‘金標(biāo)’玉簪組培快繁技術(shù)研究

謝樹章 楊小艷 吳 紅 韓 垚

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級重點實驗室，重慶 401329）

玉簪屬（HostaTratt.）是百合科多年生宿根草本植物，因花型形似古人頭飾玉簪而得名，耐陰耐寒[1]，品種繁多，株型大小各異，葉片的形狀、大小、顏色、紋理和質(zhì)地等各不相同[2-3]，被廣泛應(yīng)用于園林地被、花境和盆栽觀賞，是重要的觀花觀葉的陰生植物[4-5]。近年來隨著玉簪屬植物園林綠化應(yīng)用的增多，玉簪特別是新培育或新引進的玉簪新品種由于母株資源較少，且傳統(tǒng)方法繁殖速度慢，難以滿足市場需求[6-7]。通過離體組織培養(yǎng)的方式繁育玉簪種苗，可快速繁殖大量優(yōu)質(zhì)種苗，保持玉簪親本的優(yōu)良性狀[8]，育苗周期短，出苗一致性高[9-10]，同時可減少土地占用及人力物力消耗、避免病蟲危害[11-12]，具有很好的經(jīng)濟效益和應(yīng)用前景。目前已有研究人員對‘金鷹’玉簪[13]、‘大父’玉簪[7]、‘藍(lán)天使’玉簪[14]、‘翠鳥’玉簪[15]等開展離體組織培養(yǎng)技術(shù)研究，結(jié)果表明不同玉簪品種適宜的不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根的培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)劑配比組合有較大差異，玉簪組培快繁可能受基因型的影響較大。‘金標(biāo)’玉簪，屬中型玉簪，葉片心形至卵形，葉質(zhì)較厚，葉心黃色，邊緣綠色，花紫色，花期7—9 月，耐寒、耐陰，地下莖粗壯，分蘗能力強，長勢繁茂，是少有的黃心綠邊花葉優(yōu)良玉簪品種，其組織培養(yǎng)技術(shù)研究尚未見報道。本研究以幼嫩腋芽為外植體，建立‘金標(biāo)’玉簪組培快繁體系，為‘金標(biāo)’玉簪種苗快速繁殖規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試玉簪品種‘金標(biāo)’玉簪取材自重慶寰宇金禾園藝有限公司花卉基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒處理 選取長勢健壯、葉片色澤亮的優(yōu)良植株，以其幼嫩腋芽作為試驗材料，先用洗衣粉泡洗，在流水下沖洗1～2 h。然后置于70%乙醇溶液中浸泡處理30 s，倒掉70%乙醇溶液后，用滅菌水沖洗2次。再用0.1% HgCl2溶液加2滴Tween-20 分別消毒5、10、15、20 min，并不斷搖動。將HgCl2溶液倒出，用滅菌水沖洗5～6次，用無菌濾紙吸干水分后將腋芽外包葉片剝掉，切取帶生長點分生組織接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+（3 mg/L 6-BA）+(0.10 mg/L NAA)+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂中，每個處理接種20瓶，每瓶接種2個外植體材料，及時觀察外植體污染情況并記錄，60 d后統(tǒng)計外植體污染率、存活率和死亡率及不定芽生長情況。

污染率（%）＝（污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100；

死亡率（%）＝（未污染但腋芽褐化死亡的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100；

存活率（%）＝（未污染且腋芽正常的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同濃度6-BA 和NAA 組合誘導(dǎo)培養(yǎng)基，命名為Y1、Y2、Y3、Y4。將消毒處理好的腋芽外包葉片剝掉，切取帶生長點芽組織，接種到Y(jié)1～Y4培養(yǎng)基中，溫度25 ℃，光照強度2 500～3 000 lx，光暗交替12 h，每個處理接種20 瓶，每瓶接種2 個腋芽，觀察外植體生長發(fā)育狀態(tài)，60 d 后統(tǒng)計叢生芽誘導(dǎo)情況。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 設(shè)置不同濃度6-BA 和NAA組合的繼代增殖培養(yǎng)基，命名為A1～A9培養(yǎng)基。切下增殖的叢生芽，接種到以下培養(yǎng)基MS+（2、3、4 mg/L 6-BA）+（0.05、0.10、0.20 mg/L NAA）+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂中。每個處理接種4瓶，每1瓶接種5 個芽塊，3 次重復(fù)。光照強度為2 500～3 000 lx，光暗交替12 h，溫度25 ℃，40 d 后統(tǒng)計增殖情況。計算公式：增殖系數(shù)=新芽數(shù)/接種數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 挑取健壯繼代芽苗接至生根培養(yǎng)基G1～G7中壯苗生根，每個處理接種1盒，每盒接種50株苗，3次重復(fù)。光照強度為2 500～3 000 lx，光暗交替12 h，溫度25 ℃。每天觀察并記錄組培苗生根時間（試驗處理內(nèi)部超過50%組培苗生根的時間），30 d后統(tǒng)計生根情況，確定最佳生根培養(yǎng)基。生根率（%）=（生根苗數(shù)/接種數(shù)）×100；平均根數(shù)（%）=（總根數(shù)/生根苗數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的消毒處理與誘導(dǎo)培養(yǎng)

0.1 % HgCl2溶液不同的處理時間對玉簪腋芽的消毒效果不同（表1）。

由表1 可見，玉簪腋芽在0.1% HgCl2溶液處理5 min 的消毒效果最差，污染率達(dá)到77.5%。隨著處理時間的增加，污染率顯著降低，在20 min時外植體污染率降至12.5%；外植體死亡率隨著0.1% HgCl2溶液消毒時間的增長而上升，說明0.1% HgCl2溶液處理時間過長會對外植體造成毒害作用，故外植體玉簪腋芽用0.1% HgCl2溶液消毒處理時間選為15 min 較佳，污染率可控制在15.0%，存活率達(dá)到75.0%，同時腋芽正常萌發(fā)，基部微膨大，不定芽逐漸出現(xiàn)。

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

玉簪腋芽接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隨著時間推移，腋芽基部逐漸膨大，然后出現(xiàn)不定芽，各個處理誘導(dǎo)玉簪腋芽產(chǎn)生不定芽的效果不同（表2）。

表2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基不定芽生長情況統(tǒng)計

由表2 可見，外植體在Y1～Y4培養(yǎng)基的上的不定芽誘導(dǎo)率在85.0%～90.0%，在Y2培養(yǎng)基上最高，誘導(dǎo)率達(dá)到90%；從不定芽的生長情況對比，不定芽的質(zhì)量和生長速度差異明顯，在Y1和Y2培養(yǎng)基上不定芽生長正常，健壯，且在6-BA 為5 mg/L的Y2培養(yǎng)基上不定芽生長出芽時間短，速度快。當(dāng)NAA 濃度為1.00 mg/L 時，不定芽生長受到影響，偏小，且生長緩慢，生長勢較弱，部分出現(xiàn)輕微玻璃化。因此，選擇MS+（5 mg/L 6-BA）+（0.50 mg/L NAA）培養(yǎng)基作為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基較為合適。

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

由表3 可以看出，植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 和NAA 的不同配比對玉簪叢生芽增殖影響很大。在6-BA 在5 mg/L 時新生芽都較小較弱，在4 mg/L 時增殖系數(shù)較高，同時芽苗也較正常。另一方面，NAA 在濃度在0.25 和0.50 mg/L 時，芽苗生長正常，比較健壯，同時繁殖系數(shù)也較高。隨著NAA 濃度的繼續(xù)增加，芽變?nèi)?，矮化，基部出現(xiàn)愈傷，甚至玻璃化，葉片黃化。綜合考慮，培養(yǎng)基A6上的芽苗健壯（圖1），叢生芽增殖數(shù)較多，增殖系數(shù)達(dá)到4.12，是比較理想的繼代增殖培養(yǎng)基。

表3 不同繼代增殖培養(yǎng)基叢生芽生長情況統(tǒng)計

2.4 生根培養(yǎng)

本研究把NAA 和IBA 單獨使用用于誘導(dǎo)組培苗生根，從表4可看出，不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的G1培養(yǎng)基上，組培苗生根時間較長，且生根率較低。而添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理G2～G7能提高生根率，加快生根速度，與對照相比達(dá)到顯著水平。在G4和G7培養(yǎng)基中，部分組培苗基部出現(xiàn)了輕微玻璃化，影響了新根的質(zhì)量，后續(xù)移栽時也會造成移栽成活率下降。而在G3培養(yǎng)基中（圖1），出根時間短，組培苗生根率達(dá)到96.67%，平均根數(shù)達(dá)到5.76，故確定G3培養(yǎng)基作為玉簪組培苗生根壯苗培養(yǎng)基使用。

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對玉簪組培苗生根的影響

3 結(jié)論

玉簪組織培養(yǎng)的外植體一般選用腋芽和花器官作為外植體材料，馮慧等[16]采用花葶作為外植體材料，污染率較低，再生出不定芽，建立了玉簪花器官植株再生體系，但由于花器官受生長季節(jié)影響，取材時間受限，而腋芽叢生法以其操作簡便，繁殖速度快，可保持遺傳穩(wěn)定性的優(yōu)勢廣泛用于園藝、農(nóng)林果樹等林木植物的組培繁殖[17-18]。在本研究中，通過幼嫩腋芽作為外植體材料，可在春季開展試驗，通過篩選確定0.1% HgCl2溶液最佳消毒時間為15 min，控制外植體污染率在15%以內(nèi)。

植物激素的配比對芽的誘導(dǎo)啟動和增殖均有顯著影響，其中6-BA 為細(xì)胞分裂素，具有促進細(xì)胞分裂和擴大、誘導(dǎo)芽的分化作用，NAA 為生長素，具有促進植物伸長生長的作用[19-20]。本研究利用6-BA和NAA 的組合誘導(dǎo)‘金標(biāo)’玉簪外植體直接分化出不定芽，不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)階段，遺傳性狀穩(wěn)定，繼而4 mg/L 6-BA 和0.50 mg/L NAA 配合使用，有效促進了叢生芽增殖，芽健壯且長勢快。一般來講，無機鹽濃度低，有利于根的生長[21]，本研究采用1/2 MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加IBA或NAA均能有效誘導(dǎo)玉簪生根，這與郝硯英、陳必勝等［22-23］研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究篩選了適合‘金標(biāo)’玉簪腋芽的消毒處理方法：最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+（5 mg/L 6-BA）+（0.50 mg/L NAA），最佳的叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基MS+（4 mg/L 6-BA）+（0.50 mg/L NAA），最佳的生根培養(yǎng)基1/2 MS+（0.50 mg/L IBA）。通過應(yīng)用上述技術(shù)體系本實驗室已生產(chǎn)‘金標(biāo)’玉簪組培苗近3 萬株，采用草炭∶珍珠巖（3∶1）作為基質(zhì)移栽至128 孔育苗盤中，根據(jù)環(huán)境條件進行適時噴淋和遮陰，最終移栽成活率達(dá)到94.5%，初步建立了‘金標(biāo)’玉簪組培快繁體系，可為‘金標(biāo)’玉簪進行種苗繁殖規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。