抗獨(dú)特型抗體在半抗原免疫檢測(cè)中的應(yīng)用

杜凱 ， 張卓玲 ， 高莉 ， 何海華 ， 李婷華 ， 饒微

深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，廣東 深圳 518118

半抗原是一類由于自身分子量過(guò)小而無(wú)法刺激免疫應(yīng)答，必須偶聯(lián)載體蛋白才能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的小分子，這類小分子的檢測(cè)可以廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域。例如，甾體激素和甲狀腺激素半抗原被廣泛用于臨床診斷［1］；在食品安全和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，需要檢測(cè)水體、植物和微生物中的天然毒素、人工合成的農(nóng)藥和獸藥等半抗原［2-3］，這些方面的應(yīng)用都迫切需要一種能快速準(zhǔn)確檢測(cè)半抗原且對(duì)檢測(cè)人員和檢測(cè)環(huán)境要求低的方法。相對(duì)于色譜等傳統(tǒng)檢測(cè)手段，免疫檢測(cè)更契合這些需求。由于半抗原分子量?。ㄒ话悖?000 Da），通常缺少抗體結(jié)合的多個(gè)表位，因此半抗原的免疫檢測(cè)存在固有的局限性，限制了半抗原免疫檢測(cè)的分析模式［4-5］。目前，半抗原的主流檢測(cè)方法為競(jìng)爭(zhēng)法，該方法需要將半抗原與載體蛋白相偶聯(lián)再用于包被或標(biāo)記，其中涉及復(fù)雜的化學(xué)偶聯(lián)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致批間變異難以控制，這也是導(dǎo)致半抗原免疫檢測(cè)一致性差的主要因素［6-7］。同時(shí)，有些半抗原缺少可用于化學(xué)偶聯(lián)的官能團(tuán)，必須改變?cè)及肟乖慕Y(jié)構(gòu)，引入合適的化學(xué)基團(tuán)，但這種改變會(huì)影響半抗原的免疫反應(yīng)性。此外，在毒素免疫檢測(cè)試劑中需要用到具有毒性的偶聯(lián)物或標(biāo)準(zhǔn)品，這會(huì)給用戶、制造商和環(huán)境帶來(lái)較大的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，用表位模擬試劑（epitope mimicking reagents）替代半抗原及其偶聯(lián)物具有非常重要的意義與價(jià)值。

1 抗獨(dú)特型抗體的基本概念及其背景

抗獨(dú)特型抗體（anti-idiotype antibody，Ab2）指針對(duì)第一抗體（Ab1）分子可變區(qū)的獨(dú)特位（idiotope）產(chǎn)生的特異性抗體，獨(dú)特位即免疫球蛋白高變區(qū)上的單個(gè)抗原表位。Ab2可以分為3種亞型：Ab2α、Ab2β和Ab2γ［8］。其中，Ab2α識(shí)別抗體可變區(qū)的獨(dú)特位，該獨(dú)特位與互補(bǔ)位（paratope）是相互分開(kāi)的，因此Ab2α不會(huì)阻斷抗原結(jié)合；Ab2β則結(jié)合互補(bǔ)位，直接阻斷抗原的結(jié)合；Ab2γ的結(jié)合位置位于互補(bǔ)位或互補(bǔ)位附近，可能會(huì)因空間位阻干擾抗原結(jié)合（圖1）。外位抗體（epibody）和抗伴型抗體（anti-metatype antibody）是另外2種類型的Ab2，外位抗體既可以結(jié)合抗原表位，也可以結(jié)合Ab1的獨(dú)特位［9］，而抗伴型抗體只結(jié)合半抗原和Ab1形成的復(fù)合物。

圖1 Ab2的分類[8]Fig. 1 The classification of Ab2[8]

在一系列半抗原免疫檢測(cè)中，研究人員已經(jīng)開(kāi)始用Ab2作為半抗原偶聯(lián)物的替代試劑。Ab2的結(jié)合位點(diǎn)是Ab1的獨(dú)特位，大多研究聚焦于Ab2在疫苗或免疫治療中的應(yīng)用［10］，而在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用不多，主要原因在于Ab2的制備比較困難。目前，基于Ab2開(kāi)發(fā)的半抗原免疫檢測(cè)項(xiàng)目中已被商品化的產(chǎn)品較少。下文綜述了Ab2的制備方法，歸納了Ab2在不同模式半抗原免疫測(cè)定中的應(yīng)用，并討論了Ab2對(duì)不同分析性能的影響，以期對(duì)未來(lái)Ab2的制備及其在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

2 抗獨(dú)特型抗體的制備方法

Ab2的制備主要方法有3類：①通過(guò)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫的抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)，常用同種屬免疫（syngeneic immunisation）或異種屬免疫（xenogeneic immunisation）2類免疫方式；②通過(guò)駱駝免疫抗體庫(kù)或天然抗體庫(kù)篩選納米抗體；③通過(guò)合成抗體庫(kù)篩選單鏈可變區(qū)片段（single-chain fragment variable，scFv）。

目前，關(guān)于制備Ab2所用的免疫原、免疫方法和其他關(guān)鍵試劑的文獻(xiàn)報(bào)道較少，對(duì)于如何高效制備Ab2尚未形成相對(duì)一致的看法。Spkins等［11］在制備擬除蟲菊酯和百草枯的Ab2時(shí)發(fā)現(xiàn)，用Ab1-載體蛋白的偶聯(lián)物比單獨(dú)用Ab1能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。大多數(shù)研究人員采用以鑰孔血藍(lán)蛋白為載體蛋白的Ab1偶聯(lián)物進(jìn)行免疫接種，半抗原和載體蛋白之間采用戊二醛或1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS）偶聯(lián)方法，在較為溫和的偶聯(lián)環(huán)境中以確保Ab1互補(bǔ)位的結(jié)構(gòu)保持完整［12-13］。目前，最常用的免疫佐劑是弗氏佐劑，但Jones等［14-15］研究發(fā)現(xiàn)Gerbu佐劑比弗氏佐劑的生物相容性和穩(wěn)定性更好，產(chǎn)生針對(duì)Ab1的免疫應(yīng)答也大大增強(qiáng)。

本團(tuán)隊(duì)在開(kāi)發(fā)25-羥基維生素D、雌二醇和醛固酮非競(jìng)爭(zhēng)法試劑的過(guò)程中，嘗試用免疫小鼠方式制備針對(duì)半抗原和Ab1的抗伴型抗體［16］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，如果Ab1是鼠源性抗體，將其與半抗原孵育后的免疫效果不佳，而采用非鼠源性抗體和半抗原共孵育才可以獲得較好的免疫效果。采用弗氏佐劑乳化時(shí)，由于Ab1和半抗原形成的復(fù)合物可能在劇烈乳化條件下發(fā)生解離，因此在后續(xù)篩選中，針對(duì)Ab1和半抗原復(fù)合物新表位的抗伴型抗體陽(yáng)性率極低。陽(yáng)性率低的另一種原因可能是抗體結(jié)合抗原后引起的免疫復(fù)合物空間構(gòu)象變化較小，且半抗原大部分包埋于抗體內(nèi)部，難以形成新的有效抗原決定簇。此外，在篩選過(guò)程中，由于抗伴型抗體與Ab1以及半抗原組成的復(fù)合物相互之間接觸表面積較大，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫復(fù)合物空間構(gòu)象變化的精準(zhǔn)識(shí)別，從而造成較高的非特異性干擾。

從天然庫(kù)和合成多肽庫(kù)中篩選Ab2的主要難點(diǎn)在于庫(kù)容多樣性不高，難以篩到高親和力的克隆，且商業(yè)化的文庫(kù)成本高，難以獲得。一般來(lái)說(shuō)，需要用Ab1制備Ab2，但對(duì)于某些分子量很小的半抗原，難以制備半抗原偶聯(lián)物用于免疫和篩選時(shí)，可以采用Ab2直接制備抗-抗獨(dú)特型抗體，使其能識(shí)別原始的半抗原，以此制備的抗體與Ab1具有完全不同的結(jié)構(gòu)特征［17］。

3 抗獨(dú)特型抗體在免疫檢測(cè)中的分析模式

在Ab1的基礎(chǔ)上，結(jié)合不同亞類的Ab2可以實(shí)現(xiàn)一系列不同的半抗原免疫檢測(cè)模式，完成不同的分析性能指標(biāo)。

3.1 Ab2在競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)中的分析模式

在競(jìng)爭(zhēng)法中，半抗原主要用作標(biāo)準(zhǔn)品，也可用于制備包被抗原或者標(biāo)記抗原偶聯(lián)物。由于Ab2β模擬了半抗原并阻斷了其與Ab1的結(jié)合，因此在競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)中，可以用其替代包被抗原、競(jìng)爭(zhēng)抗原或標(biāo)準(zhǔn)品。例如，在真菌毒素免疫檢測(cè)中，Ab2常常作為毒素標(biāo)準(zhǔn)品的替代品，通過(guò)分別建立Ab2和毒素的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，再利用兩步轉(zhuǎn)換公式計(jì)算樣本濃度［18-20］。然而，使用Ab2作為替代標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)免疫檢測(cè)方法分析性能的影響不一。Shi等［18］將Ab2作為玉米赤霉烯酮的模擬物，建立了玉米赤霉烯酮的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，該方法相對(duì)于非獨(dú)特型抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA，工作范圍和靈敏度均稍有提高。Zhang等［19］用Ab2作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了赭曲霉毒素A的ELISA方法，其工作范圍比用赭曲霉毒素A作標(biāo)準(zhǔn)品更寬。Hu等［20］將Ab2替代黃曲霉毒素B1作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的檢測(cè)范圍有所變窄，由5～200 ng·mL-1變?yōu)?～100 ng·mL-1，而且當(dāng)將黃曲霉毒素B1添加到樣本中的濃度高于50 ng·mL-1時(shí)，回收率有明顯的下降趨勢(shì)。

除用于半抗原的ELISA檢測(cè)外，Ab2還廣泛用于表面等離子共振、微陣列、電生物芯片以及在免疫層析中作為包被試劑或檢測(cè)試劑［21-23］。Schulz等［24］應(yīng)用Ab2建立了一種同時(shí)檢測(cè)石房蛤毒素、微囊藻毒素LR、T2毒素、桿孢菌素A（roridin A）、黃曲霉毒素B1的電化學(xué)快速檢測(cè)方法。其中，檢測(cè)石房蛤毒素、微囊藻毒素LR和桿孢菌素A的Ab2包被在生物芯片上，另外2種毒素的Ab2則用于標(biāo)記半乳糖苷酶。該方法無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)雜的前處理，在13.4 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，對(duì)幾種毒素的檢出限為0.4～1.5 ng·mL-1，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Tang等［22］以Eu/Tb（Ⅲ）納米球作為標(biāo)記物，利用2種抗獨(dú)特型納米抗體開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)快速定量檢測(cè)黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的時(shí)間分辨熒光免疫層析方法。該研究比較了2種不同的競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式，一種是將針對(duì)小分子的單抗包被硝酸纖維素膜，納米抗體標(biāo)記納米球；另一種是將納米抗體包被硝酸纖維素膜，小分子單抗標(biāo)記納米球（圖2）。檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)于黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮來(lái)說(shuō)，后一種模式的靈敏度比前一種分別高18.3倍和20.3倍。

圖2 免疫層析競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)真菌毒素的2種模式Fig. 2 Two patterns of the competitive immunochromatographic assays for mycotoxin

最近有很多研究人員在半抗原免疫分析中將納米抗體作為Ab2。納米抗體可以作為模擬半抗原的有用工具，尤其是來(lái)源于駱駝天然抗體庫(kù)中的納米抗體。納米抗體體積小，具有較長(zhǎng)的互補(bǔ)決定區(qū)3（complementarity determining region，CDR3），相比傳統(tǒng)的抗原結(jié)合域具有更強(qiáng)的穿透性，更利于Ab2的篩選。

在半抗原免疫分析中，Ab2的親和力并非越高越好，免疫抗體庫(kù)篩選的Ab2分析性能通常不如天然文庫(kù)篩選的Ab2。采用比Ab1半抗原親和力低的Ab2作為包被抗原，能提升分析靈敏度［25-27］。Qiu等［28］從天然噬菌體展示庫(kù)中篩選到一株針對(duì)脫氧雪腐鐮孢霉烯醇Ab1的納米抗體，其對(duì)Ab1的親和力增強(qiáng)，反而使檢測(cè)靈敏度降低了7倍，另一株突變體降低了對(duì)Ab1的親和力，而檢測(cè)靈敏度有所增加［29］，這種現(xiàn)象可能是Ab2與半抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ab1的效果減弱導(dǎo)致的。免疫庫(kù)中篩選得到的Ab2，由于經(jīng)過(guò)體內(nèi)親和力成熟的過(guò)程，親和力常高于天然抗體庫(kù)中篩選的Ab2。Xiong等［30］評(píng)估了一系列針對(duì)桔青霉素Ab1的Ab2納米抗體的親和力，并將親和力最低的一株用作包被抗原，最高的一株用于替代標(biāo)準(zhǔn)品。這項(xiàng)研究表明，不同親和力的Ab2均有利用價(jià)值，應(yīng)避免只篩選高親和力的Ab2。在生物淘選過(guò)程中，降低Ab1包被濃度有利于篩選出親和力更高的Ab2，而增加Ab1的濃度則更適合篩選用于免疫檢測(cè)的Ab2。

3.2 Ab2在非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)中的分析模式

與采用同一Ab1的競(jìng)爭(zhēng)法相比，加入Ab2是否有助于檢測(cè)性能的提升取決于免疫檢測(cè)方法學(xué)的設(shè)計(jì)和Ab2自身的性質(zhì)。在非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)模式中，通過(guò)不同抗體的雙重識(shí)別可以提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。在同時(shí)應(yīng)用Ab2α和Ab2β的檢測(cè)模式中，當(dāng)半抗原結(jié)合到Ab1上后，Ab2α可以與Ab1的可變區(qū)結(jié)合。當(dāng)Ab2β與Ab1結(jié)合時(shí)，由于空間位阻阻斷了Ab2α的結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)Ab2α可以反映半抗原的濃度水平（圖3）。Kobayashi等［32］報(bào)道了1種測(cè)定11-脫氧皮質(zhì)醇的非競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫方法，首先將半抗原與一定量的融合蛋白scFv-ALP（scFv特異性識(shí)別11-脫氧皮質(zhì)醇，該蛋白為scFv與堿性磷酸酶的融合蛋白）溫育，再將未結(jié)合半抗原的融合蛋白與識(shí)別scFv互補(bǔ)位的鼠Ab2β形成復(fù)合物，進(jìn)而被抗鼠IgG包被的磁球分離除去，上清中剩下的為半抗原與scFv-ALP的復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步被微孔板上包被的Ab2α捕獲，抗原濃度與ALP成正相關(guān)關(guān)系。該方法的檢出限可以達(dá)到每測(cè)試20 amol·L-1，且測(cè)量范圍非常寬，遠(yuǎn)寬于競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫檢測(cè)。該課題組采用類似的方法，用針對(duì)半抗原的抗體、Ab2α和Ab2β建立了熊脫氧膽酸7-N-乙酰葡萄糖胺的非競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)平臺(tái)，其靈敏度達(dá)118 amol·L-1，且特異性較好［33］。

圖3 基于Ab2的非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式[31]Fig. 3 Schematic illustration of Ab2-based noncompetitive immunoassay format[31]

目前，采用抗獨(dú)特型抗體進(jìn)行小分子免疫檢測(cè)的商業(yè)化產(chǎn)品很少，其中比較成功的是英國(guó)Selective Antibodies公司基于選擇性抗體系統(tǒng)（selective antibody system）開(kāi)發(fā)的免疫層析檢測(cè)，該系統(tǒng)采用了2株抗體和1種阻斷劑，其中1株抗體是針對(duì)半抗原的抗體Ab1，另一株抗體是針對(duì)Ab1的Ab2，阻斷劑是1種半抗原-蛋白偶聯(lián)物。在半抗原與Ab1結(jié)合后，Ab2仍可以結(jié)合Ab1，而未結(jié)合半抗原的Ab1被阻斷劑結(jié)合后，由于空間位阻使Ab2無(wú)法結(jié)合。在免疫層析檢測(cè)中，包被Ab1的納米金與樣本中的半抗原結(jié)合后，剩余的Ab1位點(diǎn)與阻斷劑結(jié)合，半抗原的納米金移動(dòng)到固定有Ab2的檢測(cè)線時(shí)，被Ab2捕獲并顯色，而結(jié)合阻斷劑的納米金則不會(huì)被Ab2捕獲，因此樣本中半抗原越多，顯色越強(qiáng)［34］（圖4）。

圖4 免疫層析系統(tǒng)檢測(cè)[34]Fig. 4 Detection of the immunochromatography system[34]

該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)包括：①檢測(cè)速度快，不需要與零值標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行顯色對(duì)比；②可以采用1株通用的Ab2進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需針對(duì)不同的Ab1進(jìn)行Ab2的開(kāi)發(fā)。然而其不足之處是對(duì)阻斷劑的要求較高，既要求阻斷劑與Ab1的結(jié)合能夠?qū)b2與Ab1的結(jié)合造成空間位阻，同時(shí)又不能與半抗原形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，避免降低靈敏度。

除同時(shí)采用Ab2α和Ab2β的非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式以外，也可以只采用1株抗伴型抗體（anti-metatype antibody）與半抗原特異性單抗實(shí)現(xiàn)非競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。Omi等［35］利用自主多樣化庫(kù)（autonomously diversifying library，ADLib）系統(tǒng)制備了針對(duì)雌二醇和25-羥基維生素D 2種半抗原-抗體免疫復(fù)合物的抗伴型單抗，并基于此建立了2種半抗原的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(cè)方法，其中25-羥基維生素D的檢出限可達(dá)2.1 ng·mL-1，對(duì)1，25-二羥基維生素D3等類似物的交叉顯著降低，且該方法與參考方法具有非常高的相關(guān)性。類似地，本團(tuán)隊(duì)也已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)25-羥基維生素D、醛固酮和雌二醇3種小分子半抗原的非競(jìng)爭(zhēng)法試劑，并已經(jīng)獲批國(guó)內(nèi)注冊(cè)證［16］，其分析性能相對(duì)于用同一株Ab1開(kāi)發(fā)的競(jìng)爭(zhēng)法，靈敏度、特異性和抗干擾能力均有顯著提升（表1）。本團(tuán)隊(duì)對(duì)此類抗體的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗伴型抗體只識(shí)別Ab1可變區(qū)和半抗原結(jié)合后形成復(fù)合物的新表位，并不識(shí)別半抗原和Ab1本身，具體如圖5所示。

表1 非競(jìng)爭(zhēng)法與競(jìng)爭(zhēng)法分析性能指標(biāo)對(duì)比數(shù)據(jù)Table 1 Comparison of performance indicators between non-competitive and competitive assays

圖5 抗伴型抗體的結(jié)合位點(diǎn)Fig. 5 The binding site of anti-metatype antibody

雖然非競(jìng)爭(zhēng)法相對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)法具有明顯優(yōu)勢(shì)，但是采用傳統(tǒng)動(dòng)物免疫技術(shù)制備Ab2α和Ab2β的配對(duì)組合是比較困難的，細(xì)胞陽(yáng)性克隆率低，需要繁瑣的篩選過(guò)程。近年來(lái)，采用噬菌體展示技術(shù)制備Ab2α和Ab2β使流程得以簡(jiǎn)化和改進(jìn)，因此引起了研究人員的重視。Shu等［36］以抗伏馬菌素B1單抗為靶分子，從羊駝天然納米抗體噬菌體文庫(kù)中篩選到與之結(jié)合的Ab2α和Ab2β，建立的非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA對(duì)半抗原的檢出限為0.19 ng·mL-1，而競(jìng)爭(zhēng)性ELISA為3.41 ng·mL-1。

Ab2的使用除了能提高檢測(cè)靈敏度，還能顯著改變Ab1的交叉反應(yīng)性。Li等［37］用黃曲霉毒素-蛋白偶聯(lián)物作為包被抗原時(shí)，評(píng)估了1株針對(duì)黃曲霉毒素的Ab1對(duì)黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的交叉率，分別為100%、92%、54%和6.7%；而當(dāng)將偶聯(lián)物更換為1株Ab2時(shí)，對(duì)這4種類似物的交叉率分別變?yōu)?00%、54.4%、90.4%和37.7%［38］。采用不同的Ab2可以調(diào)節(jié)Ab1對(duì)不同半抗原類似物的交叉反應(yīng)性，因此，可以通過(guò)Ab2的應(yīng)用改善目前普遍存在的半抗原檢測(cè)特異性問(wèn)題。

3.3 基于噬菌體的Ab2免疫檢測(cè)分析模式

基于噬菌體顆粒的Ab2免疫檢測(cè)方法主要包括以下3種：①噬菌體展示ELISA（phage display ELISA，PD-ELISA）；②噬菌體展示免疫PCR（phage display immuno-PCR，PD-IPCR）；③噬菌體展示免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（phage display immunoloop-mediated isothermal amplification，PD-iLAMP）。這3種檢測(cè)方法均采用噬菌體顆粒與半抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被Ab1的模式。在PD-IPCR和PD-iLAMP中，結(jié)合的Ab1噬菌體顆粒在洗脫后用于后續(xù)的RT-PCR或LAMP。采用噬菌體顆粒的優(yōu)勢(shì)在于，首先噬菌體表面衣殼蛋白的重復(fù)序列可以提供多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其與DNA擴(kuò)增技術(shù)組合使用能夠顯著放大信號(hào)，提升分析靈敏度。其次，將培養(yǎng)物簡(jiǎn)單離心即可收集噬菌體顆粒，使用方便［39-40］。

在使用相同Ab2納米抗體的前提下，與標(biāo)準(zhǔn)ELISA或PD-ELISA相比，PD-IPCR顯著提高了靈敏度，這在赭曲霉毒素A［40］、桔青霉素［41］和玉米赤霉烯酮［42］中均已被證明。然而，PD-IPCR的不足之處主要在于需要昂貴的熒光定量PCR儀以及較長(zhǎng)的擴(kuò)增時(shí)間［43］，而且PCR對(duì)檢測(cè)環(huán)境和條件有特殊的要求，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。Lei等［44］將競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)和LAMP結(jié)合，構(gòu)建了一種適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)黃曲霉毒素的PD-iLAMP方法。LAMP中采用了1種金屬離子指示劑羥基萘酚藍(lán)，當(dāng)樣本中含有黃曲霉毒素時(shí)，溶液顏色為藍(lán)紫色，當(dāng)樣本中不含黃曲霉毒素時(shí)，溶液變?yōu)樘焖{(lán)色（圖6）。這種方法檢測(cè)花生中黃曲霉毒素B1的目測(cè)檢出限為1.6 μg·kg-1，靈敏度不及該課題組建立的免疫層析法。分析可能的原因是毒素提取液中含有大量甲醇，為了消除溶劑和基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證LAMP擴(kuò)增效果，擴(kuò)增前將樣本進(jìn)行了較大比例的稀釋（16倍），因此降低了LAMP的檢測(cè)靈敏度。

4 展望

建立安全、特異、靈敏、快速的半抗原檢測(cè)方法是目前眾多檢測(cè)領(lǐng)域的迫切需求。Ab2作為一種半抗原的替代，可以應(yīng)用于不同類型的免疫檢測(cè)方法中，在競(jìng)爭(zhēng)法中可以替代半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，避免了毒性半抗原的使用，改善了檢測(cè)的交叉反應(yīng)率。在非競(jìng)爭(zhēng)法中，可以與Ab1聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)比競(jìng)爭(zhēng)法更高的靈敏度和特異性。Ab1和抗伴型抗體相結(jié)合的非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式可能代表了半抗原免疫檢測(cè)未來(lái)的發(fā)展方向。Ab2是針對(duì)Ab1產(chǎn)生的，不同的Ab2對(duì)檢測(cè)的性能有不同的影響，但要實(shí)現(xiàn)對(duì)半抗原的靈敏特異性檢測(cè)，Ab1的性能也是一個(gè)重要的前提條件。盡管目前的初步研究已經(jīng)證明，Ab2在半抗原免疫檢測(cè)中對(duì)性能改善有較大的幫助，但Ab2的制備依然存在一定的難度，其篩選方法也難以標(biāo)準(zhǔn)化。因此，目前沒(méi)有一種基于Ab2的半抗原免疫檢測(cè)方法被國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可，其性能與半抗原檢測(cè)的參考方法LC-MS/MS仍有一定的差距。即便Ab2的使用極大地改善了半抗原的檢測(cè)性能，但由于臨床檢測(cè)試劑需要重新建立參考區(qū)間和陽(yáng)性判斷值，因此離大規(guī)模臨床應(yīng)用還有一段距離。

在Ab2的制備方面，與動(dòng)物免疫相比，免疫抗體庫(kù)、天然抗體庫(kù)和合成抗體庫(kù)為篩選不同性質(zhì)的Ab2提供了更多的可能性。在不改變Ab1的前提下，通過(guò)搭配使用不同的Ab2來(lái)提升檢測(cè)特異性可能是未來(lái)的一個(gè)重要研究方向。