鹽、堿脅迫下水稻種子萌發(fā)過程水分含量變化及對種子發(fā)芽影響的低場核磁檢測研究

楊洪偉 張麗穎 李曉輝

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，110866，遼寧沈陽；2 遼寧省農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心，110866，遼寧沈陽；3 遼寧省水稻研究所，110161，遼寧沈陽）

鹽堿脅迫是影響農(nóng)作物生長發(fā)育的主要非生物脅迫之一。根據(jù)第二次土壤普查可知，我國目前鹽堿地面積約3.47×107hm2（5.2 億畝）[1-2]，土地鹽堿化嚴重阻礙了作物產(chǎn)量的提高，已經(jīng)成為限制農(nóng)業(yè)經(jīng)濟增長的重要因素。前人[3-4]研究表明，土壤鹽化和堿化常常同時發(fā)生，但并非相同的非生物脅迫，二者對作物的傷害機理不同，作物在2 種脅迫下的響應(yīng)機制也明顯不同。因此，分別研究鹽、堿脅迫下作物的響應(yīng)機制對作物抗鹽堿育種理論研究以及指導(dǎo)鹽堿地區(qū)作物生產(chǎn)等具有重要意義。

水稻是我國的主要糧食作物，是全球約50%人口的主糧，全球30%以上的水田受到不同程度的鹽堿化影響。水稻種子萌發(fā)期是成苗的關(guān)鍵期，極易受到鹽堿脅迫的影響。因此，研究鹽堿脅迫對種子萌發(fā)的影響對于水稻品種篩選具有重要意義。目前，前人[5-6]研究內(nèi)容主要集中在混合鹽堿脅迫對幼苗光合作用、礦質(zhì)營養(yǎng)吸收、滲透調(diào)節(jié)及離子平衡和DNA 響應(yīng)等方面，而對鹽、堿脅迫下水稻種子萌發(fā)期水分變化的研究相對較少。

本文以水稻種子為研究對象，以低場核磁共振弛豫譜為技術(shù)手段，通過對比相同濃度NaCl 和NaHCO3脅迫處理下水稻種子萌發(fā)72h 過程中發(fā)芽指標(biāo)的變化，分析在鹽、堿脅迫下水稻種子萌發(fā)過程中的水分吸收及遷移規(guī)律，為抗鹽堿水稻品種培育和篩選等方面的研究提供無損檢測方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種選用耐鹽堿性較強的鹽粳48 和耐鹽堿性較弱的遼星1，種子年份為2017 年，由遼寧省水稻研究所提供。核磁共振儀（型號：MiNiMR-60，磁場強度0.5T，上海紐邁電子科技有限公司），HPG-280BX 光照培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9023MBE（上海博訊實業(yè)有限公司）。

化學(xué)試劑為NaCl、NaHCO3、NaClO 和蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本制備及處理 試驗于2017-2018 年在北京國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心種子品質(zhì)檢測實驗室進行，利用光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)皿種子發(fā)芽試驗。挑選籽粒飽滿、大小一致的鹽粳48（YJ48）、遼星1（LX1）種子各6000 粒，每組20 粒，共300 組，用于檢測不同萌發(fā)時期種子核磁共振信號及鮮、干質(zhì)量。另取2 個品種水稻種子樣本各1000 粒，每組100 粒，用于種子發(fā)芽試驗，以上每個處理均設(shè)置10 個重復(fù)。試驗前，先對種子進行消毒處理，用3%NaClO 溶液浸泡種子3～5min。然后用蒸餾水沖洗3～5 次并用吸水紙吸干表面水分，均勻放置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿上書寫對應(yīng)標(biāo)記。分別用蒸餾水、50、150mmol/L NaCl 及50、150mmol/L NaHCO3溶液對各組樣本進行萌發(fā)處理，溶液用量以浸濕濾紙和種子為宜。將各組樣本置于溫度為27℃±1℃的HPG-280BX 光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，設(shè)置12h 光照和12h 無光照交替模式。每日更換濾紙和溶液，并記錄各組樣本發(fā)芽種子個數(shù)，直到第7 天為止。

式中，Gt為第t天發(fā)芽種子的數(shù)量，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2 水稻種子樣本核磁共振信號采集 每次進行核磁共振試驗前，都需要利用標(biāo)準(zhǔn)油樣進行系統(tǒng)校準(zhǔn)。首先執(zhí)行軟件的FID 序列，標(biāo)定中心頻率及90°、180°脈寬。然后，通過CPMG 序列檢測樣本的核磁共振信號，并將系統(tǒng)采集到的信號平均值導(dǎo)入核磁反演軟件，以獲得樣本的橫向弛豫時間（T2）反演譜，通過分析T2反演譜中代表種子樣本中包含的束縛水和自由水核磁信號幅值，可以得出水稻種子萌發(fā)過程中水分組成及變化規(guī)律。

1.2.3 水稻種子樣本鮮、干質(zhì)量檢測 將初始及分別萌發(fā)至6、24、48、72h 的水稻種子樣本從培養(yǎng)皿中取出，首先用蒸餾水沖洗3～5 次，然后用吸水紙吸干其表面水分，稱重，將各組質(zhì)量平均值作為該組樣本的鮮質(zhì)量，然后將其放入干燥箱中，105℃殺青30min，80℃烘干至恒重，稱重，將各組質(zhì)量平均值作為該組樣本干質(zhì)量。

1.2.4 水稻種子樣本濕基含水率NMR 檢測方法的建立 核磁共振T2反演譜各個峰面積之和與被測樣本中包含的氫質(zhì)子數(shù)量成正比，而氫質(zhì)子主要來源于樣本中的水分子，因此每組樣本的T2反演譜峰面積之和即代表了該組樣本的水分含量多少。利用1.2.2 和1.2.3 檢測的每組樣本核磁信號幅值、鮮質(zhì)量（Wf）和干質(zhì)量（Wd），可以求出該組樣本的濕基含水率（MC），計算公式為：

由此可以通過回歸分析推導(dǎo)出單位質(zhì)量種子樣本核磁共振信號幅值與MC的線性回歸方程。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用核磁反演軟件和SPSS 19.0 進行試驗數(shù)據(jù)分析與處理。文中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異達到顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 和NaHCO3脅迫處理對水稻種子發(fā)芽的影響

如表1 所示，NaCl 和NaHCO3脅迫對水稻種子的發(fā)芽指標(biāo)影響顯著（P＜0.05），與對照處理相比，2 個水稻品種脅迫條件下平均發(fā)芽時間延長，發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率降低。與對照處理相比，鹽粳48在50、150mmol/L NaCl 脅迫下，平均發(fā)芽時間分別延長了0.77 和1.00d，發(fā)芽指數(shù)分別降低了6.26%和8.45%，發(fā)芽率分別降低了0.00%和1.33%；在50、150mmol/L NaHCO3脅迫下，平均發(fā)芽時間分別延長了0.94 和1.14d，發(fā)芽指數(shù)分別降低了8.65%和10.39%，發(fā)芽率分別降低了2.50%和5.83%。遼星1 在50 和150mmol/L NaCl 脅迫下，平均發(fā)芽時間分別延長了0.55 和1.91d，發(fā)芽指數(shù)分別降低了4.52%和10.86%，發(fā)芽率分別降低了0.00%和4.67%；在50 和150mmol/L NaHCO3脅迫下，平均發(fā)芽時間分別延長了1.33 和2.03d，發(fā)芽指數(shù)分別降低了6.61%和11.07%，發(fā)芽率分別降低了1.33%和9.67%。

表1 NaCl 和NaHCO3 脅迫處理下水稻種子發(fā)芽指標(biāo)對比Table 1 Comparison of germination indexes of rice seed under NaCl and NaHCO3 stress

2.2 NaCl 和NaHCO3 脅迫下束縛水和自由水核磁信號幅值的變化特征

圖1～2 為反演頻率值=10 000 時，不同濃度NaCl 和NaHCO3脅迫下鹽粳48 種子0～72h 的T2反演譜對比圖，橫坐標(biāo)表示T2，其值越小代表水分子與其他物質(zhì)結(jié)合越緊密，縱坐標(biāo)表示核磁信號強度。從圖1～2 中可以看出，不同處理下，鹽粳48種子不同萌發(fā)時間的反演譜均呈現(xiàn)出2 個波峰，由核磁原理可知，短弛豫時間（大峰）代表束縛水信號幅值，長弛豫時間（小峰）代表自由水信號幅值。隨著萌發(fā)時間延長，束縛水和自由水信號幅值均逐漸增長，相比對照處理，同樣脅迫處理下，脅迫濃度越大，束縛水和自由水信號幅值增長幅度越小。萌發(fā)相同時間后，相同濃度NaHCO3脅迫處理下束縛水和自由水增長幅度大于NaCl 脅迫處理。通過表2～3 可以看出，相比鹽粳48，遼星1 種子在對照處理下，萌發(fā)6、24、48 和72h 后，束縛水核磁信號幅值增長率（A21）分別降低21.39%、26.73%、19.53%和18.73%，自由水核磁信號幅值增長率（A22）分別降低41.90%、81.27%、202.34%和351.78%；50mmol/L NaCl 脅迫處理下，A21分別降低18.06%、27.90%、20.78%和20.42%，A22分別降低31.87%、66.03%、168.03%和287.15%；150mmol/L NaCl脅迫處理下，A21分別降低17.17%、25.73%、13.10%和17.99%，A22分別降低35.18%、66.62%、50.32%和239.51%。50mmol/L NaHCO3脅迫處理下，A21分別降低19.44%、28.03%、23.23%和20.92%，A22分別降低35.57%、69.78%、180.00%和259.33%；150mmol/L NaHCO3脅迫處理下，A21分別降低19.06%、26.10%、12.55%和16.50%，A22分別降低36.98%、69.20%、206.86%和270.27%。

圖1 NaCl 脅迫處理下單位質(zhì)量鹽粳48 種子T2 反演譜Fig.1 T2 inversion spectrum of per unit mass YJ48 seeds under NaCl stress

圖2 NaHCO3 脅迫處理下單位質(zhì)量鹽粳48 種子T2 反演譜Fig.2 T2 inversion spectrum of per unit mass YJ48 seeds under NaHCO3 stress

表2 NaCl 和NaHCO3 脅迫下單位質(zhì)量鹽粳48 種子核磁共振信號幅值（A21 and A22）Table 2 NMR signal amplitude(A21 and A22)per unit mass YJ48 under NaCl and NaHCO3 stress

表3 NaCl 和NaHCO3 脅迫下單位質(zhì)量遼星1 種子核磁共振信號幅值A(chǔ)21 and A22Table 3 NMR signal amplitude(A21 and A22)per unit mass LX1 under NaCl and NaHCO3 stress

2.3 NaCl 和NaHCO3 脅迫對萌發(fā)過程水稻種子核磁信號幅值的影響

通過表2～3 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在對照處理和不同濃度NaCl、NaHCO3脅迫下，2 個品種在0～72h 萌發(fā)過程中，核磁信號幅值（A21，A22）均極顯著增長（P＜0.01），因核磁信號幅值可以代表種子中相對水分含量，可知水稻種子萌發(fā)過程中水分逐漸增長。以鹽粳48 為例，相比初始狀態(tài)，萌發(fā)6、24、48、72h 后，對照處理下，核磁信號幅值依次增長了71.83%、102.20%、125.17%和146.10%。50mmol/L NaCl 脅迫處理下，核磁信號幅值依次增長了66.22%、101.54%、124.95%和144.04%。150mmol/L NaCl 脅迫處理下，核磁信號幅值依次增長了65.88%、100.39%、117.75%和124.77%。50mmol/L NaHCO3脅迫處理下，核磁信號幅值依次增長了67.85%、102.16%、125.12%和145.56%。150mmol/L NaHCO3脅迫處理下，核磁信號幅值依次增長了67.59%、101.04%、119.01%和133.27%。

2.4 NaCl、NaHCO3 脅迫對2 個品種核磁信號幅值影響的比較

NaCl 和NaHCO3脅迫處理下，2 個品種種子萌發(fā)72h 過程中核磁信號幅值不斷增長，相比對照處理，核磁信號幅值增長幅度顯著降低（P＜0.05），但萌發(fā)相同時間后，NaHCO3脅迫處理下核磁信號幅值增長幅度均大于NaCl 脅迫處理（圖3a～d）。以鹽粳48 為例，由表2 可知，50 和150mmol/L 脅迫下，萌發(fā)6h 后，NaHCO3處理比NaCl 處理核磁信號幅值分別提高1.71%和1.63%。萌發(fā)24h 后，NaHCO3處理比NaCl 處理核磁信號幅值分別提高0.62%和0.65%。萌發(fā)48h 后，NaHCO3處理比NaCl處理核磁信號幅值分別提高0.17%和1.26%。萌發(fā)72h 后，NaHCO3處理比NaCl 處理核磁信號幅值分別提高1.52%和8.50%。

圖3 NaCl 和NaHCO3 脅迫下單位質(zhì)量鹽粳48 種子萌發(fā)6、24、48、72h 后核磁信號幅值對比Fig.3 Comparison of NMR signal amplitude of per unit mass YJ48 seeds after germination 6,24,48,72h under NaCl and NaHCO3 stress

2.5 NaCl、NaHCO3 脅迫下核磁信號幅值與水稻種子濕基含水率的關(guān)系

在對照和不同濃度NaCl、NaHCO3脅迫處理下，對2 個品種0～72h 萌發(fā)過程核磁信號幅值的檢測可以看出，核磁信號幅值不斷增長，這與通過烘干稱重法得出的MC具有一致的增長趨勢。利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件進行回歸分析，NaCl 和NaHCO3脅迫處理下，2 個品種單位質(zhì)量核磁信號幅值與MC具有較為一致的線性關(guān)系（圖4～5）。以鹽粳48 為例，在NaCl 脅迫處理下，回歸方程為y=218.05x+4235（R2=0.9675），對回歸方程進行顯著性檢驗，F(xiàn)=3815.27，P＜0.05，達到顯著水平。在NaHCO3脅迫處理下，回歸方程為y=229.56x+4185.4（R2=0.9556），對回歸方程進行顯著性檢驗，F(xiàn)=2754.11，P＜0.05，同樣達到顯著水平。

圖4 NaCl 脅迫下單位質(zhì)量鹽粳48 種子核磁信號幅值與MC 回歸分析Fig.4 Regression between MC and NMR signal amplitude of per unit mass YJ48 seeds under NaCl stress

圖5 NaHCO3脅迫下單位質(zhì)量鹽粳48 種子核磁信號幅值與MC 回歸分析Fig.5 Regression between MC and NMR signal amplitude of per unit mass YJ48 seeds under NaHCO3 stress

3 討論

3.1 脅迫條件下水稻種子萌發(fā)過程中水分含量變化對種子發(fā)芽的影響

NaCl 和NaHCO3脅迫下，2 個品種種子萌發(fā)相同時間后，核磁信號幅值增加幅度均小于對照處理，可見，鹽、堿脅迫抑制了水稻種子對水分的吸收，溶液濃度越高，抑制作用越強。這可能是因為脅迫處理下，溶液中離子濃度升高，滲透勢增強，因而水勢降低，導(dǎo)致進入種子內(nèi)的水分降低，水分降低引起種子內(nèi)的代謝緩慢，抑制了種子的萌發(fā)過程，同時毛細管的面積減少也使吸附的水分含量減少，鹽、堿濃度越高滲透勢越強，水勢越低，代謝活動越緩慢，需水量越少[7-8]。

NaCl 和NaHCO3脅迫下，2 個品種發(fā)芽率均顯著降低（P＜0.05），說明鹽、堿脅迫均抑制了種子的萌發(fā)過程，破壞了種子萌發(fā)正常的生理狀態(tài)。NaHCO3脅迫下水稻種子發(fā)芽率降低幅度大于NaCl 脅迫，說明堿脅迫對水稻種子的危害作用大于鹽脅迫[9-10]，但NaHCO3脅迫下核磁信號幅值降低幅度小于NaCl 脅迫，說明堿脅迫對水稻種子萌發(fā)的危害作用大于鹽脅迫并非吸水量降低所致，可能是除了滲透脅迫和離子毒害之外，堿脅迫比鹽脅迫具有更高的pH[11-12]。

3.2 脅迫條件下水稻種子萌發(fā)過程中水分含量變化

在對照處理、NaCl 和NaHCO3脅迫下，2 個品種在0～72h萌發(fā)過程中，核磁信號幅值均顯著增長，可知水稻種子萌發(fā)過程中水分逐漸增長。這是因為種子必須吸收足夠的水分萌發(fā)過程才能進行，前24h 屬于種子萌發(fā)的吸脹吸水階段，與種子代謝無關(guān)，吸水速度較快?？焖傥?，原生質(zhì)的水合程度趨向飽和，細胞膨壓增加，阻礙了細胞進一步吸水，因而24h 后吸水速度變慢。隨著細胞水合程度增加，酶促反應(yīng)與呼吸作用增強，種子內(nèi)的貯藏物質(zhì)開始分解變成可溶性化合物，這些可溶性分解產(chǎn)物被輸送到胚胎中，這一方面為胚胎發(fā)育提供了營養(yǎng)，另一方面也降低了胚胎細胞水勢，提高了胚胎細胞的吸水能力。在儲存養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和運輸?shù)幕A(chǔ)上，大量合成胚根和胚芽中核酸和蛋白質(zhì)等原生質(zhì)體的成分，增強了細胞的吸水性，進入生長和吸收階段。因而種子萌發(fā)過程中，核磁信號幅值不斷增長[13-14]。

在對照處理、NaCl 和NaHCO3脅迫下，萌發(fā)相同時間后，鹽粳48 的束縛水、自由水及總水分含量增長率均高于遼星1。由發(fā)芽率試驗可知，鹽粳48 的耐鹽堿性高于遼星1，可能是耐鹽堿性高的水稻品種在同樣處理下吸水率高于耐鹽堿性弱的品種[15-16]。

3.3 低場核磁檢測技術(shù)測定種子含水量的可行性

由低場核磁共振原理可知，T2與氫質(zhì)子的類型以及系統(tǒng)所處的物理和化學(xué)環(huán)境密切相關(guān)。因此，分析待測樣品的T2就可以分析出水分子與樣品中其他物質(zhì)的結(jié)合程度[17-19]。T2值越小，代表水分子與其他物質(zhì)結(jié)合程度越緊密，因此，可以根據(jù)T2分析出待測樣品中所含水分的相態(tài)。

當(dāng)核磁共振反演頻率值為10 000 時，在對照處理、NaCl 和NaHCO3脅迫下，鹽粳48 和遼星1 種子0～72hT2反演譜均呈現(xiàn)出2 個波峰，其包含峰面積越大表示氫質(zhì)子數(shù)越多，含水量越大[20-21]，由核磁共振原理可知，萌發(fā)期水稻種子中包含束縛水與自由水2 個相態(tài)水分，說明利用低場核磁共振弛豫譜能直觀揭示出種子萌發(fā)過程中不同相態(tài)水分及轉(zhuǎn)運規(guī)律。

4 結(jié)論

在對照處理、NaCl 和NaHCO3脅迫處理下，利用核磁共振技術(shù)檢測鹽粳48 和遼星1 種子萌發(fā)過程水分變化規(guī)律與利用傳統(tǒng)的烘干稱重法得出的水分變化規(guī)律是一致的，MC和核磁共振T2總幅值均具有一致的線性關(guān)系，說明利用核磁共振技術(shù)檢測鹽、堿脅迫下水稻種子的水分含量是合理可靠的。試驗為作物抗鹽堿育種研究及指導(dǎo)鹽堿地區(qū)作物生產(chǎn)提供理論支持和數(shù)據(jù)參考，同時為逆境下的作物水分含量及轉(zhuǎn)運規(guī)律無損檢測提供了一種新的方法。