耿斐

(山東建筑大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東 濟(jì)南 250101)

0 引言

蛋白質(zhì)是一類兩性物質(zhì)，可以與包括表面活性劑[1-2]、藥物[3-4]、染料[5-6]以及金屬離子[7]等在內(nèi)的許多種類的小分子結(jié)合。 蛋白質(zhì)的功能是由特定的三維空間結(jié)構(gòu)決定的，與小分子的相互作用會(huì)引起分子中各級結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)變化和生物活性喪失，最嚴(yán)重的還會(huì)引起變性。 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)來源豐富，性質(zhì)穩(wěn)定，在眾多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，是人類最早研究的蛋白質(zhì)之一[1]。 GHOSH 等[8]研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑極性頭基的疏水性在穩(wěn)定蛋白質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用，極性頭基的疏水性越強(qiáng)，與蛋白質(zhì)結(jié)合效率越高。 胡曉熙等[9]通過熒光光譜法，從作用機(jī)理、結(jié)合常數(shù)及位點(diǎn)數(shù)、作用力類型等方面，研究了全氟烷基甜菜堿與BSA 的相互作用，補(bǔ)充了全氟表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用的研究數(shù)據(jù)。

現(xiàn)有報(bào)道多關(guān)注傳統(tǒng)陰、陽離子表面活性劑與BSA 的相互作用，而結(jié)構(gòu)可調(diào)、功能化的表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用的研究雖有報(bào)道，但稍顯欠缺。陽離子表面活性劑1-十四烷基-3-甲基咪唑溴(1-tetradecyl-3-methylimidazolium bromide， C14mimBr)具有更高的表面活性[10]，研究其與BSA 的相互作用，有助于發(fā)掘長鏈咪唑類表面活性劑的特別之處，開拓咪唑類表面活性劑的應(yīng)用領(lǐng)域。 文章通過測量C14mimBr/BSA 體系的表面張力值、電導(dǎo)率值、靜態(tài)熒光、內(nèi)源熒光、圓二色及相互作用焓，考察了C14mimBr與BSA 相互作用過程中的熱力學(xué)參數(shù)、作用方式、作用參數(shù)以及BSA 結(jié)構(gòu)的變化。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C14mimBr 根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法合成，過程為:控制溫度在75 ～80 ℃范圍，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，甲基咪唑、過量的溴代十四烷和乙腈攪拌回流反應(yīng)48 h，之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去過量的溴代烷烴和乙腈，減壓蒸餾以除去水，即得到最終產(chǎn)物。 C14mimBr 結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。 BSA 購自美國Amresco 公司；十四烷基三甲基溴化銨( Tetradecyl Trimethyl Ammonium Bromide， TTAB)，分析純，購自美國Sigma-Aldrich 公司；碘化鉀KI，分析純，購自上海國藥集團(tuán)。

圖1 1-十四烷基-3-甲基咪唑溴結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與方法

在JYW-200B 型表面張力儀上使用吊環(huán)法通過單測得到表面張力數(shù)值，至少測量2 次，直到測得的誤差＜0.2 mN/m。 使用DDS-307 型電導(dǎo)率儀測量體系的電導(dǎo)率。 以上實(shí)驗(yàn)的溫度分別為25、35、45 ℃

使用LS-55 熒光光譜儀測量熒光:內(nèi)源熒光測定固定激發(fā)波長為280 nm，于295 ～440 nm 范圍內(nèi)掃描C14mimBr/BSA 體系；同步熒光測定固定激發(fā)和發(fā)射的波長差Δλ＝60 nm，于200 ～400 nm 范圍內(nèi)掃描C14mimBr/BSA 體系。 使用J-810 遠(yuǎn)紫外圓二色光譜儀，測量時(shí)帶寬為2 nm，通過儀器自帶的Secondary Structure 軟件計(jì)算得到BSA 二級結(jié)構(gòu)。使用Thermal Activity Monitor 2277 等溫滴定微量熱儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn):注射器每次注入12 μL 表面活性劑進(jìn)入裝著0.50 mL BSA 的樣品池，共注入24 次，注入后的平衡時(shí)間均為45 min。 待基線在30 r/min 的攪拌下穩(wěn)定后再啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)。 攪拌熱已由程序自動(dòng)扣除。 以上實(shí)驗(yàn)的溫度均為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 C14mimBr/BSA 體系表面張力

測定了25、35、45 ℃ 時(shí)C14mimBr/BSA 體系(BSA 質(zhì)量濃度ρ為0.68 g/L)的表面張力，如圖2所示。 曲線有兩個(gè)明顯的拐點(diǎn)，根據(jù)蛋白質(zhì)與表面活性劑相互作用的規(guī)律可知，第一個(gè)拐點(diǎn)表明BSA開始與C14mimBr結(jié)合，此時(shí)對應(yīng)的C14mimBr 濃度稱為臨界聚集濃度(Critical Aggregation Concentration，CAC)。 由于BSA 的存在，增加的C14mimBr分子大都與之結(jié)合，吸附在溶液表面的C14mimBr 沒有明顯增加，所以表面張力數(shù)值的變化很小，出現(xiàn)了第一個(gè)平臺(tái)。 CAC 的出現(xiàn)說明C14mimBr 和BSA 的相互作用優(yōu)先于膠束的形成。 第二個(gè)拐點(diǎn)表明C14mimBr 與BSA 的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和，C14mimBr 開始形成膠束，達(dá)到了臨界膠束濃度(Critical Micelle Concentration，CMC)。

圖2 不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)表面張力圖

BSA 中共有3 個(gè)亞結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞結(jié)構(gòu)是由雙胱氨酸鍵連接兩個(gè)次級區(qū)域形成的，而每個(gè)次級區(qū)域由3 段螺旋結(jié)構(gòu)組成，其相互平行，形成一個(gè)槽形區(qū)域。 絕大部分疏水殘基都分布在螺旋和槽內(nèi)，所以次級區(qū)域有疏水內(nèi)核；在次級區(qū)域的頂端開口部分分布著一些非極性殘基，所以次級區(qū)域有極性外表。C14mimBr 疏水尾部可以進(jìn)入BSA 非極性的內(nèi)部，而其親水頭基則以靜電作用與BSA 極性的殘基結(jié)合。由圖2 可知，溫度改變對CAC 沒有影響。 已知靜電相互作用受溫度的影響很小，所以在CAC 時(shí)，C14mimBr主要以咪唑頭基通過靜電作用與BSA 中的極性殘基相互作用。

測量了不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(BSA質(zhì)量濃度變化)的表面張力，如圖3 所示。 CAC 不隨BSA 質(zhì)量濃度的增大而變化，而CMC 隨著BSA質(zhì)量濃度的增大而升高。不同溫度下體系的CMC數(shù)值見表1。

表1 不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(BSA 質(zhì)量濃度變化)CMC 值表

圖3 不同溫度下C1 4mimBr/BSA 體系(BSA 質(zhì)量濃度變化)表面張力圖

CMCwithBSA-CMCwithoutBSA即為結(jié)合到BSA 上的C14mimBr 的量。 以其對BSA 質(zhì)量濃度作圖，如圖4所示。 曲線隨BSA 質(zhì)量濃度的增加線性增長，求得直線斜率，即為BSA 結(jié)合C14mimBr 的量。 得到每克BSA 結(jié)合C14mimBr 的量分別為1.66×10-4mol(25 ℃)、1.99×10-4mol(35 ℃)及1.80×10-4mol(45 ℃)。

圖4 CMCwith BSA-CMCwithout BSA對BSA 質(zhì)量濃度作圖

2.2 C14mimBr/BSA 體系熱力學(xué)參數(shù)

測定了25、35、45 ℃ 時(shí)，C14mimBr/BSA 體系(ρBSA＝0.68 g/L)的電導(dǎo)率，如圖5 所示。 所得曲線雙折線的折點(diǎn)對應(yīng)著膠束的形成。 反離子解離度α＝膠束形成后的直線斜率/膠束形成前的直線斜率；反離子結(jié)合度β＝1-α。 根據(jù)圖5，經(jīng)過計(jì)算可知，25、35、45 ℃時(shí)，C14mimBr/BSA 體系的反離子結(jié)合度β分別為0.72、0.72 和0.67。

圖5 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)在不同溫度下的電導(dǎo)率圖

根據(jù)質(zhì)量作用模型，熱力學(xué)參數(shù)可以由式(1)～(3)表示為

式中ΔGmic和ΔHmic分別為膠束形成的吉布斯自由能和焓，kJ/mol；ΔSmic為膠束形成的熵，kJ/(mol·K)；T為溫度，K；R為常數(shù)，取值為8.314。

不同溫度下，C14mimBr/BSA 體系的熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果見表2。 ΔGmic值均為負(fù)，說明膠束的形成是自發(fā)的。ΔHmic和-TΔSmic均為負(fù)值，說明膠束的形成是熵焓共驅(qū)過程。

表2 不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)熱力學(xué)參數(shù)表

2.3 C14mimBr/BSA 體系遠(yuǎn)紫外圓二色光譜

C14mimBr 與BSA 的相互作用會(huì)導(dǎo)致BSA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生一些變化，可以通過圓二色光譜檢測BSA 二級結(jié)構(gòu)的改變。 在圓二色光譜上，α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰表現(xiàn)為208 及222 nm 附近的兩個(gè)負(fù)槽，β-折疊結(jié)構(gòu)的特征峰表現(xiàn)為215 nm 附近的負(fù)槽。

C14mimBr/BSA 體系(ρBSA＝0. 68 g/L) 隨C14mimBr濃度變化的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜如圖6 所示。 可以看出:當(dāng)C14mimBr 的濃度較低(1×10-8～1×10-4mol/L)時(shí)，BSA 的二級構(gòu)象幾乎沒有改變，可能是因?yàn)镃14mimBr 分子與BSA 的高能位點(diǎn)結(jié)合，穩(wěn)定了其二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其構(gòu)象更加緊密；當(dāng)C14mimBr 的濃度達(dá)到1 × 10-3mol/L 時(shí)，215 和222 nm處的負(fù)槽消失，說明BSA 的二級構(gòu)象被破壞。

圖6 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)遠(yuǎn)紫外圓二色光譜圖

C14mimBr/BSA 體系中，BSA 二級構(gòu)象質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表3。 低濃度(＜1×10-4mol/L)的C14mimBr 增加了BSA 中α-螺旋及β-折疊的量，穩(wěn)定了BSA 的二級結(jié)構(gòu)；高濃度(＞1×10-4mol/L)的C14mimBr 使BSA 中α-螺旋及β-折疊的量顯著降低，破壞了BSA 的二級結(jié)構(gòu)。

表3 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)中BSA二級構(gòu)象質(zhì)量分?jǐn)?shù)表

2.4 C14mimBr/BSA 體系熒光光譜

2.4.1 C14mimBr/BSA 體系內(nèi)源熒光光譜

圖7 顯示了 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA＝0.68 g/L)中BSA 的內(nèi)源熒光隨C14mimBr 濃度的變化。 色氨酸殘基的熒光光譜對微環(huán)境的變化很敏感，其峰位一般在波長為325 ～350 nm 之間變動(dòng)。由圖7 可知，體系的熒光發(fā)射峰是BSA 中色氨酸殘基的特征熒光光譜。 C14mimBr 的加入(0～1×10-3mol/L)導(dǎo)致最大熒光發(fā)射峰峰值的降低，色氨酸殘基的最大峰峰值從509 下降到258，同時(shí)伴隨著峰位的藍(lán)移，最大峰位置從350 nm 移到332 nm，說明色氨酸殘基暴露于更加疏水的環(huán)境中。此時(shí)，C14mimBr 還沒有形成膠束，這種現(xiàn)象只能歸因于C14mimBr 與BSA 形成了復(fù)合物。 隨著C14mimBr的濃度進(jìn)一步加大，大于0.01 mol/L 時(shí)，最大熒光發(fā)射峰峰值與峰位置幾乎不再發(fā)生變化，此時(shí)造成了BSA 的變性。

圖7 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)內(nèi)源熒光光譜圖

2.4.2 C14mimBr/BSA 體系結(jié)合參數(shù)

熒光淬滅可以揭示淬滅劑對熒光物質(zhì)的淬滅位置。 一般來講，表面活性劑對色氨酸殘基的淬滅是因?yàn)殪o態(tài)淬滅形成了不能發(fā)射熒光的激基締合物[12]。 為了驗(yàn)證C14mimBr 與BSA 的淬滅是否是靜態(tài)淬滅，應(yīng)用Stern-Volmer 方程計(jì)算結(jié)合淬滅過程的反應(yīng)速度Kq，方程由式(4)表示為

式中I、I0分別為不含、含有淬滅劑時(shí)的最大熒光發(fā)射峰峰值；τ為不含淬滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的壽命，對BSA 而言，τ＝6 nm[13]；cQ為淬滅劑的濃度，mol/L。

圖8 為I0/I對C14mimBr 濃度曲線，Kqτ是曲線線性部分的斜率，計(jì)算可得Kq為2.81×1011L/mol·s。對于動(dòng)態(tài)淬滅反應(yīng)，反應(yīng)速度Kq最大為1.00×1011L/mol·s[14]，這就說明C14mimBr 對BSA 的淬滅過程是靜態(tài)淬滅。

圖8 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)相對熒光強(qiáng)度對C14mimBr 濃度作圖

在靜態(tài)淬滅過程中，假設(shè)淬滅劑與熒光物質(zhì)的n個(gè)獨(dú)立且相同的結(jié)合位作用，已經(jīng)結(jié)合的部位之間無相互作用，結(jié)合反應(yīng)可由式(5)表示為

式中Q 與P 分別為淬滅劑與熒光物質(zhì)；QnP 為激基締合物。

平衡常數(shù)K可由式(6)表示為

式中c為濃度，mol/L。

對式(6)兩側(cè)取對數(shù)，并將熒光物質(zhì)與激基締合物都用其相應(yīng)的最大熒光發(fā)射峰峰值表示，式(6)可變形成式(7)

將C14mimBr/BSA 體系的對lgc作圖，如圖9 所示。 通過曲線的斜率與截距，可以計(jì)算得到結(jié)合位點(diǎn)n與平衡常數(shù)K。 可得C14mimBr/BSA體系的n＝0.97、K＝1 000 L/mol。 推測在考察的濃度范圍內(nèi)(C14mimBr 為3×10-5～1×10-3mol/L)，C14mimBr與BSA 之間為疏水相互作用。 根據(jù)2.1 部分中表面張力曲線，已知在CAC 附近時(shí)，C14mimBr與BSA 以靜電相互作用為主，可知:當(dāng)C14mimBr 濃度較小時(shí)，其極性頭基先以靜電相互作用與BSA 特定的結(jié)合位點(diǎn)作用；當(dāng)C14mimBr 濃度較大時(shí)，其疏水尾鏈再以疏水作用與BSA 的非極性殘基部分結(jié)合。

圖9 對C14mimBr 濃度作圖

BSA 分子中含有兩個(gè)色氨酸殘基，一個(gè)位于BSA 的疏水空腔內(nèi)，另一個(gè)位于外層。 C14mimBr 與BSA 相互作用的結(jié)合位點(diǎn)n為0.97，說明一個(gè)C14mimBr只與一個(gè)色氨酸殘基作用。 為了驗(yàn)證推測，即在考察的濃度范圍內(nèi)(C14mimBr 濃度為3×10-5～1×10-3mol/L)，C14mimBr 與BSA 之間為疏水相互作用，在C14mimBr/BSA 體系中加入I-。 I-作為淬滅劑僅能與BSA 表面的色氨酸殘基反應(yīng)，而不能進(jìn)入BSA 內(nèi)部淬滅色氨酸殘基[15]。 I-對色氨酸殘基的淬滅是動(dòng)態(tài)淬滅，可由式(8)表示為

式中f為可以被淬滅的殘基占總殘基的比例。

含有與不含有C14mimBr 時(shí)，I-對BSA 熒光強(qiáng)度的影響如圖10 所示。 通過對圖10 中曲線的截距計(jì)算可知:不含有C14mimBr 時(shí)，f為58.74%；含有C14mimBr時(shí)，f為90.09%。 可見隨著C14mimBr 的加入，BSA 表面的色氨酸殘基所占比例增大。 表面色氨酸殘基的數(shù)量不會(huì)增加，所以f增大只能是由于C14mimBr的加入，使BSA 內(nèi)部的色氨酸殘基的數(shù)量降低，由此可知C14mimBr 只能通過疏水作用與BSA內(nèi)部的色氨酸殘基作用。

圖10 I-濃度對BSA 熒光強(qiáng)度的影響圖

2.4.3 C14mimBr/BSA 體系同步熒光光譜

C14mimBr/BSA 體系(BSA 為0.68 g/L)的同步熒光光譜如圖11 所示。 Δλ＝60 nm 時(shí)的同步熒光是色氨酸殘基的。 隨著C14mimBr 的加入，色氨酸殘基的最大發(fā)射峰峰值降低，但是最大峰位置未發(fā)生變化，表明C14mimBr 與BSA 的相互作用沒有影響色氨酸殘基的微環(huán)境。 當(dāng)C14mimBr 的濃度＞0.01 mol/L時(shí)，BSA 熒光光譜不再發(fā)生變化，此時(shí)BSA 發(fā)生變性，這與遠(yuǎn)紫外圓二色光譜及內(nèi)源熒光光譜的結(jié)果相吻合。

圖11 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)同步熒光光譜圖

2.5 C14mimBr/BSA 體系等溫滴定微量熱

蛋白質(zhì)與表面活性劑作用的等溫滴定微量熱控制實(shí)驗(yàn)包括膠束及蛋白質(zhì)的稀釋熱，已有實(shí)驗(yàn)證明蛋白質(zhì)的稀釋熱可以忽略[16]。 扣除控制實(shí)驗(yàn)之后，C14mimBr/BSA及TTAB/BSA 體系(BSA 均為0.68 g/L)的等溫滴定微量熱曲線如圖12 所示。 兩體系曲線的變化趨勢類似，可以按反應(yīng)進(jìn)程將曲線劃分為3 部分。第一進(jìn)程(c＜c1)，BSA 的高能位點(diǎn)與表面活性劑分子結(jié)合， BSA 的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。 此階段作用焓隨著表面活性劑濃度的增大逐漸減小，說明隨著相互作用，BSA 上特定的高能位點(diǎn)逐漸減少。根據(jù)2.1及2.4部分分析，此時(shí)表面活性劑的極性頭基先通過靜電作用與BSA 帶負(fù)電荷的氨基酸殘基作用，尾鏈再通過疏水作用與BSA 的疏水氨基酸殘基作用。 第二進(jìn)程(c1＜c＜c2)，BSA 的二級結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子逐步展開，最終發(fā)生變性。 此階段作用焓隨著表面活性劑濃度的增大逐漸變大，c2所對應(yīng)的作用焓最大值是BSA 發(fā)生變性時(shí)產(chǎn)生的熱量[16]。 此階段C14mimBr/BSA體系的熱量變化比TTAB/BSA 體系的明顯， 說明在破壞BSA 的二級結(jié)構(gòu)方面，C14mimBr要強(qiáng)于TTAB。 這主要由于C14mimBr 分子的咪唑頭基之間有氫鍵，當(dāng)與BSA 作用時(shí)，要先克服氫鍵作用。 第三進(jìn)程(c＞c2)，表面活性劑開始形成膠束，熱量急劇減小至零。

圖12 C14mimBr/BSA 及TTAB/BSA 體系熱流曲線圖

3 結(jié)論

通過上述研究，得到以下結(jié)論:

(1) 咪唑型表面活性劑C14mimBr 與BSA 的相互作用與其濃度有著密切的關(guān)系。 當(dāng)C14mimBr 濃度較低時(shí)，作用方式為靜電相互作用，C14mimBr 的加入穩(wěn)定了BSA 的二級結(jié)構(gòu)；當(dāng)C14mimBr 濃度較大時(shí)，作用方式為疏水相互作用，C14mimBr 的加入破壞了BSA 的二級結(jié)構(gòu)并最終導(dǎo)致其變性。

(2) C14mimBr 與BSA 內(nèi)部空腔里的色氨酸殘基的作用方式為疏水相互作用，對色氨酸殘基的淬滅是導(dǎo)致BSA 內(nèi)源熒光改變的原因。

(3) 通過計(jì)算可知，每克BSA 可以結(jié)合的C14mimBr的量約為2×10-4mol，不同溫度下的結(jié)合量略有差別。

(4) 對比C14mimBr/BSA、TTAB/BSA 體系作用焓可知，在破壞BSA 的二級結(jié)構(gòu)方面，C14mimBr 要強(qiáng)于傳統(tǒng)的陽離子表面活性劑TTAB。