黃晨穎, 張艷芬, 吳守欣, 趙莉藺, 石 娟*

1北京林業(yè)大學(xué),中法歐亞森林入侵生物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,北京 100083; 2中國科學(xué)院動(dòng)物研究所,農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101; 3中國科學(xué)院大學(xué),中國科學(xué)院生物互作卓越創(chuàng)新中心,北京 100049; 4河南省盧氏縣森林病蟲害防治檢疫站,河南 三門峽 472200

松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus(Steiner &Buhrer)是一種林業(yè)重大入侵生物,可引起被稱為松樹“癌癥”的松樹萎蔫病,造成重大的生態(tài)環(huán)境危害和經(jīng)濟(jì)損失(趙添羽等,2022; Mamiya,1983)。自1982年入侵我國以來,松材線蟲在傳播媒介松墨天牛MonochamusalternatusHope的協(xié)助下,已擴(kuò)散至19個(gè)省(區(qū)、市)、732個(gè)縣級(jí)行政區(qū)(國家林業(yè)和草原局2022年第6號(hào)公告),累計(jì)致死松樹超過6億株(寧靜等,2018; 張志國,2020)。目前,在對(duì)松樹萎蔫病的所有防治措施中,生物防治是對(duì)環(huán)境最友好的方法(李恩杰等,2019)。

黏質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens廣泛分布于自然界,是水和土壤中的長居菌群。近年來研究發(fā)現(xiàn),黏質(zhì)沙雷氏菌在生防領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。傅仁杰等(2019)、Fuetal.(2021)從被感染的黑翅土白蟻Odontoternesformosanus(Shiraki)上篩選到的黏質(zhì)沙雷氏菌SM1可以使健康的白蟻身體變紅死亡;涂爽等(2009)從中華蜜蜂ApisceranaFabricius腸道中分離到的黏質(zhì)沙雷氏菌GEI通過產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能防治蜜蜂病害狄斯瓦螨VarroadestructorAnderson &Trueman;傅慧靜等(2020)研究發(fā)現(xiàn),分離自松墨天牛腸道的黏質(zhì)沙雷氏菌HX-3可通過產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶實(shí)現(xiàn)其對(duì)木質(zhì)素的降解功能,從而降低蛀干害蟲的營養(yǎng)攝入。此外,還有不同黏質(zhì)沙雷氏菌株防治亞洲柑橘木虱Diaphorinacitri( Kuwayama)若蟲(鄺凡,2019; Huetal.,2021)、黃脛小車蝗OedaleusinfernalisSaussure (馮書亮等,2002)、褐飛虱Nilaparvatalugens(Stal)、二化螟Chilosuppressalis(Walker)(王渭霞等,2014)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hubner)(楊建云等,2015; 趙曉峰,2017)等的報(bào)道。不同種類的黏質(zhì)沙雷氏菌還對(duì)不同的植物病原細(xì)菌(Pressetal.,1997)、真菌(Purkayasthaetal.,2018; Wangetal.,2013)和病毒(Geetal.,2021)有抗菌活性。

本研究團(tuán)隊(duì)從松墨天牛的蛹室及其氣管中篩選到一株黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29,發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)松材線蟲及其傳播媒介松墨天牛具有致死作用(Tianetal.,2022),但其對(duì)松樹萎蔫病的作用效果尚不清楚。為確定黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29作為松樹萎蔫病生防菌劑的可行性,本研究測(cè)試了黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)人工感染松材線蟲松樹萎蔫病的防治效果,并研究了培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件對(duì)其生長的影響,以期為該菌株作為生防菌劑進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

材料:菌株SerratiamarcescensAHPC29分離自安徽天牛蛹室(Tianetal.,2022)。松材線蟲蟲株從中國陜西省柞水縣發(fā)現(xiàn)的松材線蟲病枯死松樹中分離得到(Mengetal.,2020),在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用灰葡萄孢菌飼養(yǎng)。

試劑:LB培養(yǎng)基(酵母粉5 g·L-1、胰蛋白胨10 g·L-1、NaCl 10 g·L-1)、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉、乳糖、蛋白胨、尿素、谷氨酸、豆粉、復(fù)合氨基酸、KNO3、Ca(NO3)2、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4。

儀器:LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安)、YP5002電子天平(上海越平)、OptiMair超凈工作臺(tái)(新加坡ESCO)、HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海培英)、SpectraMaxi3酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)。

1.2 方法

1.2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)松樹萎蔫病作用效果 選取生長狀態(tài)相近的2年生黑松PinusthunbergiiParlatore幼苗15株,以人工接皮法向每株黑松接種2000條線蟲,在28 ℃、180 r·min-1條件下在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,將AHPC29原菌液根灌溉至5株接種過松材線蟲的黑松幼苗根部,每棵20 mL,無菌水處理的5株作為對(duì)照組,于溫室32 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。每周根灌一次,45 d后,對(duì)照組黑松全部死亡,采集所有松樹樣品帶回實(shí)驗(yàn)室,采用貝爾曼漏斗法對(duì)線蟲進(jìn)行分離,使用倒置顯微鏡對(duì)線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)最終每株樹苗中的線蟲量。

1.2.2 培養(yǎng)基單組分篩選及其組合優(yōu)化 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別選用葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉、乳糖作為碳源,蛋白胨、尿素、谷氨酸、豆粉、復(fù)合氨基酸作為有機(jī)氮源,KNO3、Ca(NO3)2、NH4Cl作為無機(jī)氮源,K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4作為無機(jī)鹽,對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。碳源、氮源和無機(jī)鹽質(zhì)量百分比濃度均參考LB培養(yǎng)基配方,分別為0.5%、1%和1%。進(jìn)行各組分優(yōu)化時(shí),其余組分在28 ℃、180 r·min-1條件下在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,結(jié)束后用分光光度法測(cè)定光密度D600 nm,每處理3個(gè)重復(fù)。

基于培養(yǎng)基組分的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出的最優(yōu)碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源和無機(jī)鹽組分,通過正交實(shí)驗(yàn)確定各組分濃度,正交實(shí)驗(yàn)方案采用L9(34)正交表。實(shí)驗(yàn)條件為28 ℃、180 r·min-1,培養(yǎng)48 h后用分光光度法測(cè)定光密度D600 nm,每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 培養(yǎng)條件的影響 在以上已優(yōu)化的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,繼續(xù)設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)以下因素進(jìn)行篩選:接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%)、裝液量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、搖床轉(zhuǎn)速(0、60、120、180、240 r·min-1)、培養(yǎng)溫度(25、28、30、35、37 ℃)、培養(yǎng)時(shí)長(12、24、36、48、60、72 h)。原始增菌的培養(yǎng)條件為接種量5%、裝液量30%、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1、溫度28 ℃、時(shí)長24 h,以每一培養(yǎng)條件優(yōu)化后的結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行下一步培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用IBM SPSS Statistics 21軟件,結(jié)果繪圖采用OriginPro 2017軟件。黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29防治松材線蟲實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),培養(yǎng)基單組分篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果和增菌條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)松材線蟲的作用效果

黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)感染松材線蟲松樹的作用效果如圖1所示。待對(duì)照組松樹全部死亡后,菌液處理組的松樹生長狀態(tài)依然良好,接種菌液組松樹的松材線蟲的數(shù)量與對(duì)照組相比降低88.5% (P=0.0016<0.01),說明黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)松樹萎蔫病的防治具有良好效果。

圖1 黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)松樹萎蔫病的作用效果

2.2 培養(yǎng)基組分對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29生長的影響

不同碳源條件下的黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長情況(圖2A)表明,黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29在以乳糖為碳源時(shí)有最高D600 nm值,與以牛肉膏為碳源時(shí)的生長情況相近,且2種碳源條件下的生長效果均顯著優(yōu)于其他碳源。以葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí),生長情況相對(duì)較差,說明黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)葡萄糖和蔗糖的利用率低于乳糖和牛肉膏。當(dāng)以可溶性淀粉為碳源時(shí),利用率最低。

圖2 不同培養(yǎng)基組分對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29生長的影響

不同有機(jī)氮源的測(cè)試分析結(jié)果表明,以復(fù)合氨基酸為有機(jī)氮源時(shí),D600 nm值最高,且顯著高于以蛋白胨、尿素、豆粉和谷氨酸為氮源的生長情況(圖2B)。以谷氨酸為有機(jī)氮源時(shí),D600值最低。蛋白胨、尿素、豆粉作為氮源時(shí),生長情況之間無顯著差異。

不同無機(jī)氮源的測(cè)試分析結(jié)果(圖2C)表明,以硝酸鉀作為無機(jī)氮源時(shí),黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29有最高的D600 nm值,但是與以硝酸鈣作為無機(jī)氮源之間無顯著差異。以氯化銨為無機(jī)氮源時(shí),生長狀況最差,其D600 nm值顯著低于以硝酸鉀、硝酸鈣為無機(jī)氮源的結(jié)果。

不同無機(jī)鹽的測(cè)試分析結(jié)果表明,以硫酸鎂作為無機(jī)鹽時(shí),黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29有最高D600 nm值,但是與以磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵作為無機(jī)鹽之間無顯著差異。以磷酸氫二鉀為無機(jī)鹽時(shí),生長情況最差,其D600 nm值顯著低于以磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵和硫酸鎂作為無機(jī)鹽時(shí)的結(jié)果(圖2D)。

綜合以上結(jié)果,增菌培養(yǎng)基的碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源和無機(jī)鹽組分最佳選擇分別為乳糖、復(fù)合氨基酸、硝酸鉀和硫酸鎂。

2.3 培養(yǎng)基組合優(yōu)化

根據(jù)上述篩選出的最佳碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源、無機(jī)鹽,進(jìn)行四因素正交實(shí)驗(yàn),各因素均取3個(gè)水平,因素水平表見表1,正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析見表2。極差值的大小可以表明該因素水平的改變對(duì)結(jié)果的影響大小,根據(jù)各因素下極差值的大小可以看出,各因素對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌D600 nm值影響的主次順序?yàn)閺?fù)合氨基酸>乳糖>MgSO4>KNO3。根據(jù)各因素下不同水平上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值(k)可以看出,乳糖的最優(yōu)水平為水平1代表的0.1%濃度,復(fù)合氨基酸的最優(yōu)水平為水平1代表的0.5%濃度,KNO3的最優(yōu)水平為水平1代表的0.5%濃度,MgSO4的最優(yōu)水平為水平3代表的1.5%濃度,即培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為0.1%乳糖、0.5%復(fù)合氨基酸、0.5% KNO3、1.5% MgSO4。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29生長的影響

在最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別測(cè)試增菌培養(yǎng)過程中接種量、裝液量、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29生長的影響,其結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)沙雷氏菌AHPC29生長的影響

按1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%的接種量分別接種后的增菌結(jié)果見圖3A。結(jié)果表明,接種量在1%～7%時(shí),黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值呈上升趨勢(shì);接種量在7%～11%時(shí),黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值逐漸下降。盡管接種量為13%時(shí)D600 nm值有小范圍回升,依然低于接種量為7%時(shí)的D600 nm值。因此,選擇最佳接種量7%繼續(xù)進(jìn)行裝液量、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化。

裝液量10%、20%、30%、40%、50%、60%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3B。由圖可知,裝液量為40%時(shí)沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值最高,且與其他裝液量的結(jié)果差異顯著,因此本實(shí)驗(yàn)選用40%為最佳裝液量。

轉(zhuǎn)速為0、60、120、180、240 r·min-1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3C所示,其中轉(zhuǎn)速0 r·min-1下的增菌結(jié)果顯著低于其他轉(zhuǎn)速條件。盡管60 、120、180和240 r·min-1轉(zhuǎn)速之間的結(jié)果無顯著差異,但是轉(zhuǎn)速在0～180 r·min-1時(shí),D600 nm值呈上升趨勢(shì),轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時(shí),D600 nm值達(dá)到最高點(diǎn),因此選擇180 r·min-1最為最佳轉(zhuǎn)速。

培養(yǎng)溫度是生長速率的關(guān)鍵影響因素之一,25、28、30、35、37 ℃條件下的增菌結(jié)果如圖3D所示。結(jié)果表明,35和37 ℃的高溫以及25 ℃條件均對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長有顯著抑制作用。30 ℃的增菌結(jié)果顯著高于其他培養(yǎng)溫度,最有利于沙雷氏菌AHPC29生長。因此本研究選擇的最佳增菌溫度為30 ℃。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長情況如圖3E所示。結(jié)果表明,12～24 h生長緩慢,屬于其生長調(diào)整期;在24～36 h內(nèi)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29處于生長對(duì)數(shù)期;36～48 h時(shí)D600 nm值保持穩(wěn)定,說明黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29進(jìn)入生長穩(wěn)定期;培養(yǎng)60和72 h時(shí),D600 nm值持續(xù)下降,說明黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29進(jìn)入衰亡期。

3 討論

本研究通過溫室實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)已感染松材線蟲的松樹具有良好的效果,表明其具有良好的松樹萎蔫病防治應(yīng)用前景。

根據(jù)培養(yǎng)基各組分對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29生長影響的主次順序可以看出,有機(jī)氮源對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌生長的影響最大,說明有機(jī)氮源是黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29生長的關(guān)鍵組分。在微生物的培養(yǎng)過程中,無機(jī)氮源主要用于微生物的早期生長,有機(jī)氮源主要用于微生物中后期的生長和物質(zhì)積累,因此一般將有機(jī)氮源和無機(jī)氮源混合使用(杜麗紅等,2019)。在測(cè)試的有機(jī)氮源中,復(fù)合氨基酸最有利于黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長,這應(yīng)該與復(fù)合氨基酸直接含有的18種氨基酸成分可以直接用于微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成以及脫氨轉(zhuǎn)氨作用相關(guān)(杜麗紅等,2019; 盧寅泉和劉照明,1995)。而谷氨酸作為有機(jī)氮源時(shí)的結(jié)果說明,僅有谷氨酸不能有效滿足黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29生長對(duì)氮源的需求。豆粉、蛋白胨與尿素對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長情況無顯著差異且均低于復(fù)合氨基酸,這與它們需要進(jìn)一步水解或者分解之后才能利用的特點(diǎn)相一致。無機(jī)氮源的測(cè)試結(jié)果表明,黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29對(duì)硝態(tài)氮的利用優(yōu)于氨態(tài)氮。

對(duì)于黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29,碳源是僅次于有機(jī)氮源的主要培養(yǎng)基組分。碳源是微生物生長的必需組分,為微生物提供細(xì)胞碳骨架以及生命活動(dòng)所需的能量。在本研究中,作為雙糖的乳糖最有利于黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長,而淀粉作為多糖最難被利用,說明黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29在碳源中偏好乳糖,對(duì)淀粉的利用能力較弱。牛肉膏中含有有機(jī)碳、氮、維生素以及無機(jī)鹽,盡管在大多數(shù)情況下它被作為氮源,但是本研究證實(shí)其可作為碳源顯著促進(jìn)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長,這與一些研究中的結(jié)果也相一致(陳雅麗,2014; 倪海軍,2016)。

在微生物的生長過程中,無機(jī)鹽主要作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH、氧化還原電位等。無機(jī)鹽的測(cè)試結(jié)果表明,黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29在無機(jī)鹽KH2PO4、FeSO4、MgSO4之間的選擇無顯著偏好。K2HPO4和KH2PO4中的K+是磷酸丙酮酸轉(zhuǎn)磷酸酶等的輔因子,并且可以維持電位差和滲透壓,但兩者在pH值緩沖方面的作用不一樣,K2HPO4溶液為堿性,KH2PO4溶液為酸性。黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29偏好使用KH2PO4,同時(shí)FeSO4、MgSO4也為酸性溶液,說明黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29偏向利用酸性無機(jī)鹽。

根據(jù)培養(yǎng)條件的測(cè)試結(jié)果可以看出,裝液量、培養(yǎng)溫度和時(shí)長是關(guān)鍵的影響因素,其最佳裝液量為40%,最佳培養(yǎng)溫度30 ℃,最佳培養(yǎng)時(shí)長36 h。25、35和37 ℃溫度下的生長情況均顯著低于28和30 ℃的結(jié)果說明,低溫和高溫均不利于黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長,這與郝林華等(2006)的研究結(jié)果一致。接種量結(jié)果之間無顯著差異說明接種量對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長影響不顯著。黏質(zhì)沙雷氏菌為兼性厭氧菌(Smithetal.,2009),可在有氧或缺氧條件下生長,無轉(zhuǎn)速時(shí)的生長情況顯著低于有轉(zhuǎn)速的結(jié)果說明,有氧條件有利于黏質(zhì)沙雷氏菌AHPC29的生長。