細(xì)胞焦亡在腦出血發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

喬穎,袁月,徐三鵬,李萍

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,長(zhǎng)春 130117)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)指的是原發(fā)性非嚴(yán)重外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血,流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,ICH在整個(gè)腦卒中的占比不高,為10%～15%[1],但它的高致殘率和死亡率不容忽視。ICH損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,前者主要由血腫擴(kuò)張所致;而后者指因出血后的炎癥反應(yīng)、血-腦屏障損傷及形成血腫周圍水腫而導(dǎo)致的一系列腦損傷[2]。諸多因素觸發(fā)ICH后形成的多種病理生理機(jī)制,導(dǎo)致血腫周圍和腦部偏遠(yuǎn)區(qū)域的細(xì)胞大量死亡,尤其以神經(jīng)細(xì)胞居多,關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞的損傷,細(xì)胞焦亡就涉及其中[3]。本文總結(jié)關(guān)于ICH誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的相關(guān)知識(shí),結(jié)合患者的臨床癥狀,探討減少ICH后細(xì)胞焦亡的策略,以改善患者生活質(zhì)量。

1 細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡是一種經(jīng)由caspase-1/4/5/11等炎癥小體觸發(fā)的程序性死亡的炎癥方式。細(xì)胞焦亡對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷,使其腫脹、細(xì)胞膜裂解、染色質(zhì)破裂并活躍細(xì)胞內(nèi)促炎因子促進(jìn)分泌。作為眾所周知的蛋白酶caspase-1,可促使白細(xì)胞介素18(interleukin-8,IL-18)與白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的無(wú)活性前體至成熟狀態(tài),最終導(dǎo)致細(xì)胞焦亡,這是最先發(fā)現(xiàn)也是主要的焦亡途徑[4]。

1.1 細(xì)胞焦亡的發(fā)現(xiàn)

細(xì)胞焦亡最早是在1992年由Zychlinsky等[5]于弗氏志賀氏桿菌感染的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。19世紀(jì)初,Bergsbaken等[6]發(fā)現(xiàn)沙門氏菌破壞巨噬細(xì)胞并使其快速死亡,后期討論死亡原因不是來(lái)源于細(xì)胞感染,而是由于caspase-1產(chǎn)生的細(xì)胞毒性所致,他們將這類特殊的程序性細(xì)胞死亡定義為細(xì)胞焦亡。Miao等[7]研究出單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中包含的caspase-1可介導(dǎo)細(xì)胞焦亡,之后Matikainen等[8]發(fā)現(xiàn),caspase-4、caspase-5及caspase-11與細(xì)胞焦亡同樣具有相關(guān)性,而caspase-1與caspase-4/5/11并不同源,可以看出caspase家族與細(xì)胞焦亡息息相關(guān)。

1.2 細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡

兩者在形態(tài)學(xué)和生化特性兩方面表現(xiàn)不一,具體在DNA損傷程度、核固縮大小及caspase的依賴性上有所體現(xiàn)。(1)兩者具有各自特定的DNA損傷程度及損傷形式。細(xì)胞焦亡發(fā)生后DNA碎片是隨機(jī)的且細(xì)胞核保持完整[9]。對(duì)于細(xì)胞凋亡而言,DNA酶(caspase activated Dnase,CAD)經(jīng)由caspase活化并在CAD伴侶蛋白(inhibitor of caspase-activated Dnase,ICAD)抑制CAD的共同作用下?lián)p傷DNA,破壞細(xì)胞核。其中caspase-1雖然可以裂解CAD,但其并不參與細(xì)胞焦亡過(guò)程。(2)細(xì)胞焦亡的特征性表現(xiàn)在質(zhì)膜破裂、細(xì)胞腫脹和溶解3個(gè)方面。caspase-1/11誘導(dǎo)消皮素D(gasdermin D,GSDMD)活化后,細(xì)胞膜迅速遭到破壞[10],因此,在細(xì)胞膜的完整性方面,焦亡細(xì)胞處于劣勢(shì)。(3)關(guān)于激活觸發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡的效應(yīng)caspase,caspase-3/6/7/8/9/10發(fā)生在細(xì)胞凋亡中。細(xì)胞焦亡大多數(shù)依賴caspase-1/11來(lái)誘導(dǎo)進(jìn)行。(4)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平可調(diào)控凋亡細(xì)胞,DNA損傷后多聚三磷酸腺苷-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)可以被激活從而消耗ATP。因此,為了維持ATP水平,caspase可裂解和下調(diào)PARP從而調(diào)控凋亡細(xì)胞,值得一提的是,雖然caspase-1能裂解PARP,但是PARP并不參與細(xì)胞焦亡[11]。

1.3 細(xì)胞焦亡的2種機(jī)制途徑

細(xì)胞焦亡的2種機(jī)制途徑分別是caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典型炎癥途徑和caspase-4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典型炎癥途徑[12]。在第一種途徑中,細(xì)胞膜中的損傷相關(guān)模式分子(deoxyadenosine monophosphate,DAMP)會(huì)活化caspase-1,激活GSDMD釋放其N末端產(chǎn)物(GSDMD-N),引起細(xì)胞焦亡。而對(duì)于第二種途徑,炎癥因子和caspase-1并不參與,同樣是依賴GSDMD,裂解GSDMD的任務(wù)主要是由caspase-4/5/11通過(guò)細(xì)胞質(zhì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活后完成。

1.3.1 經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑分子機(jī)制 在該途徑初期,Toll樣受體與核苷酸結(jié)合寡聚化域樣受體(NOD-like receptors,NLRs)識(shí)別出相關(guān)分子并對(duì)其模式進(jìn)行鑒別[13],當(dāng)識(shí)別出損傷及病原體模式時(shí)可以直接促進(jìn)構(gòu)建炎癥小體,同時(shí)激活核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB),這些相關(guān)因子包括NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、IL-18前體(pro-IL-18)及IL-1β前體(pro-IL-1β)等。這一類炎癥小體包括NLRs與黑色素瘤樣受體,其中分布較多的為NLR家族,包括NLRP3和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白4(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein 4,NLRC4)等,最常見的為NLRP3[14]。這些蛋白分子可活化caspase-1、NLRs和包含亮氨酸的C末端,并產(chǎn)生更復(fù)雜的序列結(jié)構(gòu)域,比如中央核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide oligomerization domain,NOD)。NOD將NLRP3與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck like protein containing a CARD,ASC)結(jié)合,ASC穿過(guò)caspase家族有關(guān)的募集域與caspase-1前體(pro-caspase-1)結(jié)合,因而產(chǎn)生了NLRP3炎癥小體。將具有活性的caspase-1從pro-caspase-1中分離出來(lái),同時(shí)活化IL-1β以及IL-18。與此同時(shí),GSDMD也被切割成了2個(gè)部分[15],能遷移到質(zhì)膜上的是比較有活性的GSDMD-N,它能將質(zhì)膜裂解并使其產(chǎn)生距離為10～15nm的小孔隙,由于這種孔隙大大降低了細(xì)胞膜內(nèi)外的離子梯度,水分子彌散內(nèi)流及胞內(nèi)鉀離子外流,細(xì)胞內(nèi)部的滲透力逐漸增加,細(xì)胞開始膨脹,質(zhì)膜逐漸溶解,炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生,導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。

1.3.2 非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑分子機(jī)制 在該途徑中,由動(dòng)物基因組中的caspase-11和人基因組中的caspase-4/5,鑒別出LPS并與之反應(yīng)產(chǎn)生毒性,然后,GSDMD再被caspase-4/5/11進(jìn)行裂解,產(chǎn)生細(xì)胞焦亡;同時(shí),活化的氨基末端GSDMD-N激活NLRP3炎性體。在病原體影響下,通過(guò)配體(如LPS)結(jié)合將髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)銜接蛋白募集到IL-受體I(interleukin-1 type Ⅰ receptor,IL-1RⅠ)和IL-18受體(interleukin-18R,IL-18R)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)的Toll樣受體結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致IL-1R相關(guān)激酶(interleukin receptor associated kinase,IRAK)的募集、激活和自磷酸化。然后IRAK從受體-MyD88復(fù)合物中釋放出來(lái),并與E3泛素連接酶腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)偶聯(lián),后者自身泛素化并活化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)[16]。與此同時(shí)TAK1激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物,并在IκBα介導(dǎo)的反應(yīng)機(jī)制中產(chǎn)生NF-κB,其次激活NLRP3炎癥小體,引發(fā)細(xì)胞焦亡。在此途徑中,人體內(nèi)的caspase-4/5與小鼠體內(nèi)的caspase-1/11功能類似。

此外,Jiang等[17]發(fā)現(xiàn),caspase-3可針對(duì)GSDME進(jìn)行切割產(chǎn)生N末端片段,同時(shí)在質(zhì)膜上形成孔隙,引發(fā)細(xì)胞焦亡。Zhou等[18]研究表明,活性氧能夠與鐵離子進(jìn)行反應(yīng),活化鐵離子并募集線粒體中的B淋巴細(xì)胞瘤-2因子(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),導(dǎo)致細(xì)胞胞漿中的細(xì)胞色素(cytochrome,Cytc)增加并活化caspase-3,活性程度高的caspase-3切割高表達(dá)的GSDME引發(fā)細(xì)胞焦亡。此外,caspase-8可切割GSDMD引發(fā)細(xì)胞焦亡[19]。

2 細(xì)胞焦亡與腦出血

炎癥反應(yīng)在ICH機(jī)制中擔(dān)負(fù)著重要角色,ICH時(shí),炎癥小體被活化,促進(jìn)炎癥因子釋放,加重炎癥反應(yīng),并由GSDMD介導(dǎo)細(xì)胞焦亡,導(dǎo)致ICH加重。在ICH發(fā)病時(shí)期,caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA及相關(guān)蛋白質(zhì)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)顯著增加。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在caspase-1所引導(dǎo)的經(jīng)典途徑被激活,發(fā)生細(xì)胞焦亡,IL-18及IL-1β這類炎癥因子從細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)釋放,加重ICH并產(chǎn)生繼發(fā)性損害[20]。

Chen等[21]發(fā)現(xiàn)通過(guò)降低ICH后神經(jīng)元NLRP3依賴的細(xì)胞焦亡途徑,可以改善ICH后神經(jīng)功能。目前臨床上廣泛應(yīng)用的依達(dá)拉奉也是通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3的表達(dá),在ICH后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,提示細(xì)胞焦亡的水平與ICH后的神經(jīng)功能呈負(fù)相關(guān)。Li等[22]發(fā)現(xiàn)異甘草苷可以通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞焦亡,從而改善抑郁癥。最新研究指出,植入具有持續(xù)硫化氫輸送的絲素蛋白水凝膠可減少神經(jīng)元焦亡,并促進(jìn)嚴(yán)重ICH后的功能恢復(fù)[23]。以上表明,細(xì)胞焦亡與ICH的預(yù)后相關(guān),而其對(duì)細(xì)胞焦亡的抑制將可能成為治療ICH的新方案。現(xiàn)對(duì)細(xì)胞焦亡激活途徑中囊括的核因子κB、caspase-1、GSDMD、NLRP3等分子因素在ICH中的作用機(jī)制展開探討。

2.1 NF-κB與腦出血

NF-κB作為NF-κB蛋白家族的一種,一般在細(xì)胞質(zhì)中是無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞與外界因子反應(yīng)后,NF-κB可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),并結(jié)合相應(yīng)的靶序列,從而調(diào)整相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。有研究表明,ICH 4h內(nèi)機(jī)體會(huì)釋放大量的IL-17以激活NF-κB p65,核因子κB能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化,從而刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌IL-18、IL-16等炎癥因子,最終促成炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展,從而進(jìn)一步加重腦組織損傷。ICH后復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)激活NF-κB途徑[24],而NF-κB作為轉(zhuǎn)錄中重要的調(diào)控因素,可影響?zhàn)じ椒肿游镔|(zhì)、即早基因組、細(xì)胞表面受體等細(xì)胞因子的表達(dá)。因此,NF-κB牽動(dòng)著損害血管內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制,對(duì)于凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)都發(fā)揮著重要作用。Zhao等[25]研究顯示,ICH血腫患者NF-κB表達(dá)明顯增加,而控制NF-κB表達(dá)有利于抑制ICH炎癥反應(yīng),減少腦細(xì)胞焦亡及降低血管損傷。綜上可知,NF-κB參與ICH并在腦細(xì)胞焦亡發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

2.2 caspase-1與ICH

Liang等[26]使用caspase-1抑制劑作用于ICH大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠腦血腫周圍的IL-1β、IL-18含量減少,這表明caspase-1可加劇ICH的炎癥反應(yīng),加劇繼發(fā)性腦損傷。caspase家族共同負(fù)責(zé)細(xì)胞的程序性死亡,目前負(fù)責(zé)執(zhí)行細(xì)胞凋亡命令的是caspase-3/6/7/8/9/10,控制細(xì)胞焦亡的caspase-1/4/5/11。細(xì)胞胞漿中的caspase-1前體可被炎癥小體活化之后形成caspase-1四聚體。caspase-1參與細(xì)胞焦亡之后既能將IL-1β與IL-18前體切割為有活性的IL-18與IL-1β,促進(jìn)1L-1β、1L-18的成熟;又可切割GSDMD,切割后的GSDND-N和細(xì)胞膜磷脂蛋白結(jié)合使細(xì)胞膜生成孔隙,IL-1β、IL-18與其他促炎因子經(jīng)由孔隙移動(dòng)至胞外引起炎癥反應(yīng),從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。在NLRC4誘導(dǎo)的大鼠ICH炎癥中,抑制caspase-1活化能減輕腦組織細(xì)胞損傷及抑制細(xì)胞焦亡,可減輕大鼠的神經(jīng)損害[27]。

2.3 GSDMD與ICH

近年來(lái)的科學(xué)研究證實(shí),焦孔素家族(Gasdermins,GSDMs)中含有GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME以及PJVK(Pejvakin,亦稱DFNB59)共6個(gè)蛋白,而對(duì)于GSDMD蛋白的研究國(guó)內(nèi)外呈上升趨勢(shì)[28]。GSDMD由GSDMD-NT和GSDMD-CT及相關(guān)結(jié)構(gòu)域鏈接物構(gòu)成,GSDMD-CT和GSDMD-NT反應(yīng)之后互相對(duì)抗,正是這種特殊的雙結(jié)構(gòu)域使GSDMD具有自抑制作用。這種自抑制作用經(jīng)由caspase-1/4/5/11活化裂解末端引發(fā)焦亡。Kayagaki等[29]研究表明,過(guò)量的GSDMD-NT活化反應(yīng)能提高和加快細(xì)胞焦亡。GSDMD是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白,可通過(guò)不同途徑刺穿細(xì)胞膜介導(dǎo)細(xì)胞焦亡,產(chǎn)生炎癥反應(yīng),加快腦出血的進(jìn)程并加重腦損傷。細(xì)胞焦亡反應(yīng)中,GSDMD可作為關(guān)鍵因子來(lái)防治腦出血。

2.4 NLRP3與ICH

大量研究表明,在ICH誘導(dǎo)的繼發(fā)性腦損傷中,先天免疫與炎癥反應(yīng)參與其中。細(xì)胞中的點(diǎn)樣受體最近被證明發(fā)揮了關(guān)鍵作用,其中NLRP3最具代表性,它可以利用NLR識(shí)別一系列刺激,并產(chǎn)生凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白以活化caspase-1。活化的caspase-1裂解為GSDMD、pro-IL-1β和pro-IL-18,并引起細(xì)胞焦亡及IL-1β和IL-18釋放[30]。ICH后繼發(fā)性損傷由原發(fā)損傷引發(fā)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)(如機(jī)械破壞和質(zhì)量效應(yīng))、凝血成分(如血紅蛋白和鐵)的釋放以及對(duì)血腫的生物生理反應(yīng)(如炎癥)引起。隨著常駐小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、大量白細(xì)胞及炎癥因子的形成等,會(huì)產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。NLRP3炎癥小體可以介導(dǎo)血腫周圍神經(jīng)元死亡,尤其是在ICH整個(gè)過(guò)程中對(duì)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)具有促進(jìn)作用,NLRP3是該級(jí)聯(lián)反應(yīng)眾所周知的組成部分[30]。NLRP3炎癥小體與ICH誘導(dǎo)的繼發(fā)性損傷有關(guān),抑制NLRP3可能影響ICH細(xì)胞焦亡后的腦功能。

3 小 結(jié)

綜上,細(xì)胞焦亡作為一種新型促炎程序性細(xì)胞死亡形式,在GSDM蛋白家族的裂解活性基礎(chǔ)上和caspase家族產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與ICH的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí),ICH后NF-κB、caspase-1、NLRP3及GSDMD蛋白的基因表達(dá)極高,因此,對(duì)引起細(xì)胞焦亡的相關(guān)效應(yīng)物NF-κB、caspase-1、NLRP3及GSDMD蛋白進(jìn)行調(diào)控是治療ICH的新策略。其次,細(xì)胞焦亡在ICH研究中的作用被初步關(guān)注,相關(guān)信號(hào)通路需要深入探索,為治療ICH提供新方向。再次,由于目前關(guān)于細(xì)胞焦亡的靶向藥物并未廣泛應(yīng)用于臨床,因此還需要大量的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。最后,關(guān)于細(xì)胞焦亡非典型激活途徑或其他特殊途徑與ICH的關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步深入研究。