靳洪振，王玲玲，2，3，吳亞鑫，彭康堯，袁漢文，2，3，雷連成，4，張付賢，2，3

(1.長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434023；2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434023；3.澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北荊州 434023；4.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)俗稱“黃辣丁”、“黃姑子”，為鲿科(Bagridae)黃顙魚屬(Pelteobagrus)，是中國特色淡水魚類。2020年黃顙魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量為5.655×105t，在特色魚類中產(chǎn)量排名第二。黃顙魚肉質(zhì)滑嫩、刺少味美、營養(yǎng)價(jià)值高、深受廣大消費(fèi)者喜愛，是人們餐桌上的不可或缺的佳肴。但隨著黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，特別是養(yǎng)殖規(guī)模及密度不斷增加，導(dǎo)致水產(chǎn)病害頻發(fā)；再加上抗生素的不規(guī)范使用，黃顙魚的病害問題越發(fā)嚴(yán)重，其中以細(xì)菌病最為突出。比較常見的黃顙魚致病菌有遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda，Et)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等[1，2]。

遲緩愛德華氏菌屬于腸桿菌科，無莢膜、無芽孢、有運(yùn)動(dòng)力的革蘭氏陰性菌，其在動(dòng)物體內(nèi)、海洋、湖泊、河流、泥土中廣泛存在，是一種人-魚共患的條件致病菌[3，4]。遲緩愛德華氏菌宿主范圍廣，可引起鳥類、爬行類、魚類、兩棲類感染和人類胃腸道癥狀。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，遲緩愛德華氏菌已經(jīng)成為引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的重要病原菌。研究發(fā)現(xiàn)，該菌可感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，如大口黑鱸(Micropterussalmoides)、羅非魚(Oreochromismossambicus)、龜(Mauremysreevesii)、牛蛙(Lithobatescatesbeiana)、鱖(Sinipercachuatsi)、黃鱔(Monopterusalbus)等[5]。魚類感染遲緩愛德華氏菌的主要癥狀表現(xiàn)為：腹部腫脹，并有腹水；肝臟、腎臟腫大，體表、鰭基和頭部皮膚有出血、潰爛現(xiàn)象。近年來，黃顙魚感染遲緩愛德華氏菌多次發(fā)生，傳染性強(qiáng)，死亡率高，給黃顙魚養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

為查明2021年8月湖北荊州一養(yǎng)殖基地黃顙魚出現(xiàn)爛身、腹水等癥狀的病原，本研究從患病黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟等組織中分離純化出致病菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、生理生化特性、16S rRNA基因序列分析鑒定分離菌株為遲緩愛德華氏菌，通過致病性分析和篩選對致病菌有抑制效果的抗菌藥物和中藥，為遲緩愛德華氏菌致病機(jī)理的研究和黃顙魚病害的防控提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2021年8月采集湖北荊州某養(yǎng)殖基地出現(xiàn)魚體潰爛、腹腔腫大等臨床癥狀的發(fā)病黃顙魚，體質(zhì)量在100 g左右。人工感染實(shí)驗(yàn)材料為湖北省荊門市某黃顙魚養(yǎng)殖場健康黃顙魚，體質(zhì)量100～110 g，經(jīng)7 d暫養(yǎng)觀察，特定病原檢測為陰性的黃顙魚用于實(shí)驗(yàn)。

主要試劑：革蘭氏染色劑、瓊脂均購自北京索萊寶生物科技有限公司；Labselect純醫(yī)用級聚苯乙烯96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購自北京蘭杰柯科技有限公司；Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片、空白藥敏紙片、細(xì)菌微量生化管購自杭州微生物試劑有限公司；2×PCR Mix酶、DL2000 DNA Marker購自北京聚合美生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物合成及測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

檢查記錄患病黃顙魚的外觀癥狀，用75%的酒精擦拭病魚體表進(jìn)行消毒；在無菌條件下解剖病魚，觀察其內(nèi)部組織器官病變情況；取病變組織肝、腎、脾、腸和腹水至無菌1.5 mL EP管內(nèi)，充分研磨后，添加適量PBS溶液充分混勻。使用組織研磨液劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h。隨機(jī)挑取單個(gè)優(yōu)勢菌落純化培養(yǎng)，革蘭氏染色后使用光學(xué)顯微鏡鏡檢。

1.3 病原檢測

使用無菌剪刀和鑷子取患病黃顙魚病變組織(約200 mg)放入無酶的1.5 mL的EP管中進(jìn)行研磨，使用病毒DNA和RNA基因組提取試劑盒提取基因組作為病毒檢測的模板；以恒溫培養(yǎng)24 h后長出的單菌落為檢測細(xì)菌的模板。以嗜水氣單胞菌OmpA基因(登錄號(hào)：NZ.CP050851.1)設(shè)計(jì)特異性引物，參考文獻(xiàn)[7-14]合成遲緩愛德華氏菌、溫和氣單胞菌和草魚呼腸孤病毒等病原的引物序列(表1)，反應(yīng)體系(20 μL)：模板1 μL、2×PCR mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 7 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，恒壓120 V電泳25 min。

表1 患病黃顙魚病原檢測引物信息Tab.1 Primer information for pathogen detection of diseased P.fulvidraco

以分離和提取病魚臟器的基因組DNA作為模板，使用特異性引物體系，通過PCR檢測遲緩愛德華氏菌在黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟、腸道和腹水中的分布情況。

1.4 生理生化鑒定

挑取分離菌株的單菌落接入5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min的搖床過夜培養(yǎng)16 h；取10 μL菌液加入細(xì)菌微量生化管中，28 ℃培養(yǎng)24 h或48 h后進(jìn)行生理生化分析；將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用接種環(huán)挑取單菌落，涂在試紙上，在30 s之內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)紫色為強(qiáng)陽性，2 min內(nèi)不變色為陰性。

1.5 測序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹

1.5.1 16S rRNA鑒定

取分離菌株的純培養(yǎng)物提取基因組作為模板，以通用引物27-F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系如下：模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用25 μL產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司武漢測序部進(jìn)行測序；測序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行序列同源性比對分析。

1.5.2 系統(tǒng)發(fā)育樹建立

將測序得到的菌株的16S rRNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，選取腸桿菌科同源性較高以及其他的愛德華氏菌屬的水產(chǎn)病原菌，如殺魚愛德華氏菌EIB202、鰻魚愛德華氏菌和人源遲緩愛德華氏菌作為內(nèi)群；再選取克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬和沙門氏菌屬作為外群，利用MEGA11.0軟件進(jìn)行多序列比對，Neighbor-joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并且取1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.6 毒力基因檢測

參考SRINIVASA等[15]遲緩愛德華氏菌的毒力基因報(bào)道，合成遲緩愛德華氏菌的4個(gè)主要毒力基因(esaV、katB、fimA和gadB)的引物(表2)，PCR分析遲緩愛德華氏菌分離株攜帶毒力基因情況。使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株Et-4的基因組作為模板，PCR反應(yīng)體系25 μL：模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、dd H2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

表2 遲緩愛德華氏菌毒力基因引物序列Tab.2 Primers sequences of virulence gene associated with E.tarda

1.7 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

分離菌株Et-4經(jīng)活化后，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)6 h，4 000 r/min離心5 min收集菌體，無菌PBS洗滌三次，PBS重懸菌體，采用平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)并測定菌液濃度[16，17]。

健康黃顙魚于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)一周，選取健康且不攜帶嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、草魚呼腸孤病毒、遲緩愛德華氏菌等特定病原體的黃顙魚用于人工感染實(shí)驗(yàn)。人工腹腔注射感染實(shí)驗(yàn)共設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對照組，每組12尾，注射0.3 mL，實(shí)驗(yàn)組每尾魚攻毒劑量分別為1.248×108、3.12×107、7.8×106、1.95×106CFU/g，對照組每尾魚接種0.3 mL無菌PBS。實(shí)驗(yàn)魚均隔離養(yǎng)殖在玻璃缸內(nèi)，加熱棒控制水溫為23 ℃，pH值6.8～7.5，溶氧大于5 mg/L，氨氮小于0.06 mg/L。每天進(jìn)行觀察，按魚體質(zhì)量0.5%的量每日投喂一次；連續(xù)觀察7 d，記錄感染后黃顙魚的發(fā)病癥狀與死亡情況，根據(jù)寇氏法[18]計(jì)算其半數(shù)致死劑量；比對人工感染死亡黃顙魚與自然感染死亡黃顙魚的臨床癥狀和病理變化，并對發(fā)病死亡的實(shí)驗(yàn)黃顙魚進(jìn)行病原菌的再次分離和鑒定。

1.8 生物被膜形成能力測定

活化后的分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)12 h；在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入 100 μL的LB培養(yǎng)基和1 μL的菌液，未接種菌液的空白培養(yǎng)基孔作為對照；28 ℃孵育 8～10 h后，吸棄 96 孔板內(nèi)液體，；加入甲醇固定25 min，并洗凈晾干；0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，洗凈晾干后加入冰醋酸溶解結(jié)晶紫，10 min后在550 nm處測定OD值；實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，判定分離菌株生物被膜形成能力[19，20]。

1.9 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

1.9.1 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)

將分離菌株Et-4用無菌生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛?，用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在MH固體培養(yǎng)基(Mueller-Hinton agar，MHA)上，采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法，將30種抗菌藥物紙片貼在培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量藥敏片的抑菌圈直徑，結(jié)果判斷參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[21]。

1.9.2 耐藥基因檢測

取分離菌株Et-4的純培養(yǎng)物提取基因組作為模板，合成耐藥基因的特異性引物[22，23](表3)，PCR檢測分離菌株Et-4攜帶耐藥基因情況。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL反應(yīng)產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，恒壓120 V電泳25 min。

表3 耐藥基因引物信息以及目標(biāo)產(chǎn)物大小Tab.3 Primer information and target product size of drug resistance genes

1.10 中藥藥敏實(shí)驗(yàn)

選取42種中藥：黃芩、紫蘇子、獨(dú)活、麻黃、款冬花、桑皮、川貝母、天竹黃、大黃(熟)、白術(shù)、荊芥、半夏、黃連、僵蠶(炒)、白附子(炙)、茯苓、羌活、桔梗、明雄黃、朱砂、枳殼、連翹、板藍(lán)根、魚腥草、全蝎、野菊花、薄荷、五味子，金銀花，胖大海。五倍子、秦皮、石榴皮、首烏藤、肉桂、丁香、蒲公英、板藍(lán)根、地榆、檳榔、大青葉、烏梅[24-26]，體外實(shí)驗(yàn)分析其對分離菌株Et-4的抑制情況。

中藥藥液和藥敏片的制備：取中藥材2 g，加入40 mL水浸泡1 h后煎煮，沸騰后轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮2 h，用三層紗布過濾并收集濾液；過濾后的藥渣繼續(xù)加入40 mL水，按上述方法進(jìn)行煎煮過濾；兩次過濾的藥液濃縮為2 mL，最終濃度為1 g/mL；高壓滅菌后，放于4 ℃保存。取空白藥敏片，將濾紙片放入制備好中藥藥液中浸泡1 min，經(jīng)高壓滅菌后放入55～65 ℃烘箱內(nèi)烘干備用。

取200 μL菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，均勻貼上制備的中藥藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；測量抑菌圈大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌圈平均直徑，參照徐曉津[27]提供的抑菌標(biāo)準(zhǔn)判斷不同中藥的抑菌能力。

2 結(jié)果

2.1 病原鑒定

發(fā)病黃顙魚出現(xiàn)打圈、浮頭、爛身和腹部腫大等癥狀，剖檢可見腹腔內(nèi)積有大量腹水，肝臟、腎臟腫大，肝臟和腸道有出血。采集病變組織進(jìn)行PCR鑒定特定病原。PCR結(jié)果如圖1所示，嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、無乳鏈球菌、蛙屬虹彩病毒、草魚呼腸孤病毒、病毒性出血敗血癥病毒的引物均未擴(kuò)增出特異性條帶，結(jié)果為陰性；遲緩愛德華氏菌的引物擴(kuò)增出陽性條帶，表明黃顙魚疑似遲緩愛德華氏菌感染。

圖1 病原的PCR鑒定Fig.1 Identification of the pathogens by PCRM.DL 2000 DNA Marker；泳道2～9為陰性對照，11～18為陽性對照，20～27為檢測樣品；As.溫和氣單胞菌；Av.維氏氣單胞菌；Ah.嗜水氣單胞菌；Et.遲緩愛德華氏菌；GBS.無乳鏈球菌；VHSV.病毒性出血敗血癥病毒；RV.蛙屬虹彩病毒；GCRV.草魚呼腸孤病毒。

分別采集患病黃顙魚不同的病變組織并提取基因組，以遲緩愛德華氏菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，在患病黃顙魚的肝臟、腎臟和腹水中均能擴(kuò)增出遲緩愛德華氏菌特異的條帶，表明在黃顙魚的肝、腎和腹水中均存在遲緩愛德華氏菌。

圖2 分離菌株在組織中分布Fig.2 Detection of isolated strain in tissuesM.2000bp DNA Marker；1.陰性對照；2.陽性對照；3.肝；4.腎；5.脾；6.腸；7.腹水。

2.2 細(xì)菌分離與菌落形態(tài)

用患病黃顙魚的肝臟和腹水劃線接種LB固體平板，28 ℃培養(yǎng)24 h生成灰白色、濕潤有光澤、表面光滑的菌落；在光學(xué)顯微鏡下可見紅色、兩端鈍圓的短桿菌，為革蘭氏陰性桿菌(圖3)，與遲緩愛德華氏菌的形態(tài)特征一致。

圖3 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察Fig.3 Morphological observation of the isolated straina.培養(yǎng)基生長形態(tài)；b.革蘭氏染色鏡檢(100×)。

2.3 分離菌的生理生化鑒定

分離菌株的氧化酶實(shí)驗(yàn)呈陰性，可使葡萄糖產(chǎn)氣，MR、賴氨酸脫羧酶、硫化氫、麥芽糖、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖和靛基藍(lán)呈陽性，其余精氨酸雙水解酶等呈陰性(表4)。分離菌株的生理生化特性與伯杰氏細(xì)菌分類手冊中遲緩愛德華氏菌的生理生化特性一致。

表4 Et-4的生理生化鑒定結(jié)果Tab.4 Physiological and biochemical identification results of Et-4

2.4 16S rRNA序列分析

對分離菌株的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出的基因片段大小為1 443 bp；基因片段測序發(fā)現(xiàn)，分離菌株與遲緩愛德華氏菌ATCC23685(GenBank：GG739637.1)的同源性為99.79%；利用MEGA 11.0軟件進(jìn)行多序列比對，Neighbor-joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，結(jié)果如圖4所示，分離菌株與愛德華氏菌屬菌株聚為一支，與克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬和沙門氏菌屬較遠(yuǎn)。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判定分離菌株為遲緩愛德華氏菌，命名為Et-4。

圖4 基于分離菌株Et-4的16S rRNA的基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequences of isolated strain Et-4

2.5 分離菌株毒力基因分析

采用4種毒力基因的特異性引物對遲緩愛德華氏菌Et-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，在4種毒力基因目的條帶處均未出現(xiàn)清晰條帶(圖5)，表明遲緩愛德華氏菌分離株Et-4缺失上述4種毒力基因，其毒力基因型為esaV-fimA-gadB-katB-，初步判定其為弱毒株。

圖5 毒力基因檢測Fig.5 Detection of virulence genes of isolated strain Et-4M.DL 2000 DNA Marker；泳道2-5為陰性對照；泳道7-10為菌株Et-4。

2.6 人工感染實(shí)驗(yàn)

將分離菌株Et-4通過腹腔注射的方式感染健康黃顙魚，攻毒后患病魚出現(xiàn)明顯的食欲下降，游動(dòng)無力，反應(yīng)遲鈍；病魚體表粘液脫落，皮膚組織出現(xiàn)紅腫、出血和潰瘍；鰓蓋、鰭條基部充血，腹部腫大等臨床癥狀(圖6)，以1.248×108CFU/g組和3.12×107CFU/g組黃顙魚的臨床癥狀最為顯著。在攻毒后6 d，1.248×108CFU/g組和3.12×107CFU/g組黃顙魚全部死亡，7.8×106CFU/g組死亡8尾，1.95×106CFU/g組死亡4尾，PBS組死亡2尾(圖7)。剖檢病魚可見嚴(yán)重的腹水、肝臟和腎臟病變，PCR鑒定為遲緩愛德華氏菌感染，從肝臟、腎臟和腹水中分離出的優(yōu)勢菌群經(jīng)16S rRNA測序分析與攻毒菌株一致；PBS組病死魚未見明顯病變，也未檢出攻毒菌株。統(tǒng)計(jì)分離菌株Et-4對黃顙魚的半致死劑量為3.9×106CFU/g，結(jié)合毒力基因檢測結(jié)果進(jìn)一步確定分離株Et-4為esaV-fimA-gadB-katB-的弱毒株。

圖6 人工感染后黃顙魚患病癥狀Fig.6 Symptoms of P.fulvidraco after artificial infection1.頭部點(diǎn)狀出血；2.腹部腫大。

圖7 不同實(shí)驗(yàn)組黃顙魚的存活曲線Fig.7 Survival curve of P.fulvidraco in different experimental groups

2.7 生物被膜形成能力測定結(jié)果

分離菌株Et-4的生物被膜形成能力測定的OD550 nm值為0.409 7，而空白組OD550 nm值僅為0.075 0，表明遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力。

2.8 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

2.8.1 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對菌株Et-4進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，分離菌株Et-4對頭孢類藥物、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那、呋喃唑酮和多粘菌素B敏感；對米諾環(huán)素、氯霉素、頭孢哌酮中度敏感，對四環(huán)素類、青霉素類、萬古菌素、復(fù)方新諾明等13種藥物耐藥。藥敏結(jié)果表明，遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4為多重耐藥菌株。

表5 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Drug susceptibility test of isolated strain Et-4

2.8.2 Et-4耐藥基因結(jié)果

耐藥基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株Et-4攜帶耐藥基因tetA、sul1和aadA1(圖8)，表明分離菌株Et-4對四環(huán)素類、磺胺類和氨基糖苷類抗菌藥物有一定的耐藥性。

圖8 耐藥基因檢測Fig.8 Detection results of drug resistance gene of isolated strain Et-4M：2000 bp DNA Marker；2～4泳道：陰性對照；6～8泳道：Et-4。

2.9 中藥藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對菌株Et-4進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表6所示，Et-4對烏梅和丁香較為敏感，其次五倍子、生地榆、秦皮、蒲公英等中藥對菌株Et-4也有一定的抑菌效果。

3 討論

近年來，黃顙魚養(yǎng)殖中出現(xiàn)體表潰爛癥狀的臨床病例較多，主要由遲緩愛德華氏菌、擬態(tài)弧菌(V.miminus)、溫和氣單胞菌(A.sobria)和維氏氣單胞菌(A.veronii)等細(xì)菌感染引起[28，29]。本研究從患病黃顙魚組織中分離到的優(yōu)勢菌株經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定為遲緩愛德華氏菌，其主要存在于病魚肝臟、腎臟和腹水中，具有一定的組織嗜性；自然發(fā)病黃顙魚和人工感染黃顙魚觀察到的臨床癥狀與PANDEY等[30]、MURWANTOKO等[31]、YANG等[32]學(xué)者所報(bào)道的一致，并且均能從肝臟、腎臟和腹水中分離到攻毒菌，證實(shí)遲緩愛德華氏菌為湖北荊州某養(yǎng)殖基地黃顙魚身體潰爛、嚴(yán)重腹水的致病菌。胡兵等[33]分離的遲鈍愛德華氏菌導(dǎo)致黃顙魚頭部出現(xiàn)“頭穿孔”的典型臨床癥狀，與本研究分離毒株感染出現(xiàn)的臨床癥狀存在顯著差異，可能與分離毒株的分布區(qū)域以及致病性有關(guān)。因此，臨床上開展黃顙魚爛身病診治時(shí)，應(yīng)綜合考慮臨床癥狀、分子生物學(xué)檢測以及致病菌的毒力、耐藥性進(jìn)行針對性的治療。

經(jīng)鑒定遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4不攜帶四種主要的毒力基因：esaV、fimA、gadA1和katB，這與羅非魚源遲緩愛德華氏菌天然弱毒株的毒力基因譜型相似[34]。程俊茗等[35]分離的鯽源遲緩愛德華氏菌攜帶fimA、citC、gadB、mukF、katB、esrB和sodB等7個(gè)毒力基因，與本研究分離菌株的毒力基因攜帶情況顯著不同。人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4在低劑量感染時(shí)對黃顙魚沒有明顯的致病性；當(dāng)攻毒劑量增加至1.95×106CFU/g時(shí)，黃顙魚出現(xiàn)爛身、腹水等癥狀；統(tǒng)計(jì)分離株Et-4對黃顙魚的半致死劑量為3.9×106CFU/g，綜合其毒力基因型確定遲緩愛德華氏菌分離株Et-4為弱毒株。

本研究通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4對四環(huán)素類、青霉素類、萬古菌素、磺胺類的復(fù)方新諾明等13種藥物耐藥，是一株多重耐藥菌；篩查耐藥基因發(fā)現(xiàn)，分離菌株Et-4攜帶耐藥基因tetA、sul1和aadA1，其對四環(huán)素類藥物的耐藥性可能與tetA基因有關(guān)，對磺胺類藥物的耐藥性可能與sul1基因有關(guān)，對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性可能與其攜帶的aadA1耐藥基因有關(guān)。在生物被膜形成能力方面，分離株Et-4具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，屬于易產(chǎn)生生物被膜的細(xì)菌，這與其在藥敏試驗(yàn)中呈現(xiàn)的多重耐藥結(jié)果相符。綜合分離菌株的生物被膜能力、耐藥基因、藥物敏感性和致病性，表明分離株Et-4為多重耐藥的弱毒株，這也在一定程度上解釋了生產(chǎn)上抗生素使用時(shí)效果不佳的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，中藥烏梅和丁香對分離株Et-4具有較好的抑菌效果。因此，在開展遲緩愛德華氏菌防治時(shí)，可考慮使用中藥烏梅、丁香、地榆和蒲公英的復(fù)方藥劑或單味中藥的有效成分。針對近年來黃顙魚的遲緩愛德華氏菌病多發(fā)的問題，養(yǎng)殖戶在生產(chǎn)上應(yīng)提升水質(zhì)，改善養(yǎng)殖環(huán)境；合理調(diào)配飼料，提高黃顙魚的基礎(chǔ)免疫力；充分考慮條件致病菌的耐藥性和致病性，結(jié)合敏感抗菌藥物和中藥進(jìn)行聯(lián)合用藥和精準(zhǔn)施治。本實(shí)驗(yàn)黃顙魚源的遲緩愛德華氏菌致病性和耐藥性研究結(jié)果，可為黃顙魚遲緩愛德華氏菌感染的防控提供理論依據(jù)。