固定化脂肪酶對(duì)鄰苯二甲酸酯污染土壤的修復(fù)研究

孫建強(qiáng),田 露,張安平

(浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院,浙江 杭州 310014)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)因其增塑料效果好、生產(chǎn)成本低和易于加工等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、食品包裝、醫(yī)療器械、農(nóng)用薄膜的制造與生產(chǎn)中[1-2]。PAEs通常以物理方式與塑料產(chǎn)品結(jié)合,在制造、儲(chǔ)存和使用過(guò)程中,很容易釋放到空氣、水以及土壤等自然環(huán)境里[3]。PAEs已被證明是農(nóng)業(yè)土壤中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多的有機(jī)污染物[4],同時(shí)農(nóng)作物中也能檢測(cè)出PAEs,表明農(nóng)作物會(huì)從污染土壤中吸收PAEs,并通過(guò)食物鏈對(duì)人體健康構(gòu)成威脅[5]。此外,作為一種典型的內(nèi)分泌干擾物(EDC),PAEs及其代謝產(chǎn)物有生殖和發(fā)育毒性,PAEs長(zhǎng)期暴露會(huì)導(dǎo)致人類生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的功能障礙[6]。因此,如何有效去除環(huán)境中積累的PAEs已成為土壤修復(fù)的重點(diǎn)。

目前已有一些學(xué)者對(duì)土壤中PAEs的污染開展修復(fù)研究工作,主要應(yīng)用物理、化學(xué)和生物修復(fù)等技術(shù)來(lái)改變其特性以降低毒性和環(huán)境中的質(zhì)量濃度,其中生物修復(fù)法因其高效、安全和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是修復(fù)PAEs污染的主要技術(shù)[5]。微生物對(duì)PAEs的降解主要由多種酶和蛋白質(zhì)參與,其中加氧酶和水解酶起著關(guān)鍵作用[7]。脂肪酶可作為PAEs酯鍵的水解酶,在特定條件下提高對(duì)PAEs的降解[8],然而游離脂肪酶容易受pH和反應(yīng)溫度等環(huán)境條件影響,在實(shí)際應(yīng)用中很容易發(fā)生變性導(dǎo)致失活[9]。固定化技術(shù)作為一種實(shí)用且經(jīng)濟(jì)的綠色技術(shù),可以將酶附著到惰性、不溶材料上以保存酶的活性,提高酶的穩(wěn)定性和適應(yīng)性[10]。生物炭作為一種經(jīng)生物質(zhì)在限氧供應(yīng)下緩慢/快速熱解產(chǎn)生的富含芳香族碳的材料,表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性,具有高比表面積、孔隙度以及碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)豐富等優(yōu)點(diǎn),常被作為固定化酶的載體[11-12]。生物炭固定DnBP降解菌株T7,在6 h內(nèi)將DnBP的去除率從36.83%顯著提高到94.39%[13]。因此,研究制備固定化酶,對(duì)于提高降解酶的穩(wěn)定性和土壤中PAEs的去除率具有重要作用。筆者以鄰苯二甲酸二甲酯(Di-methy phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(Di-ethyl phthalate,DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Di-iso-butyl phthalate,DiBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(Di-n-butyl phthalate,DnBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)和鄰苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate,DnOP)這6種常見的PAEs作為目標(biāo)污染物,以商品化脂肪酶作為PAEs降解酶,以生物炭作為固定化載體探究固定化脂肪酶的最佳制備條件。同時(shí)進(jìn)一步探究不同環(huán)境條件對(duì)固定化脂肪酶去除土壤中PAEs的影響,為減少土壤PAEs污染問(wèn)題提供解決思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

三重四級(jí)桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(TQ-8040,日本Shimadzu公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司);氮吹儀(美國(guó)Organomation公司);超純水儀(美國(guó)密理博公司);分析天平(德國(guó)梅特勒-托利多公司);冷凍干燥機(jī)(山東博科生物);超聲波清洗器(SK3210HP,上?？茖?dǎo)超聲儀器);旋渦混勻儀(SK-1,常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

6種PAEs標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海阿拉丁公司;2種氘代物質(zhì)DnBP-d4和DEHP-d4購(gòu)自上海J&K百靈威公司;色譜純的正己烷、丙酮,分析純的無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4,分析純)、弗羅里硅土(60～100目)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

實(shí)驗(yàn)所用玉米秸稈生物炭由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,通過(guò)限氧控溫炭化法在500 ℃環(huán)境中熱解3 h制得玉米秸稈生物炭,其理化性質(zhì)如表1所示。脂肪酶(EC 3.1.1.3)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。所用土壤為天然荷塘泥土,經(jīng)陽(yáng)光暴曬后,挑選出大顆粒雜質(zhì)并過(guò)40目篩網(wǎng)備用,pH為7.69,密度為1.22 g/cm3,土壤有機(jī)質(zhì)為18.39 g/kg。

表1 玉米秸稈生物炭的理化性質(zhì)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固定化脂肪酶的制備、優(yōu)化及表征

在100 mL的三角瓶中加入20 mL溶于磷酸鹽緩沖液的脂肪酶溶液和2.0 g生物炭,攪拌均勻后將其振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間(轉(zhuǎn)速為120 r/min),之后用真空泵抽濾去除表面水分,并用磷酸鹽緩沖液對(duì)固定化脂肪酶表面進(jìn)行少量多次淋洗,在室溫條件下干燥后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。為了考察不同pH、反應(yīng)溫度、脂肪酶溶液質(zhì)量濃度以及固定化時(shí)間對(duì)酶活的影響,按照表2采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交組合實(shí)驗(yàn),確定獲得最佳固定化酶的制備條件,采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定固定化脂肪酶活性[14]。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM,Hitachi SU-8020)對(duì)生物炭和固定化脂肪酶樣品進(jìn)行表征分析,首先將樣品分別固定于電膠帶上,進(jìn)行噴金預(yù)處理,然后用10 kV加速電壓的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察拍照。

1.3.2 不同條件下固定化脂肪酶對(duì)PAEs降解效果實(shí)驗(yàn)

不同土壤pH對(duì)PAEs降解效果的影響:使用醋酸、氧化鈣和不同pH的磷酸鹽緩沖液將土壤pH分別調(diào)至5.5,6.5,7.5,8.5,干燥24 h后稱取10 g土壤放置40 mL玻璃離心管中,加入100 mg/L的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液50 μL[15]。待有機(jī)溶劑揮發(fā)干后,添加磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)至45%,在20 ℃黑暗環(huán)境中老化24 h后[16],向離心管中加入2%的固定化脂肪酶,旋渦混勻儀120 r/min搖動(dòng)10 min將土壤與固定化脂肪酶混合均勻,于30 ℃,120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 d后取出,向土壤中加入1 mL丙酮終止反應(yīng)。將玻璃離心管中的土壤冷凍干燥48 h,等待提取分析,每組處理設(shè)置3個(gè)平行樣。

不同反應(yīng)溫度對(duì)PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,將其分別置于10,20,30,40 ℃,120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 d后取出,其他操作同上。

不同固定化酶施加量對(duì)PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,分別加入1%,2%,5%(酶與土壤的質(zhì)量分?jǐn)?shù))固定化脂肪酶,其他操作同上。

不同土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)離心管內(nèi)水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)至30%,45%,60%,其他操作同上。

1.3.3 固定化脂肪酶對(duì)PAEs的降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在1.3.2節(jié)的最佳實(shí)驗(yàn)條件下施加固定化脂肪酶(IL)處理土壤中的PAEs,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(CK),分別在0,1,3,5,7,10,14 d取樣并測(cè)定PAEs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以PAEs剩余的質(zhì)量分?jǐn)?shù)C表示固定化脂肪酶對(duì)PAEs的影響,其計(jì)算式為

(1)

式中:C0為t=0時(shí)PAEs的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/kg;Ct為t時(shí)PAEs的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/kg。

1.3.4 土壤中PAEs的提取

每份凍干土壤樣品加入DnBP-d4、DEHP-d4以確定土壤中PAEs的回收率,按照V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶1的比例加入20 mL提取試劑,經(jīng)旋渦混勻儀(2 000 r/min,5 min)混合均勻后,靜置于黑暗處12 h以保證充分混合。將該混合物超聲(20 ℃,30 min),離心(2 500 r/min,8 min)以收集上清液,該步驟重復(fù)3次。將60 mL上清液混合在燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并用正己烷濃縮至2 mL。濃縮樣品用經(jīng)正己烷預(yù)處理的玻璃層析柱(填料自下而上為2.0 g無(wú)水硫酸鈉,10 g佛羅里硅土)純化。在2 mL棕色進(jìn)樣小瓶中用平穩(wěn)的氮?dú)獯祾呦疵撘?最后用正己烷定容至1 mL。在-20 ℃冰箱內(nèi)密封保存,等待GC-MS/MS進(jìn)樣分析。

1.4 儀器方法

使用SHIMADZU GC-MS/MS-TQ8040和SH-RXi-5SilMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱對(duì)6種PAEs進(jìn)行定量分析。樣品(1 μL)以不分流模式注入,載氣(高純氦氣)流速設(shè)定為1 mL/min,進(jìn)樣溫度設(shè)置為280 ℃,升溫程序:80 ℃保持1 min;10 ℃/min升溫至180 ℃并保持1 min;8 ℃/min升溫至260 ℃并保持1 min;10 ℃/min升溫至300 ℃并保持5 min。檢測(cè)器為電子轟擊離子源(EI源),質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定:傳輸線溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)PAEs進(jìn)行檢測(cè)分析,相關(guān)分析參數(shù)如表3所示。

表3 PAEs GC-MS/MS參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化脂肪酶的制備、優(yōu)化及表征

采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)影響固定化脂肪酶活性的因素進(jìn)行組合優(yōu)化,結(jié)果如表4所示。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,由極差R可以看出固定化脂肪酶制備的主次影響因素:脂肪酶質(zhì)量濃度>反應(yīng)溫度>pH>固定化時(shí)間。比較k值大小確定最佳制備條件為A2B2C3D2,即最佳制備條件:緩沖溶液pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,脂肪酶質(zhì)量濃度為2 g/L,固定化時(shí)間為9 h。為了評(píng)價(jià)固定化酶酶活的穩(wěn)定性,對(duì)最佳制備條件A2B2C3D2進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn),固定化脂肪酶酶活分別為1 496,1 501,1 475 μg/g,平均酶活為(1 491±14) μg/g,說(shuō)明該條件下固定化酶酶活較為穩(wěn)定。

表4 不同條件下固定化脂肪酶酶活的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)掃描電子顯微鏡對(duì)實(shí)驗(yàn)所用玉米秸稈生物炭及上述固定化脂肪酶進(jìn)行表征,結(jié)果如圖1所示。生物炭橫截面和側(cè)面均觀察到良好的孔隙結(jié)構(gòu),將脂肪酶進(jìn)行固定化處理后,在圖1(c,d)中均能觀察到較多小球狀顆粒物,證明脂肪酶通過(guò)物理吸附能被有效固定在生物炭的表面、孔隙和裂縫中。

圖1 玉米秸稈生物炭及固定化脂肪酶的掃描電鏡圖

2.2 不同條件下固定化脂肪酶對(duì)PAEs的降解效果

圖2(a)顯示了不同pH土壤環(huán)境中固定化脂肪酶對(duì)PAEs的降解情況。由圖2(a)可知:固定化脂肪酶在pH為7.5和8.5的土壤中均具有較高降解活性,其中當(dāng)pH=7.5時(shí),DMP,DEP,DiBP,DnBP,DEHP,DnOP的去除率分別可達(dá)84.25%,64.88%,66.82%,58.75%,49.00%,34.37%。推測(cè)不同PAEs降解快慢的差異可能與其側(cè)鏈長(zhǎng)度及污染物本身性質(zhì)有關(guān)[17],Peng等[18]發(fā)現(xiàn)比起具有相對(duì)較長(zhǎng)烷基側(cè)鏈的DnBP,烷基側(cè)鏈較短的DMP和DEP更容易被細(xì)菌降解,因此在同樣的環(huán)境條件下,固定化脂肪酶可能對(duì)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的化合物有更好的促進(jìn)降解效果,DEHP,DnOP等辛醇水分配系數(shù)高的長(zhǎng)鏈PAEs則降解較慢。在土壤pH為5.5和6.5的條件下,PAEs的去除率急劇下降,推測(cè)土壤pH可能會(huì)影響固定化脂肪酶的降解活性。Kaushal等[19]證明了游離和固定化脂肪酶當(dāng)pH為4～5時(shí)均沒(méi)有活性,并表明較低pH環(huán)境下脂肪酶的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變,進(jìn)而影響脂肪酶的催化活性。此外,土壤pH會(huì)影響吸附劑的電荷密度,直接影響污染物在土壤中的去除效果[20]。因此,固定化脂肪酶更適合在中性或偏堿性的土壤中施用,最佳pH為7.5。

a,b,c—不同字母代表不同處理之間具有顯著性差異。

圖2(b)顯示了在10,20,30,40 ℃的反應(yīng)溫度下固定化脂肪酶對(duì)PAEs的降解情況。由圖2(b)可知:隨著反應(yīng)溫度從10 ℃升高到30 ℃,PAEs去除率得到顯著提高(p<0.05),并在30 ℃達(dá)到最高;去除率為34.33%～84.25%。當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高到40 ℃時(shí),去除率下降到23.65%～74.79%。推測(cè)可能與不同反應(yīng)溫度下脂肪酶的活性及其反應(yīng)程度有關(guān)。已知不同酶的最佳催化溫度范圍有所差異,低于或超過(guò)最佳溫度范圍時(shí),污染物的去除效果會(huì)因?yàn)槊复呋钚缘南陆刀艿接绊慬21]。Sri等[22]對(duì)不同溫度殼聚糖固定化脂肪酶(來(lái)源于假絲酵母)的水解活性進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)溫度高于最適條件后,即使稍有升高,也會(huì)導(dǎo)致脂肪酶大量失活并減弱對(duì)底物的水解活性。Kobayashi等[23]發(fā)現(xiàn)在脂肪酶降解物質(zhì)時(shí),不適宜的反應(yīng)溫度會(huì)使酶無(wú)法保持良好的蛋白質(zhì)活性,造成酶催化時(shí)間縮短,導(dǎo)致降解效果下降。因此固定化脂肪酶降解PAEs的適宜反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖2(c)顯示了施加1%,2%,5%的固定化脂肪酶對(duì)PAEs降解情況的影響。由圖2(c)可知:當(dāng)酶施加量從1%升高到2%時(shí),PAEs去除率得到顯著提升(p<0.05),以DnBP和DEHP為例,兩者的最高去除率分別可達(dá)53.24%和40.72%。隨著固定化酶施加量繼續(xù)增大到5%,發(fā)現(xiàn)去除率反而隨著酶量的增大而稍有下降。Choi等[24]在0.5%～3.0%酶施加量范圍內(nèi),發(fā)現(xiàn)隨著酶施加量的增加初始去除率顯著增大,經(jīng)4 h反應(yīng)后,酶施加量2%和3%獲得了97%的相似最大去除率。雖然也有一些研究為了獲得更高的物質(zhì)去除率采用了更高的酶施加量[25-26],但是在本實(shí)驗(yàn)中考慮固定化脂肪酶的施用效益及去除效果,選用2%為最佳固定化酶施加量。

圖2(d)顯示了在土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30%,45%,60%的條件下固定化脂肪酶對(duì)PAEs去除情況的影響。由圖2(d)可知:PAEs的去除率與土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。以DnBP和DEHP為例,發(fā)現(xiàn)水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從30%增加到60%的過(guò)程中,去除率分別從24.01%和26.15%提高到51.24%和50.72%,且在不同條件下PAEs的去除率有顯著性差異(p<0.05)。這可能是由于土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加會(huì)使土壤孔徑增大,促進(jìn)污染物和固定化脂肪酶在土壤中的分布與結(jié)合[27]。Zhang等[28]通過(guò)對(duì)比玉米、小麥和水稻對(duì)土壤中的PAEs的耐受性,發(fā)現(xiàn)淹水條件下土壤中的PAEs有更高的去除率,使得水稻對(duì)PAEs更具耐受性。此外,土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高還能促進(jìn)水解反應(yīng),提高土壤微生物的活性并加速污染物質(zhì)的水解[29]。因此,去除PAEs最佳土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%。

2.3 PAEs降解動(dòng)力學(xué)分析

根據(jù)2.2節(jié),在pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,固定化脂肪酶施加量為2%,土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的條件下,探究14 d內(nèi)固定化脂肪酶對(duì)土壤中PAEs的降解,結(jié)果如圖3所示。

圖3 固定化脂肪酶對(duì)PAEs的降解效果

為了更深入了解固定化脂肪酶對(duì)PAEs的降解行為,采用一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型(Ct=C0×e-kt)對(duì)PAEs的殘留質(zhì)量濃度和時(shí)間t進(jìn)行擬合分析[30],其半衰期計(jì)算式為

(2)

式中:T1/2為PAEs的半衰期;k為降解速率常數(shù),d-1。降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:固定化脂肪酶(IL)對(duì)PAEs表現(xiàn)出良好的去除能力。經(jīng)固定化脂肪酶處理,14 d后土壤中PAEs的殘留量為初始的15.93%～48.62%。相比長(zhǎng)鏈PAEs,短鏈PAEs的去除率更高,這可能是由于PAEs側(cè)酯鏈的空間效應(yīng)不同,較長(zhǎng)的側(cè)酯鏈會(huì)阻礙固定化脂肪酶與PAEs的結(jié)合,從而抑制水解反應(yīng)[17],因此短鏈PAEs更容易發(fā)生生物降解,而具有較長(zhǎng)酯鏈的PAEs則不易被生物降解。由表5可知:固定化脂肪酶對(duì)6種PAEs的降解均符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型,經(jīng)固定化脂肪酶處理,土壤中PAEs的降解速率常數(shù)k從0.019～0.035 d-1(CK)顯著增大到0.058～0.145 d-1(IL),降解半衰期從19.80～36.48 d顯著縮短到了4.78～11.95 d,表明固定化脂肪酶的使用可以提高土壤中PAEs的去除率,尤其是短鏈PAEs,對(duì)于長(zhǎng)鏈PAEs可以考慮先用微生物降解為短鏈PAEs后,再用固定化酶來(lái)處理。

3 結(jié) 論

以生物炭為固定化載體,通過(guò)物理吸附制備固定化脂肪酶,采用正交實(shí)驗(yàn)法確定了固定化脂肪酶的最佳制備條件:pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,脂肪酶質(zhì)量濃度為2 g/L,固定化時(shí)間9 h,此時(shí)固定化脂肪酶酶活最高,平均酶活為(1 491±14) μg/g。將此條件制備的固定化脂肪酶施用到PAEs污染土壤中,發(fā)現(xiàn)不同的土壤pH、反應(yīng)溫度、固定化酶施加量和土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都會(huì)對(duì)PAEs的去除產(chǎn)生影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,固定化脂肪酶施加量為2%,土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的條件下,PAEs去除效果最好;14 d后土壤中PAEs的殘留量為初始的15.93%～48.62%,降解半衰期從19.80～36.48 d縮短到4.78～11.95 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:生物炭固定化脂肪酶具有良好的PAEs去除能力,為固定化脂肪酶在實(shí)際污染土壤中的應(yīng)用提供了依據(jù)。后續(xù)考慮開展田間實(shí)驗(yàn)探究固定化脂肪酶在實(shí)際土壤環(huán)境中對(duì)PAEs去除的影響,并通過(guò)土壤理化性質(zhì),土壤微生物種群等指標(biāo)的變化,進(jìn)一步證明固定化脂肪酶的應(yīng)用潛力。