基于低剪切力微流控芯片的細(xì)菌長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)及抑菌監(jiān)測研究

張雅麗 王雪靚 劉翔 趙磊 高建華 王德富 牛顏冰李毅 申少斐

1（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太谷 030801）

2（西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 西安 710126）

抗菌藥物在治療感染性疾病、防治動(dòng)物疫病以及保障公共衛(wèi)生安全方面發(fā)揮了其它藥物不可替代的作用。但是，抗菌藥物濫用引起的細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。為方便對抗菌藥物進(jìn)行研究，研究者設(shè)計(jì)了多種抗菌藥物藥敏性方法。傳統(tǒng)抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)主要包括全基因測序、質(zhì)譜法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、肉湯稀釋法、紙片擴(kuò)散法和E-實(shí)驗(yàn)等[2-6]，但也各有不足，如E-實(shí)驗(yàn)和紙片擴(kuò)散法需要肉眼觀察菌落的形成或者測量抑菌圈的大小，進(jìn)而判斷藥物的抑菌效果，難免會存在誤差；并且這些實(shí)驗(yàn)方法涉及繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作，耗時(shí)長，通常需24～48 h，成本高。此外，當(dāng)全基因檢測接近檢測極限時(shí)，繼續(xù)提高測序深度反而可能會引入低頻率的假陽性突變。同時(shí)，隨著耐藥病原體的增多和耐藥機(jī)制的變異，傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)逐漸無法滿足臨床快速診治的需求[7]。因此，開發(fā)微型化、集成化、智能化和可在線監(jiān)測的生物傳感器尤為重要。

近年來，利用微流控芯片對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)和藥敏實(shí)驗(yàn)是新興的研究方向。微流控技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，其具有體積小、自動(dòng)化、高通量和精確的流體控制等特點(diǎn)[8-10]。微流體中最常用的材料是聚二甲基硅氧烷（PDMS），其優(yōu)點(diǎn)是易于微加工和成本低廉，表面具有良好的生物相容性。此外，PDMS 還具有高彈性和透氣性，這對于密封微通道中細(xì)胞的長期培養(yǎng)至關(guān)重要。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿相比，PDMS 芯片能夠提供更加可控的微環(huán)境，因此在細(xì)菌培養(yǎng)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[11-15]。使用PDMS 芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可以明顯縮短檢測時(shí)間，并且能夠采用顯微鏡實(shí)時(shí)檢測藥物的抑菌作用。此外，PDMS 芯片具有良好的封閉性能，在進(jìn)行前期的保護(hù)工作后，可有效避免雜菌污染。細(xì)菌培養(yǎng)室連接細(xì)菌與相鄰的微通道，連續(xù)供應(yīng)營養(yǎng)并去除代謝物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在芯片中的長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)不僅能使細(xì)菌進(jìn)入培養(yǎng)室后適應(yīng)動(dòng)態(tài)的生存條件，更好地模擬體內(nèi)腸道環(huán)境，還可使更多的藥物與細(xì)菌接觸，從而更真實(shí)地反映藥物的實(shí)際抑菌作用[16]。基于PDMS 的微流控芯片的這些獨(dú)特優(yōu)勢推動(dòng)了各種用于細(xì)菌測試的微流控芯片的開發(fā)，為抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)（AST）和耐藥菌株耐藥反應(yīng)的研究提供了技術(shù)支持[17]。Zhang 等[18]利用梯度微流控芯片和質(zhì)譜技術(shù)，探究了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌等耐藥細(xì)菌在氨芐青霉素和頭孢曲松鈉作用下成絲狀變化的過程。Zhang 等[19]開發(fā)了一種基于3D 打印技術(shù)的新型微流控芯片，用于檢測大腸桿菌對臨床代表性抗生素氨芐西林、氯霉素和卡那霉素的抗敏性，該芯片可在5 h 內(nèi)快速完成藥敏實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了微流控芯片在細(xì)菌AST 方面具有良好的應(yīng)用前景。然而，這些實(shí)驗(yàn)均未進(jìn)行灌注細(xì)菌后的長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，無法體現(xiàn)出細(xì)菌進(jìn)入培養(yǎng)室后的生存狀態(tài)；同時(shí)，也無法反映后續(xù)細(xì)菌與藥物作用的真實(shí)情況。此外，在長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過程中，細(xì)菌會承受一定的流體剪切力，導(dǎo)致細(xì)菌流失或受損。因此，構(gòu)建低剪切力的細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境非常重要，而有關(guān)研究目前鮮有報(bào)道。

本研究組前期工作表明，結(jié)構(gòu)獨(dú)特的慣性微流控芯片可有效降低流體/細(xì)胞操控對流量的依賴[20-23]。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化了微流控裝置用于評估綠原酸（Chlorogenic acid，CHA）的抑菌作用。CHA 具有廣譜的抑菌作用，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等均具有顯著的抑制作用[24-25]。本研究設(shè)計(jì)了一種基于渦旋流的低剪切力微流控芯片，用于高效捕獲細(xì)菌。此芯片采用獨(dú)特的微柱結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了更高效的細(xì)菌捕獲，并最大限度地減少了剪切力對微室中細(xì)菌生長的影響。同時(shí)，通過控制流速，可以對轉(zhuǎn)導(dǎo)GFP 的大腸桿菌TAc-IeGFP 進(jìn)行數(shù)小時(shí)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，采用此微流控芯片觀察了3 mg/mL CHA 溶液的抑菌活性。為了得到更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用傳統(tǒng)的肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法，并通過測量吸光度值（OD600）和抑菌圈大小對CHA 最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）及抑菌效果進(jìn)行了測定和表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

2X2-2 型真空泵和DHG 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；JA2003 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；KW-4 型勻膠機(jī)（中國科學(xué)院微電子中心研究部）。

75%乙醇溶液（河北康濟(jì)藥械有限公司）；PDMS（RTV615，美國Momentive 公司）；瓊脂（B.R.級，北京索萊寶生物科技有限公司）；三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司）；胰蛋白胨和酵母提取物（B.R.級，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；CHA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，合肥凱米克生化科技有限公司）。

1.2 微流控芯片的設(shè)計(jì)

本研究采用AutoCAD 軟件設(shè)計(jì)了一種低剪切力微流控芯片，用于細(xì)菌培養(yǎng)。此芯片包括1 個(gè)微室和2 個(gè)微柱結(jié)構(gòu)，進(jìn)口管道設(shè)有多個(gè)過濾柱，微室入口處設(shè)有十字形遮擋柱，微室與主管道中的柱形區(qū)域交錯(cuò)排列（圖1A）。主管道寬500 μm， 微室為近圓形的正多邊形結(jié)構(gòu)（直徑為300 μm）（圖1B 和1C）。微室用于細(xì)菌培養(yǎng)，微柱用于高流速灌注狀態(tài)下形成渦漩流，保證菌液盡可能進(jìn)入微室。微流控裝置有2 個(gè)入口和2 個(gè)出口，分別用于注射原溶液和排出廢液等。進(jìn)口管道中的過濾柱可去除一些雜質(zhì)。柱狀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)在主管道與微室之間，以最大程度地減少剪切力對微室中細(xì)菌生長的影響，并使細(xì)菌能夠在微室中穩(wěn)定地生長和反應(yīng)。

圖1 微流控芯片構(gòu)造圖：（A） 細(xì)菌捕獲及培養(yǎng)的功能單元的圖示；（B） 微柱結(jié)構(gòu)和微室（即細(xì)菌培養(yǎng)室）；（C） 微室進(jìn)口十字形遮擋柱放大圖Fig.1 Configuration of the microfluidic device: (A) Schematic diagram of functional units for capturing and culturing bacteria;(B)Microcolumn structure and microchamber(bacteria culture chamber);(C)Enlarged image of cross-shaped occluded column before the entrance of the microchamber

1.3 微流控芯片的制作方法

微流控芯片裝置主要由流動(dòng)層、薄的PDMS 層和玻璃載玻片組成（圖2）。具體制作方法如下：（1）模具加工 硅片清洗后，取15 mL 陰性光刻膠SU-8 2025 置于硅片正中央，并用旋轉(zhuǎn)涂膜儀甩涂硅片，將甩涂好的硅片分別進(jìn)行前烘、曝光、后烘及顯影，最后在正置顯微鏡下進(jìn)行觀察，檢查無誤后備用；（2）模子預(yù)處理 用TMSCl 蒸氣熏模子3 min， 以利于PDMS 聚合物與模子剝離；（3）配制PDMS 以一定質(zhì)量比例稱取PDMS 預(yù)聚物和固化劑，并將其混勻；（4）脫氣和固化 將上述混合均勻的PDMS 混合物傾倒至模子上，抽真空脫氣并放置在一定溫度烘箱中加熱固化；（5）切割和打孔 將固化好的PDMS 按設(shè)計(jì)的芯片結(jié)構(gòu)切割、打孔，清理干凈；（6）PDMS 微流控芯片的封接 將準(zhǔn)備好的PDMS 芯片平整地放置在載玻片PDMS 薄膜上，置于烘箱中烘烤，使其牢固鍵合。

圖2 聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片制作示意圖Fig.2 Schematic diagram of fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) chip

1.4 菌種活化及培養(yǎng)

采用GFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腸桿菌TAc-IeGFP[26]進(jìn)行所有的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)，該大腸桿菌發(fā)出綠色熒光，方便在熒光顯微鏡下觀察。將-80 ℃凍存的大腸桿菌TAc-IeGFP 取出，常溫解凍后，在制備的液態(tài)LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，而后均勻地涂布于固體LB 培養(yǎng)基上。將涂布的培養(yǎng)平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；在無菌環(huán)境下，將平板上的單菌落接種至EP 管（含液體LB 培養(yǎng)基），并于37 ℃搖床中進(jìn)行振蕩（180 r/min）培養(yǎng)至適宜濃度后，封管保藏。在灌注細(xì)菌之前對大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，在無菌環(huán)境下取700 μL 貯存在EP 管中的菌液加至100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，并測量其在600 nm 處的吸光度值（設(shè)多組重復(fù)），繪制此大腸桿菌的生長曲線，選取培養(yǎng)12 h 進(jìn)入穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。繁殖后的菌液放置時(shí)間不得超過7 d， 此時(shí)大腸桿菌已進(jìn)入衰退期，活力下降，不適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 大腸桿菌在微流控芯片中的培養(yǎng)

在無菌環(huán)境中組裝微流控實(shí)驗(yàn)平臺。采用無菌注射器吸取75%酒精后與芯片組裝，用酒精對芯片進(jìn)行簡單消毒，除去雜物；再用超純水對芯片進(jìn)行清洗，并除去芯片中的酒精；最后在紫外光下對芯片進(jìn)行滅菌。分別在進(jìn)口2 設(shè)置低流速（3 μL/min）灌注細(xì)菌和進(jìn)口1 設(shè)置高流速（500 μL/min）灌注LB 培養(yǎng)基，持續(xù)10 min 后降低流速，使大腸桿菌穩(wěn)定在培養(yǎng)室中。隨后進(jìn)口1 更換注射器灌注LB 培養(yǎng)基，設(shè)置流速為3 μL/min， 將芯片包裹好后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。最后在熒光顯微鏡下觀察大腸桿菌的生長情況，在相同照射間隔（通常為15 min）與曝光時(shí)間（通常為3 s）的條件下，拍攝一系列相同微室的熒光圖片，用于研究細(xì)菌菌落生長情況。通過Image-Pro Plus 6.0（IPP，Media Cyternetics，Lilver Spring，MD）軟件分析圖像。假設(shè)細(xì)菌總數(shù)正比于此區(qū)域的總體熒光強(qiáng)度[27]，并將微室圖片內(nèi)部所有像素的總和減去背景值作為熒光強(qiáng)度值。通過Origin 2021（OriginLab Corporation，Northampton，MA）軟件進(jìn)行熒光量化分析。培養(yǎng)一定時(shí)間，待大腸桿菌在芯片中完全長開，鋪滿整個(gè)芯片，在熒光顯微鏡下能觀察到穩(wěn)定的熒光，即培養(yǎng)成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.6 CHA對芯片中培養(yǎng)的大腸桿菌的抑菌效果

將經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)已在芯片中穩(wěn)定生長的大腸桿菌和CHA 藥物準(zhǔn)備就緒，分別用2.5 和10 mL 注射器吸取適量CHA 與微流控芯片相連；同時(shí)，為防止光照對CHA 產(chǎn)生影響，在注射器外部包裹一層錫箔紙。將芯片包裹好后放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置灌注CHA（濃度為3 mg/mL）的流速為3 μL/min，進(jìn)行大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)。每間隔一定時(shí)間，在顯微鏡下觀察并做拍照記錄。

1.7 CHA對大腸桿菌MIC的測定

利用肉湯稀釋法檢測不同濃度CHA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液對大腸桿菌TAc-IeGFP 的抑菌效果，本實(shí)驗(yàn)檢測周期為16 h， 具體步驟如下：（1）培養(yǎng)大腸桿菌TAc-IeGFP（挑單菌落接種于5 mL 試管），置于37 ℃培養(yǎng)箱中180 r/min 振蕩培養(yǎng)4～6 h 后，分別吸取1 mL 菌液加入到3 個(gè)1.5 mL EP 管中，備用；（2）配制CHA 標(biāo)準(zhǔn)品原液（4 mL， 10 mg/mL）， 微孔濾膜過濾除菌，然后用LB 培養(yǎng)基稀釋至不同濃度（8.75、7.50、6.25、5.00、3.75、2.50 和1.25 mg/mL）；（3）取150 μL 做96 孔板抑菌實(shí)驗(yàn)，每個(gè)孔加OD600=0.5～0.6 的菌液（3 μL，按2%的接種量），每個(gè)梯度均做3 組重復(fù)；（4）將96 孔板封好，于37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間使用酶標(biāo)儀測量其600 nm 處的吸光度（OD600），將所得數(shù)據(jù)繪制成大腸桿菌TAc-IeGFP 的生長曲線，進(jìn)而確定CHA 溶液的MIC（當(dāng)OD600= 0.1 時(shí)，細(xì)菌懸液的濃度視為1×108CFU/mL）[28]。

1.8 不同濃度CHA溶液對大腸桿菌的抑菌效果

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行瓊脂平板上的抑菌圈實(shí)驗(yàn)，用記號筆和直尺在瓊脂平板培養(yǎng)皿的背面劃分3 個(gè)區(qū)間，分別標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組（1.25～10 mg/mL CHA 溶液）、陽性對照組（50 mg/mL 硫酸卡那霉素溶液）和陰性對照組（50 mg/mL 氨芐青霉素溶液），用打孔器將濾紙片裁剪為直徑0.7 mm 的小圓片，將滅菌的濾紙圓片放置在涂布有實(shí)驗(yàn)菌液的LB 瓊脂平板表面，將濾紙片分別置于劃分的3 個(gè)區(qū)域，隨后在對應(yīng)的濾紙片上滴加5 μL 的實(shí)驗(yàn)組及對照組藥品，將瓊脂平板用透氣性封口膜封好，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h 后，觀察抑菌圈。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同流速條件下微流控芯片通道內(nèi)的迪恩流探究

在不同流速條件下，通道內(nèi)形成的迪恩流場不同，對于溶液的擴(kuò)散和粒子的捕獲會產(chǎn)生差異。本研究在進(jìn)口1 分別采用500 和3 μL/min 灌注流速，進(jìn)口2 采用3 μL/min 灌注流速進(jìn)行灌注實(shí)驗(yàn)。其中，高流速（500 μL/min）用于在微柱之間產(chǎn)生渦旋流以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌捕獲，低流速（3 μL/min）則用于灌注培養(yǎng)基和藥物。圖3 模擬了不同流速下通道內(nèi)的渦旋流分布，以及管道與微室之間的分子擴(kuò)散情況。如圖3A 所示，在高流速（500 μL/min）條件下，微柱之間會產(chǎn)生渦旋流，將細(xì)菌懸液注入微室時(shí)，可逐步將細(xì)菌擠壓到微室內(nèi)，從而在較短的時(shí)間內(nèi)提高細(xì)菌的捕獲率。如圖3B 所示，在低流速（3 μL/min）條件下，不會出現(xiàn)渦旋流，微柱之間以及培養(yǎng)室之間的流速基本為零，微室中的細(xì)菌不會受到液流剪切力的影響，即不會受到物理傷害。因此，本研究選擇在低流速（3 μL/min）條件下灌注培養(yǎng)基或藥物，并模擬其在微室中的擴(kuò)散情況（圖4）。模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在15 s 內(nèi)，液流由主管道進(jìn)入，65 s 后主管道開始逐漸充滿，255 s 時(shí)微室中的液流擴(kuò)散至1/2，1000 s 時(shí)液流已充滿整個(gè)培養(yǎng)室。這表明在低剪切力條件下，培養(yǎng)基和藥物能夠得到充分灌注。此模擬結(jié)果為后續(xù)在低剪切力條件下對細(xì)菌動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的長期監(jiān)測提供了理論基礎(chǔ)和驗(yàn)證策略。此外，降低流速可以延長藥物的作用時(shí)間，減緩對大腸桿菌的作用速度，以便在更長的時(shí)間內(nèi)觀察到更多的細(xì)節(jié)變化。微柱結(jié)構(gòu)的長度不能無限制增加，至少物質(zhì)擴(kuò)散時(shí)間應(yīng)少于細(xì)菌分裂一代所需的時(shí)間。根據(jù)小分子（如氨基酸和蔗糖）擴(kuò)散公式（t=L2/D，t為擴(kuò)散時(shí)間，L為擴(kuò)散距離，D為擴(kuò)散常數(shù)（3×10-6～1×10-5cm2/s[29]）），在主管道與微室之間，物質(zhì)交換的時(shí)間為200～800 s， 與模擬結(jié)果基本一致。

圖3 不同流速下培養(yǎng)室的數(shù)值模擬圖：500 μL/min（A）和3 μL/min（B）灌注流速下通道內(nèi)渦旋流的分布情況（黑色箭頭代表捕獲室內(nèi)的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)軌跡；白色箭頭代表小培養(yǎng)室內(nèi)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)軌跡）Fig.3 Numerical simulation diagram of culture chamber at different flow rates: Vortex flow distribution in the channel at different operation flow rates of 500 μL/min(A) and 3 μL/min (B) (Black arrows represent the trajectories of bacteria captured in chamber;white arrow represents the trajectory of bacteria in culture chamber)

圖4 流速為3 μL/min 時(shí)藥物的擴(kuò)散效果模擬示意圖Fig.4 Schematic diagram of diffusion simulation of drug at a flow rate of 3 μL/min

2.2 大腸桿菌的培養(yǎng)

本研究在完成單克隆大腸桿菌TAc-IeGFP（E.coliTAc-IeGFP）菌液的制備后，繪制了熒光大腸桿菌的生長曲線（圖5），在0～27 h 內(nèi)，對菌液的光密度進(jìn)行了記錄（重復(fù)4 組）。由圖5 可知，生長階段大致分為4 個(gè)階段：從開始培養(yǎng)到2 h 為潛伏期，生長緩慢；從2 h 到12 h， 細(xì)菌生長處于指數(shù)期，細(xì)菌濃度呈直線增長的時(shí)間約為2 h；12 h 到24 h， 細(xì)菌生長處于平衡期，細(xì)菌濃度保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平；從24 h開始，細(xì)菌濃度略有下降的趨勢，細(xì)菌生長進(jìn)入衰亡期。在可控差異范圍內(nèi)，4 條曲線的趨勢及菌液光密度無明顯差異。為了減小因菌密度變化導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度誤差，本實(shí)驗(yàn)在灌注時(shí)選用培養(yǎng)12 h 處于穩(wěn)定期的菌液，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠。

圖5 大腸桿菌TAc-IeGFP 的生長曲線圖Fig.5 Growth curve of Escherichia coli (E. coli) TAc-IeGFP

2.3 大腸桿菌在芯片中的長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)

文獻(xiàn)[30]表明，采用60 μL/min 的流速實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞聚焦，有利于保持細(xì)胞的原始形態(tài)。本研究參照計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果，選擇在500 μL/min 流速下灌注OD600=0.5 的菌液，在3 μL/min 流速下灌注培養(yǎng)基和藥物。雖然500 μL/min 的流速偏高，但持續(xù)時(shí)間較短，在進(jìn)口處未觀察到剪切力對細(xì)菌造成傷害，菌液和藥物也均可在培養(yǎng)室周圍均勻分布。另外，菌液可在10 min 內(nèi)完成灌注，灌注時(shí)間和灌注效果明顯優(yōu)于文獻(xiàn)[18，31]。由圖6A 和6B 中0 h 時(shí)的數(shù)據(jù)可知，芯片內(nèi)接種細(xì)菌后，菌密度相對較小。在灌注后采用低流速（3 μL/min）動(dòng)態(tài)灌注LB 液體培養(yǎng)基，以保證在不影響芯片內(nèi)細(xì)菌生長條件和位置的前提下，對細(xì)菌進(jìn)行基本營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充和代謝廢物的排出。動(dòng)態(tài)培養(yǎng)72 h 時(shí)，菌群已充滿整個(gè)培養(yǎng)室并縱向疊加排布，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號。這表明此培養(yǎng)芯片可以滿足動(dòng)態(tài)培養(yǎng)細(xì)菌、篩選藥物和高通量富集等實(shí)驗(yàn)需求。進(jìn)一步對大腸桿菌在芯片中的繁殖過程進(jìn)行了熒光量化分析，由圖6C 可見，經(jīng)過長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)后，大腸桿菌長勢良好。24 h 時(shí)培養(yǎng)室入口細(xì)菌分布最密集，而動(dòng)態(tài)培養(yǎng)72 h 后，培養(yǎng)室中間的細(xì)菌密度和活性均最高。上述結(jié)果進(jìn)一步證明本研究構(gòu)建的低剪切力微流控芯片可進(jìn)行細(xì)菌的長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，為后續(xù)CHA 的抑菌實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

圖6 大腸桿菌TAc-IeGFP 在微流控芯片中分別培養(yǎng)0、24 和72 h 后的（A）明場圖、（B）倒置熒光顯微鏡下的熒光圖和（C）熒光量化分析圖Fig.6 (A) Bright-field images, (B) fluorescence images under inverted fluorescence microscope and(C)quantitative analysis of fluorescence image of E.coli TAc-IeGFP in microfluidic chips after incubation for 0,24 and 72 h, respectively

2.4 CHA在芯片中對大腸桿菌的抑菌作用

本研究采用微流控芯片平臺，利用熒光強(qiáng)度的變化評估熒光標(biāo)記的大腸桿菌的生長狀況[32]，并考察了3 mg/mL CHA 對其中培養(yǎng)的大腸桿菌的抑菌作用。結(jié)果如圖7 所示，與CHA 作用2 h 左右，處于培養(yǎng)室進(jìn)口邊緣區(qū)域的大腸桿菌的綠色熒光強(qiáng)度下降，表明其生長受到抑制；與CHA 作用4 h，培養(yǎng)室內(nèi)的大腸桿菌綠色熒光強(qiáng)度繼續(xù)下降，說明CHA 持續(xù)抑制其生長；與CHA 作用6 h，培養(yǎng)室內(nèi)的大腸桿菌熒光已非常微弱，表明其生長已被完全抑制；再經(jīng)過約0.5 h，培養(yǎng)室內(nèi)綠色熒光全部消失。結(jié)果表明，CHA 在6.5 h 左右能夠完全抑制大腸桿菌TAc-IeGFP 的生長。大腸桿菌的熒光強(qiáng)度逐步降低，說明CHA對其生長具有持續(xù)的抑制作用。

圖7 綠原酸（CHA，3 mg/mL）作用2、4、6 和6.5 h 后對大腸桿菌TAc-IeGFP 的抑菌效果：（A）明場圖；（B）倒置熒光顯微鏡下的熒光圖；（C）熒光量化分析圖Fig.7 Antibacterial effect of chlorogenic acid (CHA) after incubation with E.coli TAc-IeGFP for 2, 4, 6 and 6.5 h, respectively: (A) Bright field image; (B) Fluorescence image under inverted fluorescence microscope;(C) Quantitative analysis of fluorescence image

2.5 傳統(tǒng)方法與芯片檢測CHA抑菌效果的對比研究

作為對照實(shí)驗(yàn)，采用傳統(tǒng)的肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法檢測了不同濃度CHA 對大腸桿菌的抑菌效果。利用肉湯稀釋法可以大致確定CHA 的MIC，依次將不同濃度的CHA 溶液以及培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液加入96 孔板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜態(tài)培養(yǎng)，每間隔2 h，通過酶標(biāo)儀測其OD600值，用于定量分析細(xì)菌種群，使用前在培養(yǎng)管中生長時(shí)，OD600=0.5（經(jīng)多次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在2 h 時(shí)600 nm 處的吸光度值變化不顯著，而在4 h 時(shí)測得的吸光度值變化顯著，因此選擇培養(yǎng)4 h 后的吸光度值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的CHA 能夠顯著抑制大腸桿菌TAc-IeGFP 的生長，并且抑制作用隨CHA 濃度增加而增強(qiáng)，CHA 在該稀釋梯度下的MIC 大致在2.5～3.75 mg/mL 之間（圖8），與文獻(xiàn)[32]的結(jié)果一致。但該方法與微流控芯片法相比，需要在標(biāo)準(zhǔn)的96 孔板中使用繁瑣的稀釋步驟，并且非常耗時(shí)。

圖8 大腸桿菌TAC-leGF 暴露在不同濃度CHA 中的生長曲線Fig.8 Growth curves of E.coli TAc-IeGFP exposed to different concentrations of CHA

采用紙片擴(kuò)散法研究不同濃度的CHA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液對大腸桿菌的抑菌效果，如圖9 所示，CHA 濃度為1.25～10 mg/mL 時(shí)，未表現(xiàn)出抑菌效果。因此，采用微流控芯片研究CHA 的抑菌效果具有更高的靈敏度和更短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。Jain 等[33]也得出了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究表明，不同的藥敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，這進(jìn)一步表明紙片擴(kuò)散法用于藥敏性檢測時(shí)評價(jià)結(jié)果具有不準(zhǔn)確性，宏觀和微觀形態(tài)學(xué)觀察存在差異。因此，運(yùn)用微流控技術(shù)進(jìn)行藥敏性檢測具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

圖9 大腸桿菌TAc-IeGFP 在瓊脂板上與不同濃度的CHA（1.25～10 mg/mL）、硫酸卡那霉素（Kana）和氨芐青霉素（Amp）培養(yǎng)24 h 后的抑菌圈圖像Fig.9 Images of E.coli TAc-IeGFP inhibition zone on culture plates after incubation with different concentrations of CHA (1.25-10 mg/ml), kanamycin (Kana) and ampicillin (Amp) for 24 h

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)的低剪切力微流控芯片能夠在高流速下產(chǎn)生渦旋流，對大腸桿菌進(jìn)行高效捕獲和培養(yǎng)。當(dāng)液流處于低流速時(shí)，其低剪切力不會對微室中捕獲的細(xì)菌產(chǎn)生擾動(dòng)，因此適合長期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)及給藥觀察。利用流動(dòng)的液體培養(yǎng)基對大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，能更好地模擬大腸桿菌在體內(nèi)的生長環(huán)境，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具真實(shí)性。在熒光顯微鏡下，通過微流控芯片觀察不同時(shí)間段內(nèi)大腸桿菌的整體數(shù)量和熒光強(qiáng)度的變化，從微觀角度更直觀和具體地分析藥物的抑菌作用。此外，通過傳統(tǒng)抑菌方法研究了CHA 對大腸桿菌TAc-IeGFP 的抑菌作用。相較于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，利用微流控芯片研究藥物的抑菌作用具有更多的優(yōu)勢。首先，微流控芯片提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，縮短了檢測時(shí)間，可在約6.5 h 內(nèi)完成藥敏性檢測。此外，傳統(tǒng)抑菌實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)人力和材料，造成資源浪費(fèi)。因此，利用微流控芯片進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)具有良好的發(fā)展前景。