張陽 ，李軍祥 ，胡俊聰 ，張黎明 ，王佳麗 ，韓嘯 ，姜慧 ，章曉思 ，王木源 ，石磊

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是發(fā)生在結直腸的原因不明的非特異性炎癥性疾病[1]。UC多發(fā)于中青年，腹瀉、黏液膿血便及腹痛等癥狀嚴重影響患者生活質量。UC難治愈、易復發(fā)，緩解癥狀和減少復發(fā)是目前治療關鍵[2]。

UC發(fā)病機制尚未完全闡明，目前主要認為是在遺傳、環(huán)境或腸道微生物等因素作用下，腸屏障遭到破壞，從而發(fā)生過激的免疫炎癥反應[3]，腸屏障損傷是此過程的關鍵環(huán)節(jié)[4]。黏液屏障結構性減弱是UC發(fā)病的更早期事件，修復黏液屏障可能是治療UC的新方向[5]。結腸組織杯狀細胞分泌的黏蛋白2（MUC2）是黏液屏障的功能基礎[6]，白細胞介素（IL）-18高表達會加劇黏液屏障損傷[7]，表達于腸上皮的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白（NLRP）6能夠通過調節(jié)IL-18產生維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8-9]。因此，NLRP6/IL-18/MUC2軸可能是影響UC腸道黏液屏障的關鍵。

中醫(yī)藥在緩解UC癥狀、促進黏膜愈合等方面具有較明顯的優(yōu)勢[10]。課題組李軍祥教授總結多年臨床經驗創(chuàng)立清腸溫中方。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，該方能有效改善UC患者癥狀，降低改良梅奧（Mayo）評分[11]，還能增加UC患者結腸杯狀細胞數量及MUC2表達，修復腸屏障損傷[12]。本研究觀察清腸溫中方對UC小鼠NLRP6/IL-18/MUC2軸及腸道黏液屏障的影響，深入探索其治療UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠24只，體質量（20±2）g，斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學實驗動物房，溫度23～27 ℃，濕度40%～60%，12 h/12 h光暗循環(huán)，自由攝食飲水。本實驗經北京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審批（BUCM-2021-01124）。

1.2 藥物及制備

清腸溫中方由黃連6 g、炮姜10 g、青黛3 g、苦參9 g、三七6 g、木香6 g、地榆炭15 g、炙甘草6 g組成，飲片顆粒購于北京康仁堂藥業(yè)有限公司，由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院配方顆粒藥房制成配方顆粒，2袋配方顆粒相當于1劑原方。美沙拉嗪片，德國?？酥扑幱邢薰?，0.5 g/片，批號17K09615L。將2袋配方顆粒溶于66 mL去離子水，0.5 g美沙拉嗪溶于13 mL去離子水，超聲震蕩1 h，過濾，取上清液，即得相應灌胃溶液，置于4 ℃冰箱保存。

1.3 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國MP Biomedical，貨號0216011080；便潛血試紙，珠海貝索生物有限公司，貨號v277201；HE染液，北京高嘉生物技術有限公司，貨號RY0456；AB-PAS染色試劑盒，武漢塞維爾，貨號G1049；NLRP6抗體，美國Affinity Biosciences公司，貨號DF15449；IL-18抗體，美國Affinity Biosciences公司，貨號DF6252；MUC2抗體，英國Abcam，貨號ab272692。LS-100病理石蠟包埋機（沈陽龍首電子儀器有限公司），F(xiàn)inesse 325石蠟切片機（北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司），BX60顯微鏡（奧林巴斯株式會社），Power Pac Basic型垂直電泳儀、Trans-blot Turbo型轉膜儀、Chemi Doc MP型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.4 分組、造模及給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，采用隨機數字表法分為空白組、模型組、清腸溫中方組和美沙拉嗪組，每組6只?？瞻捉M飲用去離子水，其他組飲用3%DSS溶液制備UC模型，連續(xù)7 d。第8日開始，美沙拉嗪組和清腸溫中方組分別予相應藥物灌胃，給藥劑量按人與小鼠體表面積換算，清腸溫中方組為原藥材9.25 g/kg[13-14]，美沙拉嗪組為0.38 g/kg，空白組和模型組灌胃去離子水，體積0.1 mL/10 g，連續(xù)7 d。

1.5 取材

給藥結束后1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，剖腹，剪取結腸，PBS清洗，測量結腸長度。取肛門端結腸組織1 cm，放入4%多聚甲醛固定。剩余結腸組織置于凍存管，液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.6 疾病活動指數評分

實驗期間每日稱量小鼠體質量，觀察大便性狀，檢測便潛血，計算疾病活動指數（DAI）評分（見表1）。DAI評分=（體質量下降評分+大便性狀評分+便潛血評分）÷3。

表1 DAI評分標準

1.7 HE染色

將多聚甲醛固定的結腸組織取出，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度5 μm），切片脫蠟后，蘇木素染液染色3～5 min，水洗，分化液分化，水洗，返藍液返藍，流水沖洗。切片依次入85%、95%乙醇脫水5 min，伊紅染液染色5 min，脫水封片。顯微鏡下觀察結腸組織病理形態(tài)。

1.8 AB-PAS染色

石蠟切片脫蠟至水，入AB-PAS染液C中染色15 min，自來水洗至無色，入AB-PAS染液B中酸化15 min，自來水洗后，蒸餾水復洗2遍，入AB-PAS染液A（恢復室溫）避光染色30 min，流水沖洗5 min，脫水封片。顯微鏡下觀察結腸黏膜杯狀細胞數量和形態(tài)。

1.9 Western blot檢測

取結腸組織30 mg，加入RIPA裂解液300 μL，充分勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃、12000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法檢測蛋白濃度。調整蛋白濃度后，上樣，凝膠電泳分離，轉膜，脫脂牛奶封閉，分別加入NLRP6、IL-18一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，加二抗室溫孵育1 h，ELC發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，以β-actin為內參，采用Image J軟件計算蛋白相對表達量。

1.10 免疫熒光染色

石蠟切片脫蠟至水，微波爐抗原修復，3%BSA封閉30 min，滴加MUC2一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜。加二抗，室溫避光孵育50 min。加DAPI染液，室溫避光染色10 min，加自發(fā)熒光淬滅劑B液孵育5 min，流水沖洗10 min，抗熒光淬滅封片劑封片。顯微鏡下觀察，計算陽性表達的熒光強度。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊組間比較采用方差分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊用非參數檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 清腸溫中方對模型小鼠一般狀況和疾病活動指數評分的影響

空白組小鼠體質量平穩(wěn)增長，模型組、清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠造模第3日開始體質量有所下降；第8日停用DSS并予相應藥物干預后，各組小鼠體質量逐漸增加，其中清腸溫中方組和美沙拉嗪組體質量增加較模型組更多。見圖1。造模開始后，空白組小鼠大便正常，其余各組小鼠大便性狀改變、便隱血或肉眼血便等情況逐漸加重。造模第7日開始，與空白組比較，模型組DAI評分顯著升高（P＜0.01）；經藥物干預后，與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組DAI評分顯著下降（P＜0.01）。見圖2。

圖1 各組小鼠體質量變化（±s，每組6只）

圖2 各組小鼠DAI評分變化（±s，每組6只）

2.2 清腸溫中方對模型小鼠結腸長度的影響

與空白組比較，模型組小鼠結腸長度顯著縮短（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結腸長度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。清腸溫中方組和美沙拉嗪組結腸長度比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠結腸長度比較（±s，cm）

表2 各組小鼠結腸長度比較（±s，cm）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

結腸長度8.13±0.296.33±0.84##7.52±0.41**7.43±0.54*組別空白組模型組美沙拉嗪組清腸溫中方組只數6666

2.3 清腸溫中方對模型小鼠結腸組織病理形態(tài)的影響

空白組小鼠結腸組織結構正常，紋理整齊，結腸黏膜未見病變；模型組小鼠結腸組織可見黏膜下隱窩結構改變和炎性細胞浸潤；與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織隱窩結構恢復，炎性細胞浸潤減少。見圖3。

圖3 各組小鼠結腸組織形態(tài)（HE染色，×1200）

2.4 清腸溫中方對模型小鼠結腸組織杯狀細胞的影響

空白組小鼠結腸組織杯狀細胞規(guī)則分布于隱窩兩側，形態(tài)飽滿；與空白組比較，模型組小鼠結腸組織隱窩結構改變，杯狀細胞數量減少、大小不均、黏液減少；清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織杯狀細胞沿腺體分布、排列較密集、數量增多。見圖4。

圖4 各組小鼠結腸組織形態(tài)（AB-PAS染色，×1200）

2.5 清腸溫中方對模型小鼠結腸組織核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白6、白細胞介素-18蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠結腸組織NLRP6蛋白表達顯著降低，IL-18蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織NLRP6蛋白表達顯著升高，IL-18蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5、圖6。

圖5 各組小鼠結腸組織NLRP6、IL-18蛋白免疫印跡

圖6 各組小鼠結腸組織NLRP6、IL-18蛋白表達比較（±s，每組6只）

2.6 清腸溫中方對模型小鼠結腸組織黏蛋白2表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠結腸組織MUC2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方組MUC2蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖7、圖8。

圖7 各組小鼠結腸組織MUC2蛋白表達（免疫熒光染色，×1200）

圖8 各組小鼠結腸組織MUC2蛋白表達比較（±s，每組6只）

3 討論

目前臨床治療UC以5-氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑為主，雖然在改善臨床癥狀方面具有一定療效，但在促進腸黏膜愈合及維持長期療效方面仍不盡如意。中醫(yī)藥具有多成分、多靶點的特點，在UC治療方面有獨特優(yōu)勢，能有效改善患者臨床癥狀，并促進腸黏膜愈合[15]。

UC發(fā)病機制復雜，腸屏障損傷是腸黏膜潰瘍形成和炎癥發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。正常腸黏膜屏障是由機械屏障、黏液屏障、免疫屏障和生物屏障組成的復雜系統(tǒng)，具有促進營養(yǎng)吸收和防止病原體入侵作用[16]。腸黏膜屏障完整性在維持機體健康方面至關重要。研究認為，易感人群受環(huán)境、微生物和遺傳因素等相互作用，導致免疫系統(tǒng)誘發(fā)異常炎癥反應，是炎癥性腸病的主要環(huán)節(jié)[17]。黏液屏障是腸屏障中直接與腸腔內容物接觸的部分，在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面扮演重要角色。黏液屏障作為機械屏障的“前哨”，能在腸黏膜抵御外源細菌和腸道固有微生物侵襲時發(fā)揮作用，尤其是將腸上皮與腸道菌群隔離，避免過度免疫反應的發(fā)生[18]。黏液、免疫球蛋白、抗菌肽等物質是黏液屏障的主要組成成分。黏液屏障分內外2層：內層由復層黏液組成，附著在腸上皮細胞表面，阻止腸道菌群入侵；外層可為共生菌新陳代謝提供能量，是細菌定植的部位[19]。黏液作為黏液屏障的主要物質基礎，由腸道杯狀細胞分泌產生。杯狀細胞不僅分泌MUC2、MUC3、MUC12和MUC17等黏蛋白，還分泌多種典型的黏液成分，如CLCA1、FCGBP、AGR2、ZG16和TFF3等，杯狀細胞與其分泌的黏液成分組成腸道第一道免疫防線[20]。MUC2在UC進展中的作用尤為突出。研究發(fā)現(xiàn)，MUC2蛋白缺乏更易發(fā)生結腸炎癥；此外，MUC2還能維持腸道微生物群，促進腸道穩(wěn)態(tài)[21]。研究表明，MUC2分泌可能受NLRP6對杯狀細胞功能調節(jié)的影響[22]，提示NLRP6與黏液屏障關系密切。NLRP6是NOD樣受體家族成員，作為細胞膜先天免疫傳感器識別微生物相關分子模式。NLRP6激活后招募凋亡相關斑點樣蛋白和炎癥性Caspase-1或Caspase-11，形成炎癥體，介導促炎因子IL-18、IL-1β的成熟和分泌[23]。NLRP6在腸上皮細胞高表達，主要功能是識別不同病原體，通過Toll樣受體抑制NF-κB和MAPK信號通路，從而抑制炎癥，調節(jié)IL-18產生；通過影響自噬體形成調節(jié)腸道黏液分泌，發(fā)揮維持腸上皮完整性、保護腸道黏液屏障、促進腸黏膜傷口愈合的作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導的腸道損傷中，NLRP6表達上調降低了腸道對結腸炎的易感性[8]，而缺乏NLRP6小鼠在DSS誘導下表現(xiàn)出更嚴重的病情，這可能與NLRP6調控隱窩中細菌生長，從而影響IL-18分泌有關[25]。

李軍祥教授認為，UC活動期至緩解期存在動態(tài)病機演變規(guī)律，即由脾氣虛逐漸發(fā)展為脾陽虛，終致脾腎陽虛，由濕邪偏盛，漸至熱邪偏盛，熱毒熾盛，瘀血內阻[26-27]。清腸溫中方由黃連、炮姜、青黛、苦參、三七、木香、地榆炭、炙甘草組成，具有清熱燥濕、涼血化瘀、溫中健脾功效。前期研究顯示，清腸溫中方能調節(jié)UC腸道菌群、促進腸上皮細胞增殖[28]，有效促進患者腸道黏膜愈合[12]。

本研究中，模型組小鼠DAI評分升高，結腸黏膜杯狀細胞數量較空白組減少，黏液分泌減少，結腸組織NLRP6和MUC2表達降低，IL-18表達升高，表明NLRP6/IL-18/MUC2軸對UC腸道黏液屏障功能具有一定影響。清腸溫中方能夠改善DSS誘導的UC小鼠疾病程度，降低DAI評分，促進結腸組織損傷修復。進一步研究發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方干預后，模型小鼠結腸組織杯狀細胞數量增加，NLRP6和MUC2表達升高，IL-18表達降低，提示清腸溫中方可能通過激活NLRP6調節(jié)IL-18產生，進而影響杯狀細胞分泌MUC2，減輕結腸黏膜病理損傷，促進腸道黏液屏障修復。本研究基于NLRP6/IL-18/MUC2軸探討清腸溫中方治療UC腸屏障損傷的作用機制，可為其臨床應用提供實驗依據。