液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉制品中氯霉素

◎ 陳寧寧，張志然

（煙臺(tái)市標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 煙臺(tái) 264003）

氯霉素是一種抑菌性廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用，對(duì)立克次體、衣原體也有抑制作用[1]。因其高效廉價(jià)，曾在畜牧業(yè)中廣為應(yīng)用[2]。然而由于其對(duì)造血系統(tǒng)有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且細(xì)菌對(duì)氯霉素有發(fā)展緩慢的耐藥性，所以對(duì)其使用已經(jīng)做出嚴(yán)格控制，國(guó)家全面禁止將氯霉素用于所有食品動(dòng)物[3]。我國(guó)發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第五批）》（整頓辦函〔2011〕1 號(hào)）中將氯霉素列為在肉制品中可能違法添加的非食用物質(zhì)，在肉制品中不得檢出。

肉制品中氯霉素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為GB/T 22338—2008，包括氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[4]。兩種方法的前處理均較為復(fù)雜，存在步驟煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題。本文旨在通過(guò)簡(jiǎn)化、優(yōu)化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的前處理過(guò)程，在滿足檢驗(yàn)需求的基礎(chǔ)上提高檢測(cè)效率，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，減少試劑的使用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

樣品：肉制品，市售。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均為100 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 制18.2 MΩ·cm 超純水；乙腈、甲醇，均為色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司；正己烷（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

LCMS-8050 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源，日本島津公司；GM200 刀式研磨儀，德國(guó)Retsch（萊馳）公司；Vortex Point-2 迷你混合儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司；KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；HC-12A 自動(dòng)氮吹濃縮儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；TGL20MW 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 儀器工作條件

（1）色譜條件。Hypersil GOLD 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm×3 μm）；流動(dòng)相A 為水，流動(dòng)相B 為乙腈。流動(dòng)相梯度：0 ～1.5 min，乙腈由5%升到25%；1.5 ～2.5 min，乙腈由25%升到45%；2.5 ～3.0 min，乙腈由45%升到95%，保持1 min；4.0 ～4.5 min 乙腈由95%降到5%，保持1.5 min。流動(dòng)相流速為0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃。

（2）質(zhì)譜條件。LC-MS 接口為電噴霧接口（ESI）負(fù)離子模式，檢測(cè)方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。以m/z321.00/152.10 和321.00/257.00 為目標(biāo)物氯霉素的定性離子對(duì)，以m/z326.00/157.00 和326.00/262.00為內(nèi)標(biāo)物氯霉素-D5 的定性離子對(duì)，分別以m/z321.00/152.10 和m/z326.00/157.00 為氯霉素和氯霉素-D5 的定量離子對(duì)。霧化氣和干燥氣為氮?dú)?，霧化氣流速為3.00 L·min-1，干燥氣流速為5.00 L·min-1。脫溶劑管溫度為250 ℃，加熱溫度為400 ℃。碰撞能量（CE）為-25.0 eV。

1.3 樣品前處理

稱取5 g 粉碎的肉制品于50 mL 具塞離心管中，加入100 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液100 μL 和10 mL 乙腈，在混合儀上渦旋振蕩1 min，離心取上清液，再提取一次合并提取液于分液漏斗中。加入5 mL 乙腈飽和的正己烷，振蕩5 min，靜置分層，取上清液氮?dú)獯蹈?。? mL 甲醇/水（1+1，V/V）定容，渦旋振蕩30 s，經(jīng)0.45 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾后，上機(jī)待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng·mL-1、10 ng·mL-1）：氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg·mL-1）用甲醇稀釋得到；氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng·mL-1）：氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg·mL-1）用甲醇稀釋得到。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液和氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)中間液用甲醇/水（1+1，V/V）稀釋得到，其中氯霉素濃度分別為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1； 內(nèi) 標(biāo) 氯 霉素-D5 的濃度為10.0 ng·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

氯霉素液質(zhì)法的樣品前處理步驟一般包括提取、凈化、濃縮、溶解。標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)中提取劑主要有乙腈[4-5]和乙酸乙酯[6-7]兩種，本實(shí)驗(yàn)分別以乙腈和乙酸乙酯為提取劑進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，色譜圖見(jiàn)圖1。比較后發(fā)現(xiàn)以乙腈作為提取劑時(shí)基質(zhì)干擾更少、響應(yīng)值更高、靈敏度更好，最后選用乙腈為提取劑。凈化步驟的目的是去除脂肪和其他干擾物質(zhì)，一般使用有機(jī)溶劑萃取和固相萃取，使用固相萃取柱需要淋洗液和洗脫液，且步驟多、過(guò)程煩瑣，因此本實(shí)驗(yàn)僅使用正己烷凈化。

圖1 不同提取劑下氯霉素加標(biāo)0.2 μg·kg-1 樣品色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按上述儀器工作條件測(cè)定氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=0.073 2x+0.004 6，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 8，氯霉素濃度在0.5 ～10.0 ng·mL-1的線性關(guān)系良好。

2.3 檢出限和定量限

通過(guò)空白樣品加標(biāo)獲得方法的檢出限和定量限，加標(biāo)濃度為0.1 μg·kg-1時(shí)信噪比平均值為12，逐步降低加標(biāo)濃度，信噪比（RSD）約等于10 時(shí)得出氯霉素的定量限為0.08 μg·kg-1，信噪比（RSD）約等于3 時(shí)得出氯霉素的檢出限為0.03 μg·kg-1。

2.4 精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取空白樣品進(jìn)行不同水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示。由表1可知，氯霉素的加標(biāo)回收率在90%～95%，RSD 為3.9%～9.4%，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求。

表1 精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

2.5 加標(biāo)樣品檢測(cè)譜圖

氯霉素加標(biāo)0.6 μg·kg-1樣品色譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，氯霉素和氯霉素-D5 出峰明顯，峰形較好，與雜峰分離良好，沒(méi)有明顯干擾，且分析時(shí)間短。說(shuō)明本方法在樣品檢測(cè)時(shí)可以實(shí)現(xiàn)良好的分離分析。

圖2 加標(biāo)0.6 μg·kg-1 樣品的色譜圖

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化前處理過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了肉制品中氯霉素的簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。該方法不僅降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)方法的檢出限和回收率均能滿足肉制品中氯霉素的分析要求。