趙海霞 劉林昊 曹盼盼

(河南省省立醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

糖尿病腎病是糖尿病患者的重要并發(fā)癥之一,腎小管損傷是糖尿病腎臟病變的一個(gè)重要方面,而腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥是腎小管損傷產(chǎn)生的重要原因〔1,2〕。因此,防治糖尿病腎病的機(jī)制之一可能是阻滯高糖環(huán)境下人腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子的分泌。證據(jù)表明環(huán)狀RNA(circRNA)與某些腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),可能參與多種腎臟疾病的病理過程,可以作為腎臟疾病的新生物標(biāo)記〔3〕。circ溴結(jié)構(gòu)域PDH指轉(zhuǎn)錄因子(BPTF)是衍生自BPTF外顯子的新型環(huán)狀RNA,研究報(bào)道敲減circBPTF通過靶向miR-384/LIN28B軸可減輕高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥性損傷和氧化應(yīng)激〔4〕。敲除circBPTF可通過miR-31-5p/RAB27A軸抑制膀胱癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)〔5〕。但circBPTF對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響尚不清楚。microRNA已被認(rèn)為是糖尿病性腎病發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器,2型糖尿病患者中miR-98-5p表達(dá)水平降低〔6〕。miR-98-5p通過靶向Hmga2可減輕糖尿病腎病的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎纖維化〔7〕。且miR-98-5p過表達(dá)抑制了氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡〔8〕。miR-98-5p將脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變?yōu)镸2巨噬細(xì)胞極化,并通過上調(diào)tribbles假激酶(Trib)1抑制炎癥〔9〕。但目前尚不清楚miR-98-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響及其與circBPTF的靶向關(guān)系。本研究探討circBPTF對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響及對(duì)miR-98-5p的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM培養(yǎng)基(上海恒斐生物);腎小管上皮細(xì)胞(美國sciencell);si-circBPTF、anti-miR-98-5p、miR-98-5p及其陰性對(duì)照表達(dá)載體質(zhì)粒(杭州鷹旸生物);熒光定量PCR試劑盒(上海吉瑪制藥);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒〔亞科因(武漢)生物〕;蛋白提取試劑盒(美國Epigentek);凋亡檢測(cè)試劑盒(日本同仁研究所);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國BioAssay Systems)。

1.2細(xì)胞處理與分組 腎小管上皮細(xì)胞用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),作為高糖(HG)組;用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為正常對(duì)照(Con)組;將si-NC、si-circBPTF、miR-NC、miR-98-5p轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞后,用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),記為HG+si-NC組、HG+si-circBPTF組、HG+miR-NC組、HG+miR-98-5p組;將si-circBPTF分別與anti-miR-98-5p、anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞后,用含25mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),記為HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p組、HG+si-circBPTF+anti-miR-NC組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)測(cè)定circBPTF和miR-98-5p表達(dá) 用TRIzol試劑根據(jù)制造商的方案從各組細(xì)胞中提取總RNA,對(duì)于miRNA和mRNA的逆轉(zhuǎn)錄,分別使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)制造商的說明合成cDNA。在ABI 7300系統(tǒng)上使用SYBR Green PCR試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)方案對(duì)miRNA和mRNA進(jìn)行熒光定量PCR,分別以GAPDH和U6為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計(jì)算circBPTF和miR-98-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6水平 各組處理后收集上清液,在2 000 r/min下離心20 min。根據(jù)試劑盒說明,使用TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒分析TNF-α、IL-6的濃度。

1.5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 細(xì)胞(1×106)用胰蛋白酶消化,收獲并在冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌,在500 μl結(jié)合緩沖液中,用5 μl的碘化丙啶(PI)和10 μl的膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)在黑暗中染色10 min。采用EPICS XL-MCL FACScan采集熒光信號(hào),并用FlowJo 8.7.1軟件進(jìn)行分析。

1.6Western印跡評(píng)估蛋白表達(dá) 用放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)裂解緩沖液加蛋白酶抑制劑提取總蛋白,使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒定量蛋白。裂解物中的蛋白質(zhì)在10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離,電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,然后在室溫下在5%脫脂牛奶溶液中阻斷1 h。B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗在4 ℃下孵育過夜,然后用相應(yīng)的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的山羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h,用電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化。用ImageJ軟件對(duì)蛋白片段強(qiáng)度進(jìn)行定量。GAPDH為內(nèi)參。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circBPTF和miR-98-5p的靶向關(guān)系 使用StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預(yù)測(cè)circBPTF和miR-98-5p之間的潛在結(jié)合。將circBPTF的野生型(WT)和突變型(MUT)3′-UTR序列分別克隆到含有熒光素酶報(bào)告基因的pGL3啟動(dòng)子載體中。將腎小管上皮細(xì)胞接種到24孔板中,培養(yǎng)至約70%的匯合度時(shí),用LipofectamineTM3000將miR-NC、miR-98-5p與circBPTF WT或MUT熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞,使用熒光素酶報(bào)告基因試劑盒進(jìn)行分析,將熒光素酶報(bào)告基因活性歸一化為海腎熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1circBPTF和miR-98-5p在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與Con組比較,HG組circBPTF表達(dá)水平顯著增高,miR-98-5p表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 circBPTF和miR-98-5p在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2抑制circBPTF表達(dá)影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷 與Con組比較,HG組腎小管上皮細(xì)胞IL-6、TNF-α、凋亡率及蛋白Bax表達(dá)顯著升高,蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下降(P<0.05);與HG+si-NC組比較,HG+si-circBPTF組IL-6、TNF-α水平、凋亡率和蛋白Bax表達(dá)顯著下降,蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增高(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

1～4:Con組、HG組、HG+si-NC組、HG+si-circBPTF組;圖2同圖1 抑制circBPTF表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡蛋白的影響

圖2 抑制circBPTF表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的影響

表2 抑制circBPTF表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響

2.3circBPTF與miR-98-5p結(jié)合 StarBase軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示circBPTF與miR-98-5p具有互補(bǔ)的核苷酸位點(diǎn)。見圖3。miR-98-5p與WT-circBPTF共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降(P<0.05),miR-98-5p與MUT-circBPTF共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。與pcDNA組(1.00±0.06)比較,pcDNA-circBPTF組miR-98-5p表達(dá)(0.53±0.04)顯著下降;與si-NC組比較(1.02±0.06),si-circBPTF組miR-98-5p表達(dá)(3.15±0.21)顯著增加(F=934.888,P<0.05)。見表3。

圖3 circBPTF含有與miR-98-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4miR-98-5p過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響 與HG+miR-NC組比較,HG+miR-98-5p組IL-6、TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率及蛋白Bax表達(dá)顯著下降,蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增高(P<0.05)。見圖4、表4、圖5。

1～4:HG+miR-NC組、HG+miR-98-5p組、HG+si-circBPTF+anti-miR-NC組、HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p組;圖5同圖4 各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

圖5 各組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表4 miR-98-5p過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響

2.5下調(diào)miR-98-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circBPTF表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用 與HG+si-circBPTF+anti-miR-NC組比較,HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p組IL-6、TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率及蛋白Bax表達(dá)顯著增高,蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5、表5。

表5 下調(diào)miR-98-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circBPTF表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

腎小管上皮細(xì)胞可分泌多種炎癥因子進(jìn)入腎間質(zhì),加重腎間質(zhì)的炎癥和纖維化進(jìn)程,從而促進(jìn)腎臟疾病的進(jìn)展〔10〕。研究表明,circRNA的失調(diào)與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的病理生理密切相關(guān)〔11〕。研究報(bào)道,circ_0003928的干擾通過miR-151-3p/膜聯(lián)蛋白(Anx)a2減輕了HK-2細(xì)胞中高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥〔12〕。敲除circACTR2可降低高葡萄糖誘導(dǎo)的近端腎小管細(xì)胞的炎癥和纖維化〔13〕。本研究提示,抑制circBPTF表達(dá)可降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

研究報(bào)道,miR-98-5p通過抗凋亡和抗氧化應(yīng)激保護(hù)小鼠免受腦缺血/再灌注損傷〔14〕。氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中miR-98-5p的表達(dá)下調(diào);敲除lncRNA OIP5-AS1通過miR-98-5p/高遷移率族蛋白(HMG)B1軸可誘導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡,炎癥損傷和氧化應(yīng)激損傷〔15〕。敲低lncRNA TTTY15可通過調(diào)節(jié)miR-98-5p/CRP軸減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔16〕。本研究說明,過表達(dá)miR-98-5p抑制了高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)circBPTF靶向下調(diào)miR-98-5p表達(dá);且下調(diào)miR-98-5p逆轉(zhuǎn)了抑制circBPTF表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。