陳倩倩,趙紫琰,徐海洋,徐淋香

(1.江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,江蘇 連云港 222005;2.江蘇海洋大學海洋食品與生物工程學院,江蘇 連云港 222005;3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005;4.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇 連云港 222005)

天然的果聚糖(fructan)包括左聚糖(levan)和菊粉(inulin)。左聚糖來源于單子葉植物和微生物,在鴨茅等禾本科以及菊科、百合科等多種植物中作為一種儲存糖類來提供碳源和能量,但是含量較少,主要由微生物產(chǎn)酶催化蔗糖聚合而成[1]。左聚糖是由D-果糖構成的多糖,主鏈以β-2,6糖苷鍵連接,部分含有β-2,1連接支鏈,末端含一個葡萄糖殘基,具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性,亦有抗氧化、抗腫瘤、消炎、降膽固醇、降血糖等生物活性,被廣泛應用于食品、醫(yī)療、化妝品等領域[2-3]。

左聚糖降解酶(levan-degrading enzyme)是一類能水解β-2,6-D-果聚糖果糖苷鍵的酶。有3種類型,且同屬于糖苷水解酶32家族(glycosyl hydrolases family 32),分別為左聚糖酶(levanase)[EC3.2.1.65]、左聚糖生物水解酶(β-2,6-fructan 6-levanbiohydrolase,LF2ase)[EC3.2.1.64]、左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶(levan fructotransferase,LFTase)[EC4.2.2.16]。左聚糖酶將高分子量的左聚糖水解成短鏈的左聚糖型低聚果糖,左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶是將左聚糖催化水解,從左聚糖為底物的非還原端切下2個果糖,通過分子間脫水,形成雙果糖酐IV,而左聚糖生物水解酶將左聚糖催化生成果二糖或果糖[4]。

1 左聚糖降解酶的來源及性質(zhì)

1.1 來源

左聚糖降解酶主要來源于微生物,尤其是細菌,對植物來源的左聚糖降解酶報道較少。2020年,Huang等[5]發(fā)現(xiàn)玉米中存在一種特異性水解左聚糖的外切水解酶,在植物生長和抵御細菌時發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。到目前為止,已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了來自各種微生物的左聚糖降解酶,并對其進行了研究。據(jù)不完全統(tǒng)計,細菌的假單胞菌屬[6]、鏈霉菌屬[7-9]、固氮菌屬[10-11]、芽孢桿菌屬[12-15]、擬桿菌屬[16]、嗜熱菌[17]、微桿菌屬[18-19]、節(jié)桿菌屬[20-21],以及真菌的紅酵母屬[22]皆是左聚糖降解酶的來源,其中對芽孢桿菌屬的左聚糖降解酶研究較多。

1.2 性質(zhì)

3種左聚糖降解酶的主要酶學性質(zhì)見表1。左聚糖降解酶的最適溫度一般為30～50 ℃,在50 ℃以下較穩(wěn)定。但源于Rhodotorulasp.的左聚糖酶在4 ℃時具有78%的最大活性且相當穩(wěn)定,而在25 ℃和40 ℃時,殘余活性分別只有43%和35%,在70 ℃時完全失活,則該左聚糖酶屬于低溫酶。大多數(shù)左聚糖降解酶的最適pH為酸性,在5.0～6.5之間,僅少數(shù)左聚糖降解酶的最適pH為中性。來源于Pseudomonassp. No.43和Streptomycessp. 366L的外切左聚糖酶的最適pH為7.0,來源于Microbacteriumsp. AL-210的左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶的最適pH也為中性,且這3種不同來源的酶均在堿性條件下保持穩(wěn)定,Microbacteriumsp. AL-210的左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶和Pseudomonassp. No.43的外切左聚糖酶在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定,Streptomycessp. 366L的外切左聚糖酶在pH 7.0～10.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。不同來源或不同類型的左聚糖降解酶,不但能降解左聚糖,而且能降解含有β-2,1-糖苷鍵的菊粉、蔗糖、棉子糖等。例如:源于Gluconacetobacterdiazotrophicus的外切左聚糖酶不僅水解左聚糖,而且水解蔗糖、菊粉和棉子糖;Thermophilic bacteria的左聚糖酶水解左聚糖、蔗糖和麥芽糖;Rhodotorulasp.的左聚糖酶能水解左聚糖、蔗糖和菊粉;Bacillussp.No.71的內(nèi)切左聚糖酶水解左聚糖和梯牧草糖;MicrobacteriumlaevaniformansATCC 15953的左聚糖生物水解酶能催化水解左聚糖、菊粉、蔗果三糖和蔗果四糖;StreptomycesexfoliatusF3-2的左聚糖生物水解酶能水解左聚糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖;ArthrobacterureafaciensK2032的左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶能催化左聚糖、蔗果三糖和蔗果四糖。

表1 左聚糖降解酶酶學性質(zhì)

2 左聚糖降解酶的結(jié)構

已報道的左聚糖降解酶(levanase、LF2ase和LFTase)均屬于糖苷水解酶32家族。此家族有共同的三維結(jié)構特征:由N-端5-折疊β-螺旋漿形成的催化結(jié)構域和C-端β-折疊片形成的非催化結(jié)構域組成,N-端每個螺旋漿包括4個反向平行的β-折疊片,形成經(jīng)典的‘W’拓撲結(jié)構,輻射狀圍繞著中心軸,封閉帶負電荷的催化活性口袋。每個β-折疊片之間由發(fā)卡環(huán)連接,每個螺旋漿的β-折疊片1離中心軸最近,并與中心軸平行。整個N-端結(jié)構域的形狀類似圓柱形,每個螺旋漿β-折疊片4位于圓柱筒的最外面。C-端非催化結(jié)構域由2個反向平行的β-折疊片組成,每個β-折疊片包括6股β-折疊線,組裝成類似三明治的結(jié)構[23],見圖1。

圖1 左聚糖降解酶的三維結(jié)構

3 左聚糖降解酶的應用

3.1 左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)雙果糖酐IV中的應用

雙果糖酐(DFAs)是一種天然的功能性食品添加劑,由于其甜度遠低于蔗糖,并且結(jié)構穩(wěn)定,在高溫和極端pH下也能保持穩(wěn)定,對于糖尿病患者來說,雙果糖酐是一種極好的甜味劑[24]。雙果糖酐IV是雙果糖酐的一種,由左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶催化水解左聚糖生成,雙果糖酐IV和雙果糖酐Ⅲ具有相同的生理功能,都是不能被腸道消化吸收的寡糖,這些糖被腸道微生物利用,轉(zhuǎn)化為有機酸(乙酸、丁酸和乳酸),從而降低盲腸內(nèi)的pH值,增強鈣的溶解度,達到增強腸道對鈣的吸收的目的[25-26]。利用左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶來生產(chǎn)雙果糖酐IV是最理想可行的方法。2000年,Song等[21]在土壤中分離到能夠產(chǎn)左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶的微生物——ArthrobacterureafaciensK2032,利用酶法生產(chǎn)雙果糖酐IV、低聚果糖和果糖,其轉(zhuǎn)化率約為62.5%。Cha等[19]在土壤樣品中發(fā)現(xiàn)了Microbacteriumsp. AL-210,此細菌可產(chǎn)生左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶,并且雙果糖酐IV是該左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶的主要產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化率約為44%。Kikuchi等[27]以蔗糖為原料,利用SerratialevanicumNN來生產(chǎn)左聚糖,使ArthrobacternicotinovoransGS-9在大腸桿菌中高度表達,通過ArthrobacternicotinovoransGS-9的左聚糖果糖轉(zhuǎn)移酶將左聚糖一罐轉(zhuǎn)化制備成雙果糖酐IV,由于面包酵母不能發(fā)酵雙果糖酐IV,因此使用酵母發(fā)酵來去除雙果糖酐IV以外的所有糖,雙果糖酐IV的產(chǎn)率高達90.7%,這種不需要分離左聚糖的一罐轉(zhuǎn)化制備方法的優(yōu)勢亦被證實。

3.2 左聚糖酶及左聚糖生物水解酶在低聚果糖生產(chǎn)中的應用

低聚果糖可作為益生元來調(diào)節(jié)人體腸道微生物菌群的組成,改善腸道環(huán)境,從而維持身體健康和治療疾病,在食品領域具有巨大的市場潛力[28]。由于缺乏可用的植物來源的左聚糖,Porras-Domínguez等[13]首先以蔗糖為原料,利用來源于Bacillussubtilis的左聚糖蔗糖酶生成左聚糖,其次,用Bacilluslicheniformis的內(nèi)切左聚糖酶水解左聚糖,即可得到左聚糖型低聚果糖,缺點是廣泛的水解會使果二糖成為主要產(chǎn)物。為了能夠一體化、大量生產(chǎn)左聚糖型低聚果糖,研究者采用一種基于左聚糖蔗糖酶和內(nèi)切左聚糖酶同時作用的方法高效生產(chǎn)左聚糖型低聚果糖。H?evels等[11]將來源于AzotobacterchroococcumDSM 2286的左聚糖酶基因與GluconobacterjaponicusLMG 1417的左聚糖蔗糖酶基因在大腸桿菌內(nèi)共表達,大腸桿菌粗提取物利用蔗糖進一步合成左聚糖型低聚果糖。該方法不但成本低,而且效率高,已成功應用于左聚糖型低聚果糖的生產(chǎn)。Rahman等[29]利用一種無載體固定化技術提高了左聚糖酶的穩(wěn)定性,為左聚糖型低聚果糖的生產(chǎn)奠定了基礎。在制備交聯(lián)左聚糖酶聚集體的過程中加入牛血清白蛋白交聯(lián)劑比加入戊二醛交聯(lián)劑得到的固定化酶活力回收率高,從而獲得的左聚糖型低聚果糖也較高。因此,所制備的牛血清白蛋白交聯(lián)左聚糖酶聚合物偶聯(lián)體可以用于生產(chǎn)低聚果糖,以滿足各個領域的市場需求。果二糖也是一種左聚糖型低聚果糖。Saito等[20]發(fā)現(xiàn)StreptomycesexfoliatusF3-2可以產(chǎn)生一種外切酶,研究發(fā)現(xiàn)該外切酶不僅能水解β-2,6-糖苷鍵,而且能水解β-2,1-糖苷鍵,主要水解產(chǎn)物為果二糖。經(jīng)鑒定,該酶是一種能生產(chǎn)果二糖的左聚糖生物水解酶。Song等[18]將MicrobacteriumlaevaniformansATCC 15953左聚糖生物水解酶基因克隆,并在大腸桿菌內(nèi)表達,經(jīng)純化,該重組酶的主要產(chǎn)物為果二糖。因此,利用水解酶來生產(chǎn)低聚果糖有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 展望

左聚糖降解酶的發(fā)現(xiàn)在食品領域具有里程碑的意義。近年來,對于左聚糖降解酶的應用研究主要集中在低聚果糖的生產(chǎn)方面,對雙果糖酐IV和果二糖的報道較少。左聚糖型低聚果糖的一些生物學功能可以滿足工業(yè)需求及市場需求,但是實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)并非易事。不同來源的左聚糖降解酶的活性差異大,且分離純化困難,大大限制了左聚糖降解酶在工業(yè)中的應用,酶分子生物學改造技術能提高酶活力和穩(wěn)定性,有望解決左聚糖降解酶在工業(yè)生產(chǎn)中的問題。因此,對左聚糖降解酶進行深入研究,使其滿足工業(yè)生產(chǎn)條件,仍是研究的熱點。