時(shí)間與功率對(duì)BL21大腸桿菌超聲破碎效果的影響

鄢樹(shù)楓,王鈺坪,吳珊濤,王曉媛,戴心如

(三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院,福建 三明365004)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種原核生物,革蘭氏染色反應(yīng)呈紅色,在自然界中分布廣泛,主要寄居在人和動(dòng)物的腸道等部位[1-2]。大腸桿菌由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、表達(dá)效率高、易培養(yǎng)、分子操作簡(jiǎn)單和副產(chǎn)物表達(dá)量少等特性,常作為科研生產(chǎn)中原核表達(dá)宿主菌,廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中,因而受到眾多研究者的親睞[3-5]。

胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取純化首先要對(duì)大腸桿菌進(jìn)行高效破碎。大腸桿菌的破碎方法主要可分為機(jī)械法和非機(jī)械法,常見(jiàn)的機(jī)械法主要包括勻漿法、研磨法和超聲波破碎法等,非機(jī)械法主要有滲透法、酶溶法和凍溶法等,各種破碎方法均有其最佳適用范圍及其優(yōu)缺點(diǎn)[6]。超聲破碎法破碎細(xì)胞具有速度快、操作方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),更適合于實(shí)驗(yàn)室使用,短時(shí)間即可完成一個(gè)樣品處理,成本低廉[7]。超聲波在液體中的空化效應(yīng)會(huì)形成空化泡,空化泡不斷擴(kuò)大或突然崩解,使細(xì)胞壁裂開(kāi)或破碎,以達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。梁蕊芳[8]等通過(guò)研究不同菌種濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌在不同超聲功率、超聲時(shí)間下的細(xì)胞破碎效果,證明超聲破碎對(duì)幾種常見(jiàn)菌體均有良好的破碎效果。值得注意的是,使用超聲破碎細(xì)胞的影響因素較多,尤其是超聲破碎可能會(huì)對(duì)可溶性蛋白和包涵體的得率造成影響,這是由于在超聲破碎過(guò)程中超聲波的作用較為劇烈,可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性等方面造成影響[9]。趙燁清等[10]在研究中發(fā)現(xiàn),超聲破碎法可能使可溶性蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀,這使得后續(xù)的蛋白質(zhì)分離純化更加復(fù)雜,需要額外的復(fù)性環(huán)節(jié)。余雁等[11]研究了超聲波破碎方法中各種物理參數(shù)及其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌破碎的影響,證明超聲破碎的系列參數(shù)對(duì)破碎效果具有顯著的影響作用。彭贊國(guó)等[12]以超聲、高壓勻漿和化學(xué)滲透法破碎重組大腸桿菌,研究了超聲功率、菌體體積、菌體濃度對(duì)超聲破碎的影響,證明超聲破碎受到多種因素的調(diào)控,這些因素對(duì)超聲破碎的效果具有直接的調(diào)控作用。菌體破碎是目標(biāo)蛋白分離純化的首要步驟,超聲破碎產(chǎn)生的局部高溫可能使破碎后釋放的蛋白質(zhì)變性,對(duì)后續(xù)的蛋白質(zhì)提取和純化環(huán)節(jié)有顯著影響[13]。

BL21(DE3)是大腸桿菌表達(dá)菌株,以T7 RNA 聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主,已廣泛應(yīng)用于各類蛋白表達(dá),其破碎效果的優(yōu)劣能夠顯著影響后續(xù)蛋白質(zhì)的表達(dá)純化效果[14]。然而,當(dāng)前BL21大腸桿菌的超聲破碎影響因素研究不足,尤其是BL21大腸桿菌的超聲破碎效果與功率的相關(guān)性研究有待深入。因此,研究不同功率對(duì)BL21大腸桿菌超聲破碎的效果,探究其最佳的破碎功率和時(shí)間,對(duì)于蛋白質(zhì)的表達(dá)純化具有重要意義。本研究以BL21大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)宿主菌,研究不同功率對(duì)其超聲破碎的效果,設(shè)置不同時(shí)間和功率梯度對(duì)大腸桿菌BL21進(jìn)行超聲破碎,并獲取其胞內(nèi)蛋白質(zhì),通過(guò)蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)及考馬斯亮藍(lán)(Bradford法)測(cè)定蛋白質(zhì)含量,進(jìn)而評(píng)價(jià)大腸桿菌BL21的超聲破碎效果,以期為大腸桿菌超聲破碎的研究和應(yīng)用提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)相關(guān)化學(xué)試劑胰蛋白胨、氯化鈉、酵母提取物、Tris-HCl、甘油、考馬斯亮藍(lán)G-250、乙醇等主要購(gòu)買于阿爾法化工有限公司、西格瑪奧德里公司和上海碧云天生物科技有限公司。大腸桿菌BL21(DE3)菌種由中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化、復(fù)蘇及其生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將從- 80℃冰箱中取出的菌種轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈工作臺(tái)中,將其在含有3 mL液體培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行接種,采用封口膜封口,放置于恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng),同時(shí)試管要保持傾斜,溫度為37℃,轉(zhuǎn)速為220 rpm,過(guò)夜培養(yǎng)16～18 h。隔天對(duì)菌種進(jìn)行分裝凍存,并取適量菌用于生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。

取2.5 mL已復(fù)蘇菌液,將其在含有100 mL LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基的錐形瓶中進(jìn)行接種,混合均勻后,放置于恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng),溫度為37℃,轉(zhuǎn)速為220 r/min。取一空白的培養(yǎng)基3 mL置于比色皿中,作為分光光度計(jì)空白對(duì)照。設(shè)定合理間隔時(shí)間,分別取2 mL菌液測(cè)600 nm處的吸光度值(OD600nm),記錄數(shù)據(jù),測(cè)滿24 h。根據(jù)所得數(shù)據(jù),繪制BL21菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 菌體收集

如上述方法接種適量菌液(100 mL),于OD600nm達(dá)到0.6時(shí),加入0.1 mmol/L誘導(dǎo)劑異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá),于搖床中持續(xù)培養(yǎng)18 h。將完成過(guò)夜培養(yǎng)的菌種倒入離心管中進(jìn)行收菌,于離心機(jī)中以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,使菌體和培養(yǎng)液分離。離心完成后用移液槍吸棄上清液,保留沉淀,將沉淀置于冰上保存,維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

1.2.3 超聲破碎

將上述獲得的菌體沉淀用30 mL預(yù)冷的裂解緩沖液重懸,得到的菌液濃度經(jīng)計(jì)算為3.772×109cfu/mL(OD600nm=1.886)。重懸時(shí)注意要充分將菌體重懸,避免因菌塊存在導(dǎo)致后續(xù)破碎效果下降。重懸后將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,置于超聲破碎儀中進(jìn)行破碎。為避免在超聲破碎過(guò)程中蛋白質(zhì)因局部高溫變性,將待破碎的菌液管放置于裝有冰塊的燒杯中。設(shè)置破碎模式為破碎1 s,間隔1 s。每次破碎后的菌液均取1 mL裝入EP(eppendorf)管中待測(cè)。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組,分別以破碎時(shí)間和破碎功率為變量研究大腸桿菌BL21的超聲破碎效果,實(shí)驗(yàn)組如表1。

表1 BL21超聲破碎實(shí)驗(yàn)組

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)(蛋白質(zhì)濃度儀檢測(cè)法與考馬斯亮藍(lán)染色法)

將超聲破碎完成后得到的各實(shí)驗(yàn)組EP管菌液放置于高速離心機(jī)中,以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,使蛋白上清液與細(xì)胞碎片分離。離心后,將上清液轉(zhuǎn)移至另一新EP管中保留,棄去沉淀。

蛋白質(zhì)濃度儀檢測(cè)法。使用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)各組上清液樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度檢測(cè),測(cè)試三次計(jì)算平均值,記錄數(shù)據(jù)。

考馬斯亮藍(lán)染色法。從前述獲得的蛋白質(zhì)上清液中取15 μL加入至準(zhǔn)備好的500 μL考馬斯亮藍(lán)G-250工作液,混勻,觀察顏色及其與對(duì)照管的區(qū)別。分別從各組染色混合液取1 mL,加入2 mL蒸餾水稀釋,充分混合,并測(cè)量其于595 nm處的吸光度值(考馬斯亮藍(lán)染色后的特征吸收峰,OD595nm),測(cè)試3次,計(jì)算平均值,記錄數(shù)據(jù)。對(duì)照組以515 μL考馬斯亮藍(lán)G-250工作液和2 mL蒸餾水混合,作為分光光度計(jì)的參比溶液。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線

取適量大腸桿菌BL21進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定,不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量菌液的OD600nm值,記錄數(shù)據(jù),繪制BL21菌株的生長(zhǎng)曲線。由圖1可知,接種后,0～2 h是大腸桿菌BL21的生長(zhǎng)延滯期(復(fù)蘇期),該階段菌體增殖分裂較為緩慢,正在適應(yīng)新環(huán)境并復(fù)蘇其狀態(tài);3～10 h是大腸桿菌BL21的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,該階段菌體增長(zhǎng)迅速,呈“對(duì)數(shù)”型增長(zhǎng),此時(shí)菌體在快速增殖分裂,菌活力也在快速提高;11 h左右后,菌數(shù)量與菌活力接近達(dá)到最大值;繼續(xù)培養(yǎng)后,受限于培養(yǎng)基消耗、菌瓶容量等生長(zhǎng)環(huán)境因素,其生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期,逐步減慢增殖分裂速度。以上實(shí)驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)化大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線,證明實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌BL21能夠維持較好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì),滿足后續(xù)蛋白質(zhì)表達(dá)及實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 大腸桿菌BL21的生長(zhǎng)曲線

2.2 BL21超聲破碎實(shí)驗(yàn)組1的結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組1設(shè)定,探究大腸桿菌BL21在破碎功率5%、遞增時(shí)間為1 min時(shí)的破碎效果。由圖2可知,上清液蛋白質(zhì)濃度和大腸桿菌BL21的破碎時(shí)間呈近似線性關(guān)系(正相關(guān))。上清液蛋白質(zhì)濃度隨破碎時(shí)間增加而增加。圖3的實(shí)驗(yàn)組1破碎上清液的蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果與蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定結(jié)果相吻合,其藍(lán)色程度隨破碎時(shí)間增加而逐漸加深,證明上清液中蛋白質(zhì)含量亦逐漸提高。

圖2 實(shí)驗(yàn)組1中破碎上清液的蛋白質(zhì)濃度

圖3 實(shí)驗(yàn)組1中破碎上清液的蛋白質(zhì)的 考馬斯亮藍(lán)染色

2.3 BL21超聲破碎實(shí)驗(yàn)組2的結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組2的設(shè)定,探究大腸桿菌BL21在破碎功率5%、遞增時(shí)間為3 min時(shí)的破碎效果。由圖4可知,上清液蛋白質(zhì)濃度和大腸桿菌BL21的破碎時(shí)間呈近似線性關(guān)系(正相關(guān)),上清液中蛋白質(zhì)濃度隨破碎時(shí)間增加而逐步遞增。由圖5可知,實(shí)驗(yàn)組2破碎上清液的蛋白質(zhì)經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在595 nm處的吸光度值(OD595nm)隨破碎時(shí)間而增加。這個(gè)結(jié)果表明,隨破碎時(shí)間增加,上清液中考馬斯亮藍(lán)染色程度更深,上清液中蛋白質(zhì)含量亦逐漸提高。

圖4 實(shí)驗(yàn)組2中破碎上清液的蛋白質(zhì)濃度

圖5 實(shí)驗(yàn)組2中破碎上清液經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在595nm處的吸光度值(OD595nm)

2.4 BL21超聲破碎實(shí)驗(yàn)組3的結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組3的設(shè)定,探究大腸桿菌BL21在破碎功率5%、遞增時(shí)間為5 min時(shí)的破碎效果。由表2可知,破碎功率為5%時(shí),隨破碎時(shí)間增加,上清液蛋白質(zhì)濃度也增加,蛋白質(zhì)濃度和破碎時(shí)間呈正相關(guān)。并且在前20 min破碎時(shí)蛋白質(zhì)濃度上升趨勢(shì)較大。20 min后蛋白質(zhì)濃度的上升趨勢(shì)減緩,可能原因?yàn)榇藭r(shí)菌體已大部分破碎完成,待破碎的菌量較少。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在595 nm處的吸光度值(OD595nm)的變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)濃度結(jié)果相一致,在5～15 min階段上升明顯,15～30 min出現(xiàn)波動(dòng)。該結(jié)果與前述的實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的結(jié)果相吻合,進(jìn)一步證明大腸桿菌BL21的破碎效果即上清液蛋白質(zhì)濃度與破碎時(shí)間呈正相關(guān)。

表2 實(shí)驗(yàn)組3中破碎上清液的蛋白質(zhì)濃度及OD595nm

2.5 BL21超聲破碎實(shí)驗(yàn)組4的結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組4的設(shè)定,探究大腸桿菌BL21分別在破碎功率1%、3%和9%時(shí)的破碎效果(固定1 min破碎時(shí)間),結(jié)果如表2,圖4所示。

結(jié)合表3、圖6～7可知,固定1 min破碎時(shí)間時(shí),大腸桿菌BL21的破碎效果與破碎功率呈正相關(guān)關(guān)系,功率為1%時(shí),蛋白質(zhì)濃度為509.4 μg/mL;功率為3%時(shí),蛋白質(zhì)濃度為576.8 μg/mL;功率為9%時(shí),蛋白質(zhì)濃度為641.8 ug/ml,呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)。各組別經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在595nm處的吸光度值(OD595nm)的變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)濃度的結(jié)果相一致,隨破碎功率的遞增(1%,3%,9%),考馬斯亮藍(lán)染色后的OD595 nm值亦逐步遞增,表明破碎功率的提升有助于獲得更多的上清液蛋白,該結(jié)果與前述的實(shí)驗(yàn)組1、2和3的結(jié)果相吻合,證明大腸桿菌BL21的破碎效果與破碎時(shí)間、破碎功率呈正相關(guān)。

圖6 實(shí)驗(yàn)組4中破碎上清液的蛋白質(zhì)濃度

圖7 實(shí)驗(yàn)組4中破碎上清液經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在595nm處的吸光度值(OD595nm)

表3 實(shí)驗(yàn)組4中破碎上清液的蛋白質(zhì)濃度及OD595nm

3 結(jié)論

本文以BL21大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)宿主菌,研究不同時(shí)間和功率梯度對(duì)其超聲破碎效果的影響。研究結(jié)果表明,超聲功率對(duì)大腸桿菌BL21破碎效果有明顯影響,破碎功率固定為5%時(shí),破碎效果與破碎時(shí)間呈正比,菌充足的情況下,破碎時(shí)間越長(zhǎng)其破碎效果越好;當(dāng)破碎時(shí)間固定為1 min時(shí),破碎功率從1%、3%和9%逐級(jí)遞增時(shí),其超聲破碎效果亦逐漸提升,證明破碎效果與破碎功率呈線性關(guān)系。