皮 立，譚 亮，曹俊虎

（1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2.中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；3.中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001）

由野牦牛通過(guò)長(zhǎng)期馴化而來(lái)的牦牛（Bos gruniens）是青藏高原古老的畜種，是藏民族不可或缺的生產(chǎn)生活資料。長(zhǎng)期低氧嚴(yán)寒環(huán)境的適應(yīng)造就了高原牦牛肉高蛋白、低脂肪、風(fēng)味香醇、營(yíng)養(yǎng)豐富的優(yōu)良品質(zhì)[1-2]。玉樹(shù)牦牛生存于平均海拔4 000 m以上的高海拔地區(qū)，與世隔絕的自然地理環(huán)境，讓玉樹(shù)牦牛保持了較多的野牦牛特征[3-4]，玉樹(shù)牦牛體格在青海省4 個(gè)地方品種中最大。遠(yuǎn)離城市的自然環(huán)境造就了玉樹(shù)牦牛肉綠色無(wú)污染、肉香濃郁、風(fēng)味香醇的優(yōu)良食用品質(zhì)，成為高品質(zhì)牦牛肉的代表。

玉樹(shù)牦牛的研究主要集中在疫病防治[5-8]、抗逆生理[9-10]和飼養(yǎng)繁殖[11-14]等方面，對(duì)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究重點(diǎn)在加工過(guò)程中肉風(fēng)味的變化[15-16]。對(duì)不同性別舍飼牦牛肉的營(yíng)養(yǎng)和食用品質(zhì)分析結(jié)果表明，母牛的肌內(nèi)脂肪含量、鮮味氨基酸含量以及粗蛋白含量均高于公牛[17]。研究不同性別西門(mén)塔爾牛肉質(zhì)差異發(fā)現(xiàn)，母牛脂肪酸含量高、剪切力和水分含量低，肉質(zhì)優(yōu)于公牛[18]。然而，關(guān)于不同性別牦牛肉風(fēng)味成分研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

風(fēng)味作為肉的重要品質(zhì)指標(biāo)，直接影響人們的購(gòu)買(mǎi)意向。決定牦牛肉風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)劣的因素很多，主要與年齡、性別、生存環(huán)境、飼養(yǎng)方式和牦牛品種等有關(guān)。開(kāi)展不同性別牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味的研究，從中挖掘出不同性別牦牛肉風(fēng)味的差異化合物，為擴(kuò)充牦牛肉品質(zhì)評(píng)價(jià)、分級(jí)和標(biāo)準(zhǔn)制訂提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，可為牦牛肉資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用與肉質(zhì)加工提供數(shù)據(jù)支撐，為推動(dòng)玉樹(shù)牦牛肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

本研究以不同性別玉樹(shù)牦牛為對(duì)象，對(duì)產(chǎn)自治多縣的玉樹(shù)牦牛肉應(yīng)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry HS-SPME-GC-MS）技術(shù)進(jìn)行揮發(fā)性化合物檢測(cè)，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）和氣味活度值（odor activity value，OAV），對(duì)不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行區(qū)分鑒定，篩選不同性別玉樹(shù)牦牛肉的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，為玉樹(shù)牦牛肉品質(zhì)控制增加新的理論依據(jù)，并為進(jìn)一步擴(kuò)大玉樹(shù)牦牛肉產(chǎn)品的質(zhì)控指標(biāo)提供科學(xué)的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2022年9月，隨機(jī)挑選在青海省玉樹(shù)州治多縣境放牧飼養(yǎng)的4～5 歲健康公、母牦牛各3 批次，共6 頭，經(jīng)停食24 h、停水2 h后屠宰，屠宰后立即采集左半胴體第10～14肋骨背最長(zhǎng)肌500 g，裝入干凈的保鮮袋中，放入冷藏箱（0～4 ℃），帶回西寧實(shí)驗(yàn)室，于－20 ℃保存，樣品屠宰2 d后進(jìn)行檢測(cè)。

2-甲基-3-庚酮 上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Thermo 1300/TSQ8000Evo型氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SPME裝置 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣針、DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國(guó)Supelco公司；DB-WAX石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味成分萃取

將肉樣在自然狀態(tài)下解凍，去除筋膜，切成肉丁，用液氮進(jìn)行速凍，倒入粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，粉碎后稱(chēng)取5 g肉樣放進(jìn)20 mL樣品瓶中，并加入5 mL飽和氯化鈉溶液和2 μL 2-甲基-3-庚酮溶液（0.168 μg/mL）混合，放入轉(zhuǎn)子后振蕩并置于磁力攪拌器上，將老化好的萃取頭插入樣品瓶距離樣品1 cm處，在60 ℃條件下吸附45 min后取出，并插入GC進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸附4 min[19-20]。

1.3.2 GC-MS條件

DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為He；載氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣品和接口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升溫到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫到200 ℃，并以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，不分流進(jìn)樣；離子源溫度250 ℃；傳輸線(xiàn)溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30~600 u；溶劑延遲0 min[21-23]。

1.3.3 定性與定量分析

分析得到的質(zhì)譜圖經(jīng)NIST 14和Wiley Library標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索定性，從中根據(jù)匹配度（＞800）、保留時(shí)間及相關(guān)文獻(xiàn)，人工解析并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，初步定性。選擇質(zhì)量濃度0.168 μg/mL的2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)，按內(nèi)標(biāo)物峰面積對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行定量分析。

1.3.4 OAV計(jì)算

OAV按下式計(jì)算[24-25]。

式中：Ci為化合物含量/（μg/kg）；OTi為該化合物在水中的嗅覺(jué)閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和PCA，采用單因素方差分析，用最小顯著性差異法分析作多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA和變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分比較

由表1可知，共鑒定揮發(fā)性化學(xué)成分62 種，其中醛類(lèi)17 種、酮類(lèi)7 種、醇類(lèi)10 種、烴類(lèi)14 種、含硫化合物5 種、含氮含氧雜環(huán)化合物3 種和其他化合物6 種。玉樹(shù)公、母牦牛肉共有組分52 種，主要為醛類(lèi)、醇類(lèi)、烴類(lèi)和其他化合物。蔡雨靜等[26]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分主要由醛類(lèi)、醇類(lèi)和烴類(lèi)構(gòu)成，與本研究結(jié)果一致。朱青云等[27]報(bào)道，牦牛肉背最長(zhǎng)肌揮發(fā)性風(fēng)味成分主要由醛類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)和烴類(lèi)組成，其中醛類(lèi)含量最高，醇類(lèi)和烴類(lèi)含量較高。

表1 不同性別玉樹(shù)牦牛肉中揮發(fā)性風(fēng)味成分含量（n=3）Table 1 Contents of volatile flavor components in male and female Yushu yak meats (n = 3) ng/g

由圖1可知，母牦牛肉揮發(fā)性成分總量高于公牦牛肉。玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分含量由多到少依次為醛類(lèi)、醇類(lèi)、烴類(lèi)、其他化合物、酮類(lèi)、含氮含氧雜環(huán)化合物、含硫化合物。母牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分中含硫化合物、酮類(lèi)、醇類(lèi)和含氮含氧雜環(huán)化合物均高于公牦牛肉。公牦牛肉中醛類(lèi)和烴類(lèi)高于母牦牛肉，但差異不顯著。

圖1 不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性成分種類(lèi)比較Fig. 1 Composition of volatile flavor components of male and female Yushu yak meats

玉樹(shù)牦牛肉中醛類(lèi)物質(zhì)檢出種類(lèi)最多，共17 種，主要由壬醛、苯甲醛和十六醛等組成。公牦牛肉醛類(lèi)物質(zhì)含量高于母牦牛肉，但差異不顯著。醛類(lèi)物質(zhì)由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生，由于其閾值較低，對(duì)肉類(lèi)香氣貢獻(xiàn)大[28]。玉樹(shù)牦牛肉醛類(lèi)物質(zhì)含量高，公、母牦牛的醛類(lèi)化合物占比分別為57.77%、45.28%，遠(yuǎn)高于青海海晏牦牛的31.13%[21]、西藏斯布牦牛的24.31%[29]和西藏當(dāng)雄牦牛的19.5%[30]。醛類(lèi)化合物是玉樹(shù)牦牛肉的主要特征風(fēng)味成分。

玉樹(shù)牦牛肉中醇類(lèi)化合物主要有1-辛烯-3-醇、(E)-2-辛烯-1-醇、2-乙基-1-己醇和3,7,11-三甲基-1-十二醇。公牦牛肉中醇類(lèi)化合物的含量和種類(lèi)均低于母牦牛肉。醇類(lèi)化合物也來(lái)源于脂肪氧化降解。1-辛烯-3-醇是重要的醇類(lèi)化合物，其閾值低，對(duì)香氣貢獻(xiàn)大。母牦牛肉中1-辛烯-3-醇含量顯著高于公牦牛肉（P＜0.05）。其他醇類(lèi)化合物由于閾值較高，其對(duì)牦牛肉香氣的貢獻(xiàn)可忽略不計(jì)。

玉樹(shù)牦牛肉中酮類(lèi)主要有2,3-戊二酮、3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）、4-苯基-2-丁酮等。3-羥基-2-丁酮具有濃郁的奶香[31]，讓肉香味更豐富。玉樹(shù)母牦牛肉的3-羥基-2-丁酮含量顯著高于玉樹(shù)公牦牛肉，其香味更濃郁。

綜合分析可認(rèn)為，玉樹(shù)母牦牛肉揮發(fā)性成分品質(zhì)更好。

2.2 不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分PCA結(jié)果

PCA的主要目的是剔除主成分中的隨機(jī)誤差，從而降低復(fù)雜問(wèn)題的維數(shù)，并且最小化測(cè)量誤差的影響[32-34]。對(duì)玉樹(shù)公母牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行PCA，篩選關(guān)鍵揮發(fā)性成分。

由圖2可知，玉樹(shù)公、母牦牛肉明顯分離，聚為2類(lèi)，其中母牦牛肉分別第1、4象限，公牦牛肉分布第2、3象限。由表3可知，從玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性成分中提出3 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.78%，其中PC1方差貢獻(xiàn)率為89.37%，在3 個(gè)主成分中貢獻(xiàn)率最高，能夠代表玉樹(shù)公母牦牛肉揮發(fā)性成分。PC1中貢獻(xiàn)最大是辛醛、十六醛、2-乙基-1-己醇、十五醛、甲苯、壬醛、二乙二醇乙醚、1-辛醇、乙偶姻、反-2-辛烯-1醇、1-辛烯-3-醇（表4）。11 種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分由4 種醛類(lèi)、4 種醇類(lèi)、1 種烴類(lèi)、1 種醚類(lèi)和1 種酮類(lèi)組成，可見(jiàn)醛類(lèi)和醇類(lèi)對(duì)玉樹(shù)公母牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大。

圖2 不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分的PCA圖Fig. 2 PCA plot of volatile flavor compounds in male and female Yushu yak meats

表3 玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性成分PCA中主成分特征值、貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of first three principal components for volatile flavor components in Yushu yak meat

表4 主成分的旋轉(zhuǎn)矩陣權(quán)重系數(shù)Table 4 Rotation matrix of principal components in terms of weight coefficient

蔡雨靜等[26]在玉樹(shù)牦牛肉前胸、前腿、背部、后腿4 個(gè)部位肉中共檢測(cè)出57 種揮發(fā)性化合物，通過(guò)PCA篩選出6 種關(guān)鍵風(fēng)味化合物，分別為苯甲醛、壬醛、2-乙基-1-己醇、間二甲苯、烯丙基甲基硫醚、2-乙酰吡咯，可用于區(qū)分玉樹(shù)牦牛后腿肉和其他部位肉，其中壬醛、2-乙基-1-己醇是所有部位肉的共有關(guān)鍵風(fēng)味化合物。朱青云等[27]對(duì)青海大通、剛查、天峻、祁連和甘德5 個(gè)地區(qū)牦牛肉3 個(gè)部位肉進(jìn)行分析，共檢測(cè)出34 種揮發(fā)性化合物，經(jīng)PCA篩選出8 種化合物，十六醛、十八醛、壬醛、苯甲醛、正辛醇、2,3-戊二酮、乙偶姻、己酸是牦牛肉的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分。該結(jié)果中有4 種化合物與玉樹(shù)公母牦牛肉的關(guān)鍵揮發(fā)性成分相同。導(dǎo)致這些結(jié)果差異的原因，不但與牦牛不同產(chǎn)地的海拔和水熱條件有關(guān)，還與采樣部位、萃取頭類(lèi)型和樣品前處理方法有關(guān)。

2.3 不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分的OPLS-DA

OPLS-DA是一種多因變量對(duì)多自變量的統(tǒng)計(jì)方法，相對(duì)于無(wú)監(jiān)督的PCA，其優(yōu)點(diǎn)是可通過(guò)預(yù)設(shè)分類(lèi)，盡可能去除未控制變量對(duì)數(shù)據(jù)造成的影響，使模型更易于解釋[35-36]。

以牦牛肉中62 種揮發(fā)性風(fēng)味成分為因變量，牦牛性別為自變量，進(jìn)行OPLS-DA，由圖3可知，玉樹(shù)公、母牦牛肉被有效區(qū)分，其中母牦牛肉樣品分布在第1、4象限，公牦牛肉樣品分布在第2、3象限，為0.984，為1，模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）為0.996，模型擬合結(jié)果可接受[36]。經(jīng)過(guò)200 次置換檢驗(yàn)，Q2回歸線(xiàn)與縱軸相交線(xiàn)小于零，模型不存在過(guò)擬合，模型驗(yàn)證有效。認(rèn)為該結(jié)果可用于區(qū)分不同性別玉樹(shù)牦牛肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分。

圖3 不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分的OPLS-DA（A）和模型交叉驗(yàn)證結(jié)果（B）Fig. 3 OPLS-DA plot (A) and permutation test (B) of volatile flavor components in male and female Yushu yak meats

圖4 玉樹(shù)牦牛肉62 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的VIP值Fig. 4 VIP values of 62 volatile flavor compounds in Yushu yak meat

VIP值可以反映風(fēng)味物質(zhì)對(duì)模型分類(lèi)的貢獻(xiàn)程度[37]，VIP＞1可認(rèn)為該變量為該判別模型的潛在差異物質(zhì)，且VIP值越大說(shuō)明該物質(zhì)在判別過(guò)程中的貢獻(xiàn)越大。根據(jù)VIP值確定14 種物質(zhì)作為潛在差異物質(zhì)（表5），包括4 種醛類(lèi)（十六醛、壬醛、苯甲醛、十五醛）、5 種醇類(lèi)（3,7,11-三甲基-1-十二醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、反-2-辛烯-1-醇、2-己基-1-己醇）、2 種酮類(lèi)（4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮）、1 種烴類(lèi)（十三烷）、1 種酸類(lèi)（乙酸）及1 種酚類(lèi)（丁基羥基甲苯）。這14 種關(guān)鍵差異風(fēng)味化合物與PCA比較有7 種化合物（3 種醛類(lèi)、4 種醇類(lèi)）相同，表明兩種多元統(tǒng)計(jì)方法得到的結(jié)果相似。玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分中醛類(lèi)、醇類(lèi)和酮類(lèi)含量較高，尤其醛類(lèi)和酮類(lèi)由于閾值低，對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)更大。

表5 不同性別玉樹(shù)牦牛肉的特征風(fēng)味物質(zhì)OAVTable 5 OAVs of characteristic flavor components in male and female Yushu yak meats

OAV主要用于衡量化合物在揮發(fā)性風(fēng)味中的貢獻(xiàn)程度[38]。由表5可知，OAV＞1的化合物有十六醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮；玉樹(shù)公牦牛中苯甲醛OAV＞1；2-己基-1-己醇、乙酸的OAV＜0.1，認(rèn)為其對(duì)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)不大。其余4 種物質(zhì)由于飽和醇、酚類(lèi)和烷烴的閾值均較高，對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，可以不考慮其對(duì)玉樹(shù)牦牛肉風(fēng)味的影響。

玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味的5 種關(guān)鍵差異物中OAV最高的3 種化合物是十六醛、壬醛和1-辛烯-3-醇。十六醛OAV值遠(yuǎn)高于其他4 種化合物，對(duì)玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大，為牦牛肉提供了果香。壬醛和1-辛烯-3-醇也是玉樹(shù)牦牛肉的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分，為牦牛肉提供柑橘和蘑菇香味。比較玉樹(shù)公牦牛和玉樹(shù)母牦牛關(guān)鍵風(fēng)味成分的OAV發(fā)現(xiàn)，玉樹(shù)母牦牛中1-辛烯-3-醇、壬醛的OAV高于玉樹(shù)公牦牛，表明玉樹(shù)母牦牛肉的揮發(fā)性風(fēng)味中水果香和蘑菇味更濃郁。

3 結(jié) 論

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析不同性別玉樹(shù)牦牛肉的揮發(fā)性物質(zhì)，運(yùn)用PCA和OPLS-DA結(jié)合OAV，篩選不同性別玉樹(shù)牦牛肉的關(guān)鍵差異風(fēng)味化合物。玉樹(shù)牦牛肉中共鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味成分62 種，主要為醛類(lèi)、醇類(lèi)和烴類(lèi)。玉樹(shù)牦牛肉中醛類(lèi)化合物占比約為50%，遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地牦牛肉，醛類(lèi)化合物是玉樹(shù)牦牛肉的重要特征成分。比較玉樹(shù)公、母牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分含量認(rèn)為，母牦牛肉的風(fēng)味品質(zhì)更好。對(duì)不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，通過(guò)PCA篩選出11 種關(guān)鍵風(fēng)味化合物，分別為辛醛、十六醛、2-乙基-1-己醇、十五醛、甲苯、壬醛、二乙二醇乙醚、1-辛醇、3-羥基-2-丁酮、反-2-辛烯-1醇、1-辛烯-3-醇；通過(guò)OPLS-DA結(jié)合OAV，確定十六醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮5 種物質(zhì)為不同性別玉樹(shù)牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味關(guān)鍵差異物質(zhì)。本研究結(jié)果對(duì)于區(qū)分不同性別玉樹(shù)牦牛肉風(fēng)味成分提供了科學(xué)依據(jù)，也為玉樹(shù)牦牛肉風(fēng)味品質(zhì)控制和提高提供了數(shù)據(jù)支持。