GC-MS 法測定油茶籽油中10 種甾醇的含量

◎ 左靖文，黃詩怡，羅春花，楊學(xué)軍，楊 靜，周 峰，周建洋

（1.衡陽市市場監(jiān)督檢驗(yàn)檢測中心，湖南 衡陽 421200；2.衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽 421008）

植物甾醇是一種三萜化合物，主要存在于植物種子中，以游離型脂肪酸酯、糖苷、脂肪?；擒盏男问酱嬖凇?jù)報(bào)道，目前已從植物中鑒別出250 多種植物甾醇[1]。常見的甾醇化合物有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇。植物甾醇可以降低動脈粥樣病變的嚴(yán)重程度，降低高膽固醇血癥患者血清膽固醇水平，通過減少膽固醇的吸收，降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[2-3]。植物甾醇還具有預(yù)防心血管疾病、消炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等功效。近年來，植物甾醇在食品、醫(yī)療、化工等領(lǐng)域備受關(guān)注，需求量不斷增加。因此，建立一種高效、快捷、準(zhǔn)確和成本低的甾醇化合物分析方法具有重要意義[4]。目前，常用的甾醇分析技術(shù)分為氣相色譜法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法，其靈敏度高低可能因甾醇結(jié)構(gòu)和與色譜儀器耦合的檢測器而異[5]。毛細(xì)管氣相色譜法已成為檢測甾醇化合物的首選方法，大部分甾醇在DB-5 或RTX-1701 毛細(xì)管柱上有著極好的分離[6]。未經(jīng)衍生的甾醇也可經(jīng)GC-FID 或MS 檢測，但是經(jīng)硅烷化衍生后再測定能獲得更好的峰形、分辨率、靈敏度，且熱不穩(wěn)定的不飽和甾醇具有更高的穩(wěn)定性[7]。

測定油茶籽油中甾醇含量可以增加人們對其功能性成分的認(rèn)識。本課題初步探討了油茶籽油中甾醇的檢測方法的建立，為建立油茶籽油中甾醇指紋圖譜提供一定的技術(shù)和數(shù)據(jù)支持，為茶籽油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)，為解決油茶籽油摻偽難題提供一定的數(shù)據(jù)參考，保障油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1#～16#油茶籽油樣品；膽固醇、固甾烷醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、高根二醇、熊果醇、羽扇豆醇、α-香樹脂醇和羊毛甾醇等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%），斯坦福化學(xué)有限公司；二氯甲烷、正己烷、乙醇、氫氧化鉀和無水硫酸鈉等試劑，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺和1-甲基咪唑（純度97%），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；二氧化硅固相萃取柱（0.5 g/3 mL），北京美正檢測技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為一級純水。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；E204 電子天平，梅特勒托利多科技有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；水浴氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；真空泵，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子萬用爐，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司，Mμltifuge X1R 高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工作曲線配制

準(zhǔn)確稱取膽固醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、α-香樹脂醇、高根二醇、羽扇豆醇和熊果醇標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.1 mg），放于同一10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷溶解，定容至刻度線，得到1 mg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。準(zhǔn)確稱取膽甾烷醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），用二氯甲烷溶解，定容至10 mL，得到1 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲備溶液。取適量的儲備液用正己烷定容，最終標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液梯度為0 μg·mL-1、2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、20 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1，每個(gè)梯度內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為20 μg·mL-1。

1.3.2 試樣制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）油茶籽油樣品于25 mL 磨口圓底燒瓶中，加入100 μL 膽甾烷醇內(nèi)標(biāo)中間溶液（200 μg·mL-1），加入3 mL 二氯甲烷、10 mL 的0.5 mol·L-1氫氧化鉀-乙醇溶液，搖勻。在圓底燒瓶上連接好回流冷凝器，加熱，保持混合液微沸15 min。將皂化液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管，加入7 mL去離子水和10 mL 二氯甲烷，充分搖勻，置于高速冷凍離心機(jī)8 000 r·min-1離心5 min，除去上層水相。有機(jī)相用10 mL 去離子水洗滌3 次，直至溶液變清澈，45 ℃氮吹。濃縮至1 mL 左右，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶（氣相或液相2 mL 進(jìn)樣瓶），蓋墊，完好密封。用氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 硅烷化試劑（在950 μL N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺中加入50 μL 1-甲基咪唑），擰緊反應(yīng)瓶蓋，渦旋混勻。將溶液置于105 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，冷卻至室溫后加入正己烷，定容至1 mL，進(jìn)氣相質(zhì)譜分析。標(biāo)準(zhǔn)系列混合工作溶液取1 mL，硅烷化反應(yīng)同上（轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶）。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：流速為0.7 mL·min-1的氦氣，載氣模式為不分流；進(jìn)樣口溫度：320 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫箱升溫程序：初始溫度180 ℃，保持1 min，以4 ℃·min-1的速度升到300 ℃，再保持25 min；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度：300 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

本研究比較了分流襯管（安捷倫5180-2295）和不分流襯管（安捷倫5180-2293）在分流模式和不分流模式下的檢測效果。結(jié)果表明，采用分流襯管，分流比40 ∶1 模式下，甾醇物質(zhì)靈敏度低，低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)差，標(biāo)曲線性差，相關(guān)系數(shù)低于0.995；使用不分流襯管，不分流模式，靈敏度較好，標(biāo)曲線性良好，能滿足檢測要求。因此本研究采用不分流襯管，不分流模式進(jìn)行測定。本研究還考察了進(jìn)樣口、色譜柱、傳輸線等的溫度對測定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度升高，甾醇（三甲基硅醚）物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度略微增加，可能是因?yàn)殓薮际歉叻悬c(diǎn)物質(zhì)，提高檢測溫度有利于目標(biāo)物的氣化和傳輸。綜合考慮色譜柱的溫度耐受性和使用壽命，最終確定進(jìn)樣口溫度為320 ℃、傳輸線溫度為300 ℃，色譜柱初始溫度為180 ℃，色譜條件見1.3.3。

2.1.2 質(zhì)譜條件的確定

將高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行氣相質(zhì)譜測定，使用Scan 全掃描模式，荷質(zhì)比50 ～650，通過NISI 14 譜庫進(jìn)行比對，確定每種甾醇（三甲基硅醚）化合物的保留時(shí)間。選擇質(zhì)量數(shù)大，信號強(qiáng)度高的離子碎片作為定量離子和定性離子。根據(jù)保留時(shí)間和定量定性離子，設(shè)定SIM 選擇離子監(jiān)測模式條件進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。甾醇（三甲基硅醚）化合物的定量離子和定性離子見表1，標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品甾醇（三甲基硅醚化合物）GC-MS 總離子流圖

表1 甾醇（三甲基硅醚）的定量離子和定性離子表

2.2 方法學(xué)評價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限

本方法采用Sim 分段時(shí)間，選擇離子監(jiān)測模式，按照1.3.3 儀器最佳工作條件進(jìn)行分析。內(nèi)標(biāo)法定量，通過儀器定量分析軟件繪制工作曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R。在多個(gè)空白樣品中逐級加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品皂化、硅烷化后進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析，當(dāng)信噪比（S/N）約為3 時(shí)，得出各甾醇的檢出限；當(dāng)S/N約為10 時(shí)，得出各甾醇的定量限。所有待測甾醇化合物在其線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。方法檢出限為0.22 ～2.31 mg/100 g，定量限為0.73 ～7.69 mg/100 g。樣品量0.1 g，定容體積1 mL，甾醇化合物的檢出限和定量限見表2。

表2 甾醇化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限表

2.2.2 準(zhǔn)確度和精密度

本研究選擇空白樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度，根據(jù)樣品定量限分別進(jìn)行低、中、高3 水平6 平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率和精密度結(jié)果見表3。結(jié)果表明10 種甾醇化合物的回收率為89.1%～106.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.19%～2.33%（n=6），該方法準(zhǔn)確度和精密度均能滿足分析要求。

表3 加標(biāo)回收率與精密度表（n=6）

2.3 樣品測定

本研究油茶籽油樣品測定結(jié)果見表4，油茶籽油中β-谷甾醇、羽扇豆醇含量較高，膽固醇、菜油甾醇、高根二醇含量較低。不同樣品測定結(jié)果表明油茶籽的品種、產(chǎn)地不同會導(dǎo)致其甾醇含量有所差異，菜籽甾醇、熊果醇幾乎在油茶籽油中均未檢出，這兩種有望作為油茶籽油品質(zhì)摻假鑒別的指標(biāo)。

表4 油茶籽油甾醇測定結(jié)果表 單位：mg·kg-1

3 結(jié)論與討論

本研究建立了GC-MS 測定油茶籽油中10 種甾醇的方法，該方法優(yōu)化了前處理流程，縮短了時(shí)間，提高了效率。通過優(yōu)化氣相質(zhì)譜條件，降低了檢出限和定量限，提高了檢測靈敏度，該方法標(biāo)曲線性良好，回收率和精密度能滿足檢測要求，適用于油茶籽油中10 種甾醇的快速測定。