周 佳，孫志鵬，吉宇丹，呂偉華，曹頂臣，魯翠云，劉天奇，鄭先虎

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

生長激素釋放激素(growth hormone releasing hormone，ghrh)是由下丘腦神經(jīng)元分泌的一種多肽類激素，是目前已知促進(jìn)生長激素合成和分泌的主要激素之一，在脊椎動物的生長、代謝、繁殖、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程發(fā)揮著重要作用[1-3]。有研究表明向動物體內(nèi)注射ghrh或ghrh類似物，可以加快其生長速率，提高生產(chǎn)性能[4]。近些年，國內(nèi)外學(xué)者對水產(chǎn)動物進(jìn)行了ghrh基因表達(dá)特征的研究，結(jié)果表明，該基因在各組織的調(diào)控模式因物種的不同而存在差異，但ghrh基因一般在腦中高表達(dá)[5-8]，其基因表達(dá)量的高低影響著魚類生長的快慢[9-10]。此外，ghrh基因水平變化也受溫度[11]、性別[12]、外源激素[13]、光譜[14]等因素的調(diào)控，進(jìn)而影響魚類的生長性能。

梭鱸(Sanderlucioperca)屬于鱸形目(Perciformes)鱸科(Percidae)梭鱸屬(Sander)，在國外主要分布于黑海、咸海、里海及波羅的水系，中國則主要分布于新疆的伊犁河、額爾齊斯河和黑龍江水系。梭鱸具有營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)優(yōu)良、抗病力強(qiáng)、生長速度快等特點(diǎn)，是我國重要的淡水名優(yōu)養(yǎng)殖魚類[15]。近幾年，國內(nèi)外對梭鱸的研究主要在群體遺傳多樣性[16]、增養(yǎng)殖[17]、飼料與營養(yǎng)[18-19]、病害[20]等方面。但關(guān)于梭鱸生長性狀遺傳研究的文章較少，韓曉飛[21]驗(yàn)證了8個微衛(wèi)星位點(diǎn)與梭鱸生長性狀呈顯著相關(guān)；TENG等[22]克隆了胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅱ(insulin-like growth factors，IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ)和生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)基因，并在IGF-Ⅱ中獲得1個與體重顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)。由于未經(jīng)過系統(tǒng)選育，梭鱸養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)個體大小差異顯著，導(dǎo)致出塘規(guī)格懸殊，一定程度上影響了梭鱸養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，開展梭鱸生長性狀調(diào)控機(jī)制及遺傳改良研究具有重要的實(shí)踐意義。本研究以生長軸ghrh基因入手，克隆獲得了ghrh基因cDNA全長序列并分析了序列特征，研究了其在梭鱸各組織的表達(dá)分布，分析了其表達(dá)量與梭鱸生長之間的相關(guān)性，旨在為梭鱸生長性狀的分子選育研究提供候選基因資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)梭鱸取自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)場，選取同池塘養(yǎng)殖條件下的5尾1齡魚，體質(zhì)量為210～240 g，取心、肝、脾、腦、垂體、肌肉、腸、胃、皮膚、鰓組織，置于液氮中速凍保存。隨機(jī)選取同批次繁殖、同池塘養(yǎng)殖環(huán)境下5月齡梭鱸500尾，挑選體質(zhì)量極大和極小個體各10尾，極小組[體長(98.42±3.81)mm，體質(zhì)量(8.28±1.12)g]和極大組[體長(171.6±10.6)mm，體質(zhì)量(49.36±7.61)g]，將取得的組織(腦、肌肉、肝)置于液氮中冷凍保存?？俁NA提取按照ThermoFisher公司提供的TRIzol Reagent試劑盒說明書進(jìn)行操作；利用NanoDropTM 8000分光光度計(jì)和1.2%的瓊脂糖電泳對RNA樣品進(jìn)行濃度和純度檢測。

1.2 基因克隆

以腦RNA為模板，根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈(Takara，日本)。參照GenBank中已登錄的親緣關(guān)系較近的硬骨魚類ghrh基因序列，選擇保守區(qū)域和NCBI中發(fā)布的梭鱸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號：XM_036002601)進(jìn)行序列比對，獲得梭鱸ghrh基因的部分cDNA序列并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行序列驗(yàn)證(表1)。根據(jù)已獲得梭鱸ghrh基因的保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增引物(表1)，按照SMARTer?RACE5′/3′試劑盒(Takara，日本)說明書構(gòu)建RACE文庫，SeqAmpTM DNA Polymerase(Takara，日本)試劑盒進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。RACE第一輪：反應(yīng)體系為10 μL，5′-GSP或3′-GSP 1 μL，10×UPM 1.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 0.2 μL，2×SeqAmp Buffer 5.0 μL，PCR-Grade H2O 3.1 μL，模板0.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，30 s；72 ℃，2 min；5 cycles。94 ℃，30 s；70 ℃，30 s；72 ℃，2 min；5 cycles。94 ℃，30 s；68 ℃，30 s；72 ℃，2 min；25 cycles。RACE第二輪：取第一輪產(chǎn)物5.0 μL加入245.0 μL EDTA Buffer稀釋，作為二輪反應(yīng)模板。反應(yīng)體系為50.0 μL：SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，PCR-Grade H2O 19.5 μL，UPMs 1.0 μL，nGSP1.0 μL，模板為2.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，30 s；68 ℃，30 s；72 ℃ 2 min；25 cycles。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence in this study

PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對目的條帶切膠后按照瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化目的產(chǎn)物(康為世紀(jì)，上海)，將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMDTM19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂板，篩選陽性克隆送到蘇州金唯智生物科技有限公司完成測序。將測序結(jié)果使用BLAST(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對，DNAMAN軟件分析，Staden 1.7軟件進(jìn)行拼接，最終獲得ghrh基因的全長cDNA序列。

1.3 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用DNAMAN軟件查找基因的開放閱讀框；使用在線軟件ExPASy-Protparam Tool(https：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白理化性質(zhì)；TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件預(yù)測蛋白質(zhì)是否跨膜；Signalp-4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽；Simple Modular Architecture Research Tool(http：//smart.embl-heidelberg.de/smart)工具預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域特征；SOMAP(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對分析；利用MEG-A 7.0和Clustal 2.1軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，B-ootsrap(1 000次)得出各分支置信度。

1.4 基因表達(dá)特征分析

2 結(jié)果與分析

2.1 ghrh基因的克隆和序列分析

梭鱸ghrh基因cDNA全長為1 100 bp(GenBank登錄號：MZ313192)，5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)和3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)序列分別為494 bp和180 bp，開放閱讀框?yàn)?26 bp，編碼141個氨基酸，帶有典型的多聚腺苷酸化信號序列(ATTAAA)和多聚ploy(A)尾巴(圖1)；推導(dǎo)的ghrh蛋白質(zhì)分子式為C701H1139N211O213S7，分子質(zhì)量16.15 kDa，理論P(yáng)I值為9.82，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)和親水系數(shù)分別為46.34、-0.637，是不穩(wěn)定且親水性蛋白質(zhì)；該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于胞外分泌蛋白；ghrh氨基酸序列N端含有1個18個氨基酸組成的信號肽序列(1～18 aa)和一個GLUCA保守結(jié)構(gòu)域(65～91 aa)(圖1)；梭鱸ghrh蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)由α螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，α螺旋占比44.68%，無規(guī)則卷曲占比47.52%，延伸鏈占比7.8%(圖2)。

圖1 梭鱸ghrh 基因cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence of S.lucioperca ghrh gene and deduced amino acid sequence下劃線表示ghrh前體蛋白信號肽，灰色陰影為GLUCA結(jié)構(gòu)域；黃色陰影表示加尾信號，“*”表示終止密碼子。

圖2 梭鱸ghrh蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 The second structure of S.lucioperca ghrh protein藍(lán)色：α螺旋，紅色：延伸鏈；黃色：無規(guī)則卷曲。

2.2 ghrh氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

梭鱸ghrh同其他脊椎動物ghrh氨基酸序列比對結(jié)果顯示，梭鱸與同為鱸科魚類的河鱸、黃金鱸同源性最高，相似性分別為95.04%、94.33%，親緣關(guān)系較近，同模式生物斑馬魚(Daniorerio)、小鼠(Musmusculus)的相似性分別為74%、41.54%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且N端均有一個保守的結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖3 梭鱸ghrh與其他物種氨基酸序列的同源性多重比較Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of S.lucioperca ghrh with the corresponding sequence from other species序列中相同氨基酸殘基用黑色背景表示，同源性超過75%用粉紅色背景表示，同源性超過50% 用淺藍(lán)色背景表示。

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，可分為魚類、哺乳類兩大支，其中梭鱸先與同為鱸科魚類的黃金鱸(Percaflavescens)、河鱸(P.fluviatilis)聚為一小支，后與橙胸鏢鱸(Etheostomaspectabile)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)等鱸形目聚為一個分支，最后與鮭形目的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和大西洋鮭(Salmosalar)、鯉形目的斑馬魚和鯉魚(Cyprinuscarpio)聚為一大支，而小鼠和人(Homosapiens)等哺乳動物則聚為另一大支(圖4)。

圖4 不同物種間ghrh蛋白序列N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 N-J phylogenetic tree of ghrh protein sequence in different species

2.3 ghrh基因組DNA序列結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫梭鱸ghrh基因組序列可知，ghrh基因組DNA全長4 279 bp(GenBank登錄號：116037223)。通過比較研究斑馬魚、小鼠和人的基因組DNA結(jié)構(gòu)，結(jié)合已克隆獲得的ghrh基因CDS區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)梭鱸ghrh基因組包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，而斑馬魚、人和小鼠有4個外顯子和3個內(nèi)含子。斑馬魚、小鼠和人的ghrh基因組長度分別是梭鱸的21倍、4.5倍和2.5倍(圖5)。梭鱸ghrh基因外顯子長度分別77、105、105、126、13 bp，內(nèi)含子分別為740、528、115、134 bp。

圖5 ghrh基因組結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Genomic organization of ghrh

2.4 ghrh基因在不同組織中表達(dá)特征分析

本研究采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測了ghrh基因在梭鱸10個組織中的表達(dá)情況。ghrh基因在所有檢測組織中均有表達(dá)，表達(dá)量從高到低依次是腦、垂體、鰓、脾、胃、肝、腸、心、皮膚、肌肉。腦和垂體中的表達(dá)量顯著高于其他組織且差異顯著。皮膚和肌肉中表達(dá)量相當(dāng)，差異不顯著(圖6)。

圖6 ghrh基因在梭鱸各組織的表達(dá)特征Fig.6 The expression of ghrh in different tissues of S.lucioperca.小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。以肌肉為參考樣本，

2.5 ghrh基因在生長差異個體間表達(dá)分析

通過對梭鱸極端個體體長、體質(zhì)量等生長數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，顯示梭鱸極大組個體的體長、體質(zhì)量均極顯著高于極小組(圖7)；采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對比分析了ghrh基因在梭鱸生長極端差異兩組間的腦、肝和肌肉組織中表達(dá)情況，結(jié)果表明ghrh基因表達(dá)量均為極大組高于極小組，與生長性狀差異比較結(jié)果相符；其中該基因在腦組織中的表達(dá)量為極大組顯著高于極小組，但在肝、肌肉組織中差異不顯著(圖8)。

圖7 梭鱸大小個體間生長性狀比較分析Fig.7 Analysis of extreme individual growth traits of S.lucioperca**：極顯著性差異(P<0.

圖8 ghrh 基因在梭鱸大小個體間的差異表達(dá)分析Fig.8 The different expression level of ghrh in extreme individuals of S.lucioperca.*：顯著性差異(P<0.05)；ns：無顯著差異。以極大組肝為參考樣本，

3 討論

3.1 ghrh基因序列特征的生物信息學(xué)分析

ghrh最主要的生物學(xué)功能是促進(jìn)垂體中生長激素的合成和釋放[23]。本研究中梭鱸ghrh基因N端存在一個保守的GLUCA結(jié)構(gòu)域(65～91aa)，具有典型的胰高血糖素類似激素的特征，該結(jié)構(gòu)域是發(fā)揮生物學(xué)活性的重要位點(diǎn)。多重氨基酸序列比對結(jié)果顯示，哺乳動物和魚類都存在GLUCA結(jié)構(gòu)域，這表明該結(jié)構(gòu)域在不同物種間具有高度保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，梭鱸ghrh的氨基酸序列在進(jìn)化上與同為鱸科魚類的黃金鱸、河鱸親緣關(guān)系最近且聚為一支，這表明該基因在進(jìn)化的過程中較為保守；而其他的鯉形目、鮭形目、哺乳動物各聚為一支，推測與它們核苷酸變異大且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)有關(guān)[24]。這與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類較為一致，該發(fā)育系統(tǒng)進(jìn)化樹較真實(shí)地反映了該物種進(jìn)化的關(guān)系?；蚪Y(jié)構(gòu)比較分析顯示，梭鱸ghrh基因有5個外顯子和4個內(nèi)含子，這與大口黑鱸(Micropterussalmoides)[25]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[26]的外顯子和內(nèi)含子數(shù)目一致。斑馬魚、人和小鼠有4個外顯子和3個內(nèi)含子，這與梭鱸外顯子數(shù)目不一致，這表明ghrh基因結(jié)構(gòu)組成具有物種特異性，可能與物種進(jìn)化速率不同有關(guān)。

3.2 ghrh基因在不同組織中的表達(dá)分析

ghrh基因作為生長軸上的關(guān)鍵生長調(diào)控因子，其在組織中的分布已有一些在不同物種間的研究。如在哺乳動物中，ghrh基因主要在下丘腦和大腦中高表達(dá)，在后腦中低表達(dá)[27]。金魚(Carassiusauratus)[28]、大口黑鱸[25]中g(shù)hrh表達(dá)模式與哺乳動物相似，主要在大腦中高表達(dá)。這與本研究中梭鱸ghrh在腦中表達(dá)水平最高的結(jié)果一致，這表明ghrh對魚類神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)有重要調(diào)節(jié)作用。除腦以外，ghrh基因在梭鱸的垂體、心、肝、肌肉、皮膚、鰓、腸等其他組織中均有表達(dá)且具有組織表達(dá)差異性，而布氏鯧鲹(Trachinotusblochii)[5]、大刺鰍(Mastacembelusarmatus)[6]、露斯塔野鯪(Labeorohita)[29]等魚類在腦、肌肉、肝、鰓等少數(shù)組織中有表達(dá)，可能是物種間的差異導(dǎo)致表達(dá)模式不同。本研究ghrh基因在梭鱸垂體中表達(dá)量較高，然而在點(diǎn)帶石斑魚[8]垂體中不表達(dá)，本研究結(jié)果與這不一致，推測本研究一齡梭鱸正處于生長旺盛時期，需通過垂體中g(shù)hrh表達(dá)產(chǎn)物刺激垂體釋放大量的gh來維持魚類的生長需要。本研究中梭鱸ghrh基因在鰓中表達(dá)量也較高，這與牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]的研究結(jié)果一致，推測ghrh基因可能通過參與滲透壓調(diào)節(jié)等生理功能從而調(diào)控魚類生長，具體機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

3.3 ghrh基因在生長差異個體間表達(dá)分析

魚類的生長主要依賴體內(nèi)的生長激素，而生長激素的產(chǎn)生受下丘腦分泌的ghrh影響，研究表明注射外源ghrh6 h后可顯著提高大刺鰍垂體中g(shù)h的表達(dá)水平，ghrh對魚類生長發(fā)育起正向調(diào)控作用[6]。RAM等[9]研究發(fā)現(xiàn)極大組鯰(Clariasmagur)腦中g(shù)hrh基因表達(dá)量高于極小組，林明德等[10]研究發(fā)現(xiàn)快速生長的褐點(diǎn)石斑魚(E.fuscoguttatus)F1子代腦中g(shù)hrh基因表達(dá)量高于生長慢速的親本。這與本研究中梭鱸極大組腦中g(shù)hrh基因表達(dá)量顯著高于極小組的結(jié)果相一致(P<0.05)，推測ghrh通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)影響魚類的生長速度。與之相反的是，JI等[12]研究發(fā)現(xiàn)9～12月齡半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)在生長慢的雄魚腦中g(shù)hrh的表達(dá)量顯著高于生長快的雌魚(P<0.05)，JIANG等[30]研究發(fā)現(xiàn)金錢魚(Scatophagusargus)生長慢的雄魚下丘腦中g(shù)hrh基因表達(dá)量顯著高于生長快的雌魚(P<0.05)，這一結(jié)果的出現(xiàn)可能是gh的缺乏導(dǎo)致雄魚中產(chǎn)生負(fù)反饋而調(diào)節(jié)ghrh的高表達(dá)。以上研究說明了生長發(fā)育是復(fù)雜的生物學(xué)過程，需要更多相關(guān)基因共同的調(diào)節(jié)。

肝是促進(jìn)魚類生長重要的靶器官，ghrh通過刺激垂體釋放gh，gh通過與肝細(xì)胞表面生長激素受體結(jié)合，直接促進(jìn)細(xì)胞生長，或通過啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制誘導(dǎo)igfs表達(dá)間接促進(jìn)組織細(xì)胞生長，進(jìn)而促進(jìn)魚類生長[23]。RAM等[31]研究發(fā)現(xiàn)極大組鯰魚肝中g(shù)hrh基因表達(dá)量高于極小組，這與本研究中梭鱸極大組肝中g(shù)hrh基因表達(dá)量顯著高于極小組的結(jié)果相一致，這表明肝中g(shù)hrh的表達(dá)水平也可影響魚類的生長速度。魚類的生長主要依賴肌肉質(zhì)量的增加，ghrh基因可以促進(jìn)肌肉組織的增殖與分化，從而促進(jìn)動物自身的生長與發(fā)育。戴建威等[31]研究發(fā)現(xiàn)將慢病毒載體介導(dǎo)的ghrh基因注射到小鼠肌肉組織，促進(jìn)體內(nèi)gh釋放，小鼠的日增重得到了顯著性的提高。在本研究中，ghrh基因在極大組肌肉組織中的表達(dá)量要顯著高于極小組，這表明ghrh基因在梭鱸肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。綜上所述，梭鱸極端個體間各組織ghrh基因表達(dá)水平與梭鱸的生長性狀呈正相關(guān)，ghrh對梭鱸的生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用。因此，ghrh基因在梭鱸的分子育種中可作為生長性狀研究的候選基因進(jìn)行應(yīng)用。