張 煒,柯少瑞,趙紅宇,朱保玉

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院頜面外科 鄭州 450052 2)河南中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心 鄭州 450046

多形性腺瘤(pleomorphic adenoma,PA)發(fā)病率占涎腺良性腫瘤的70%以上,全切術(shù)后有2%～3%的復(fù)發(fā)率,復(fù)發(fā)后癌變風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[1-2]。癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adenoma,CPA)占涎腺惡性腫瘤的15%～20%,由PA惡變所致,其手術(shù)預(yù)后比其他類型涎腺腫瘤差[3-4]。因此盡早發(fā)現(xiàn)及控制PA復(fù)發(fā)與惡變十分關(guān)鍵。

研究[5-6]表明抑癌基因Kiss-1在正常組織中廣泛表達(dá),但在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)或缺失,Kiss-1及其相關(guān)產(chǎn)物能夠抑制腫瘤細(xì)胞浸潤、趨化和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)是參與破壞基底膜蛋白酶中最重要的一類,其中MMP-9與細(xì)胞外基質(zhì)的溶解及腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測正常腮腺、PA及CPA組織中Kiss-1與 MMP-9蛋白表達(dá)的變化,為進(jìn)一步探討CPA的發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2018年7月至2021年9月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的正常腮腺標(biāo)本 15 例,PA標(biāo)本30 例, CPA標(biāo)本45例;正常腮腺標(biāo)本來源于腮腺區(qū)非腫瘤性疾病及外傷切除組織。所有病例臨床資料完整,取材前無其他頭頸部腫瘤史且無放化療史,石蠟包埋組織完整。

1.2 主要試劑兔抗人Kiss-1 單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司,兔抗人MMP-9單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,其余試劑購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.3 不同組織中Kiss-1和MMP-9蛋白表達(dá)的檢測采用免疫組織化學(xué)染色法。取1.1中組織標(biāo)本,4 μm厚連續(xù)切片,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)100%、95%、80%、70%及50%乙醇梯度水化后進(jìn)行熱抗原修復(fù),冷卻至室溫后用體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫孵育5～10 min,PBS沖洗。滴加正常山羊血清以封閉非特異性抗原,滴加一抗(Kiss-1和MMP-9抗體質(zhì)量濃度分別為1 000 mg/L和500 mg/L),4 ℃冰箱過夜,滴加二抗稀釋液37 ℃反應(yīng)15 min,PBS沖洗,加 SP反應(yīng)15 min,DAB顯色,蘇木精輕度復(fù)染,脫水、透明、封片,拍照觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

Kiss-1和MMP-9蛋白陽性均為細(xì)胞質(zhì)黃色或棕褐色顆粒狀著色。選取10個(gè)高倍視野,每個(gè)視野均計(jì)數(shù)全部細(xì)胞。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定:陽性細(xì)胞百分比<5%計(jì)0分,5%～10%計(jì)1分,>10%～30%計(jì)2分,>30%計(jì)3分;不顯色或顯色不清計(jì)0分,淡黃色計(jì)1分,黃色/棕黃色計(jì)2分,褐色/棕褐色計(jì)3分;兩項(xiàng)評(píng)分相乘,0～1分為陰性,2～6分為陽性。

1.4 腫瘤侵襲性判斷主要根據(jù)CT和MRI檢查,同時(shí)根據(jù)術(shù)中所見、內(nèi)分泌學(xué)檢查、術(shù)后病理學(xué)檢查以及分子生物學(xué)行為等綜合判斷侵襲性[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法比較正常腮腺、PA及CPA組織及不同臨床病理特征的CPA組織中Kiss-1和MMP-9蛋白陽性表達(dá)率,用Spearman相關(guān)分析CPA組織中Kiss-1和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中Kiss-1和MMP-9蛋白的表達(dá)正常腮腺、PA和CPA組織中Kiss-1蛋白陽性表達(dá)率逐漸降低,而MMP-9蛋白陽性表達(dá)率逐漸升高,見圖1、表1。

表1 不同組織中Kiss-1和MMP-9蛋白的表達(dá) 例(%)

圖1 不同組織中Kiss-1和MMP-9蛋白的表達(dá)(SP, ×400)

2.2 CPA組織中Kiss-1和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析(表2)顯示CPA組織中Kiss-1和MMP-9蛋白的表達(dá)呈負(fù)關(guān)聯(lián)(rS=0.416,P=0.002)。

表2 CPA組織中Kiss-1和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性 例

2.3 不同臨床病理特征CPA患者Kiss-1、MMP-9蛋白表達(dá)的比較MMP-9蛋白表達(dá)與CPA患者的侵襲性、TNM分期有關(guān)。見表3。

表3 不同臨床病理特征CPA患者Kiss-1、MMP-9蛋白表達(dá)的比較 例(%)

3 討論

PA作為上皮源性的良性腫瘤,有別于一般良性腫瘤,表現(xiàn)出易復(fù)發(fā)、可惡變等交界性腫瘤的特點(diǎn)[1-2]。PA的發(fā)病和惡變機(jī)制尚未完全闡明,研究[8]認(rèn)為侵襲性和轉(zhuǎn)移性是PA發(fā)生、進(jìn)展及惡變的主要原因之一。

Kiss-1基因是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,在抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤性、運(yùn)動(dòng)性、化學(xué)趨向性和黏附性中具有重要作用,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān);正常組織中Kiss-1基因表達(dá)水平較高,但在腫瘤組織或已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中往往表達(dá)過低或缺失[5-6]。Singh等[9]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中Kiss-1 mRNA表達(dá)降低。Li等[10]發(fā)現(xiàn)Kiss-1不僅與胃癌的發(fā)生有關(guān),還與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),和正常腮腺組織相比,PA和CPA組織中Kiss-1陽性表達(dá)率降低,且CPA組織中最低,表明Kiss-1表達(dá)缺失或下降在PA的發(fā)生與惡變中可能發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

MMP-9以酶原形式造成基底膜缺失,在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用;胃癌組織中MMP-9表達(dá)顯著增加,對(duì)腫瘤的發(fā)生、浸潤轉(zhuǎn)移有一定的促進(jìn)作用[11]。本研究結(jié)果表明,MMP-9在正常腮腺、PA及CPA組織中表達(dá)逐漸升高,且MMP-9的表達(dá)與CPA的侵襲性、TNM分期有關(guān),說明MMP-9在CPA的浸潤、侵襲中起著重要作用。

研究[12]發(fā)現(xiàn)Kiss-1不僅能夠通過影響核因子κB的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而降低MMP-9的表達(dá),而且還可通過激活P38 MAPK激酶進(jìn)而抑制MMP-9表達(dá)。另有研究[9-10]顯示Kiss-1蛋白在卵巢癌和胃癌組織中表達(dá)降低,且Kiss-1與MMP-9的表達(dá)呈負(fù)關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示,CPA組織中Kiss-1和MMP-9蛋白表達(dá)呈負(fù)關(guān)聯(lián),二者可能共同參與了CPA的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

綜上所述,PA和CPA組織中Kiss-1蛋白表達(dá)減弱, MMP-9蛋白表達(dá)增強(qiáng);Kiss-1、MMP-9蛋白可能與CPA的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PA組織中Kiss-1蛋白低表達(dá)、MMP-9蛋白高表達(dá)提示了其潛在惡性轉(zhuǎn)化的可能。檢測Kiss-1和MMP-9蛋白的表達(dá)變化可能為PA的臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供一定的參考。