈成, 王悅. 水稻類(lèi)病斑突變基因的克隆及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2021, 19(10): 3274-3280.

Qian J Y, Liu F, Qu C, Wang Y. Research progress on cloning and mechanism of rice lesion mimic genes[J]., 2021, 19(10): 3274-3280. (in Chinese with English abstract)

[36] 陳萍萍, 葉勝海, 趙寧春, 陸艷婷, 劉合芹, 楊玲, 金慶生, 張小明. 浙粳22類(lèi)病斑突變體特征及其基因定位[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2010, 24(1): 1-6.

Chen P P, Ye H S, Zhao N C, Lu Y T, Liu H Q, Yang L, Jin Q S, Zhang X M. Characteristics and genetic mapping of a lesion mimic mutantin japonica rice variety Zhejing 22[J]., 2010, 24(1): 1-6. (in Chinese with English abstract)

[37] Lin A, Wang Y, Tang J, Xue P, Li C, Liu L, Hu B, Yang F, Chu C. Nitric oxide and protein S-nitrosylation are integral to hydrogen peroxide-induced leaf cell death in rice [J]., 2012, 158(1): 451-464.

[38] Fang C, Li L, Zhang P, Wang D, Yang L, Reza B M, Lin W.modulates the antioxidant capacity of rice and protects against ultraviolet-B radiation[J]., 2019, 278: 96-106.

[39] 曾仁杰. 硅肥對(duì)水稻產(chǎn)量、品質(zhì)及抗倒伏特性的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2021, 37(22): 1-4.

Zeng R J. Effect of silicon fertilizer on rice yield, grain quality and lodging resistance[J]., 2021, 37(22): 1-4. (in Chinese with English abstract)

[40] 張文緒. 稻屬植物葉背亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察研究[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 1995(2): 71-76.

Zhang W X. The observation of submicrostructure on leaves-back in[J]., 1995(2): 71-76. (in Chinese with English abstract)

[41] 張文緒, 裴鑫德. 水稻稃面雙峰乳突的研究[J]. 作物學(xué)報(bào), 1998(6): 691-697.

Zhang W X, Pei X D. Study of double-peaked papillae on the lemma side of rice[J]., 1998(6): 691-697. (in Chinese with English abstract)

[42] 張良平, 陳良碧, 沈曉勤. 水稻葉片表面結(jié)構(gòu)電鏡觀察 [J]. 電子顯微學(xué)報(bào), 1990(3): 43.

Zhang L P, Chen L B, Shen X Q. Electron microscopic observation of the surface structure of rice leaves[J]., 1990(3): 43. (in Chinese with English abstract)

[43] 周少凡, 黎根, 彭紫登, 楊文廣, 鄒志云, 楊秉耀, 何波仔, 黃琫. 水稻施硅之抗蟲(chóng)機(jī)制的研究 [J]. 電子顯微學(xué)報(bào), 1993(3): 247-250.

Zhou S F, Li G, Peng Z D, Yang W G, Zou Z Y, Yang B Y, He B Z, Huang B. Studies on insect-resistance mechanism after silicon applied in rice[J]., 1993(3): 247-250. (in Chinese with English abstract)

[44] 水茂興, 陳德富, 秦遂初, 蔣式洪. 水稻新嫩組織的硅質(zhì)化及其與稻瘟病抗性的關(guān)系[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 1999(4): 352-358.

Shui M X, Chen D F, Qin S C, Jiang S H. The silicification of young tissues of rice and relationship with its resistance to blast of rice[J]., 1999(4): 352-358. (in Chinese with English abstract)

Characterization and Gene Mapping of a Glume Lesion Mimic Mutantin Rice

XU Huan1,#, ZHOU Tao2,#, SUN Yue1, WANG Mumei3, YANG Yachun2, MA Hui2, LI Hao2, XU Dawei1, ZHOU Hai3, YANG Jianbo2, NI Jinlong2,*

(College of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230001, China; College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; These authors contributed equally to this paper; Corresponding author, email: jlni09@163.com)

【Objective】The aim of this study is to identify and map the glume lesion mimics mutant genein rice, and to lay a foundation for gene cloning and molecular mechanism research. 【Method】Agronomic traits analysis, scanning electron microscopy observation, DAB staining, and total silicon content determination were performed on the wild-type material LR005 and the glume lesion mimics mutantobtained through EMS mutagenesis. The F2population derived fromand L422 was used for genetic analysis, and gene mapping by map-based cloning and BSA-seq method. 【Result】The mutant gradually showed brown spots on the glumes and leaves 10 days after heading, and the glumes were completely brown at mature stage. Compared with the wild type, the mutant showed highly significant reductions in plant height, panicle length, total number of grains per panicle, seed setting rate and 1000-grain weight. DAB staining showed that theglumes and leaves had increased ROS(reactive oxygen species) content; Scanning electron microscopy observation showed that the siliceous cells on the surface of the mutant glumes and leaveswrinkled. The genetic analysis showed that the glume lesion mimics phenotype ofwas controlled by a pair of recessive genes. Using the F2segregating population ofand L422,was localized to a 68-kb interval containing 10 genes on chromosome 2 by map-based cloning and BSA-seq. Sequence analysis revealed only one SNP in this interval, which located in the fifth exon of the gene(LOC_Os02g51110), resulting in a substitution of Ile with Thr. The reduced accumulation ofsilicon was found by measuring total silicon content of the glumes and leaves, suggesting thatmay be a mutant allele of. 【Conclusion】is a new mutant allele of, which causes a reduction in silicon content and accumulation of reactive oxygen species in plants, resulting in brownspots on glumes and leaves.

rice; mutant; lesion mimic; silicon transporters; gene mapping

10.16819/j.1001-7216.2023.221201

2022-12-05；

2023-01-31。

安徽省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(202104g01020013, 202104b11020008); 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計(jì)劃資助項(xiàng)目（QNYC2019, QNYC2022）；水稻遺傳育種安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（SDKF-2021-02）。