不同品種肉牛肌內(nèi)脂肪沉積相關基因比較研究

施 安 孫文陽 陳志龍 李 博 侯鵬霞* 梁小軍*

(1.寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所,銀川 750002;2.寧夏農(nóng)林科學院固原分院,固原 756099;3.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院,楊凌 712100)

西門塔爾(Simmental)和安格斯(Angus)是我國具有優(yōu)勢特色和發(fā)展?jié)摿Φ闹饕馀Ｆ贩N。研究發(fā)現(xiàn),安格斯牛肉有呈現(xiàn)低飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、高亞麻酸(C18∶3n3)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)含量的趨勢,并且其肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量較高[1-2]。此外,安格斯牛肉在多汁、嫩度和風味上均優(yōu)于中國西門塔爾牛肉[3-4],是打造高端牛肉市場上的主推品種。

IMF直接影響牛肉的品質(zhì)和風味[5-6],其由肌原性干細胞和前脂肪細胞分化轉(zhuǎn)移形成[7],也可以從成纖維細胞樣前脂肪細胞到成熟脂肪細胞的多步驟分化形成[8];其中,前脂肪細胞還通過旁分泌因子的細胞間通訊、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和細胞-細胞黏附調(diào)節(jié)與周圍結(jié)締組織的增殖、分化和脂肪生成[9]。前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的轉(zhuǎn)化是由一系列轉(zhuǎn)錄因子控制的,其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α,C/EBPα)被認為是關鍵的成脂因子,它們共同發(fā)揮多效轉(zhuǎn)錄激活因子的作用,包括脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase,FAT)和產(chǎn)生脂肪細胞表型的周圍脂素[10-11]。在PPARγ和C/EBPα誘導之前,還有其他轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動成脂程序,包括CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBPβ)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白δ(CCAAT/enhancer binding protein δ,C/EBPδ)、Krüpple樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factor,KLF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)等早期成脂因子[12-13]。

轉(zhuǎn)錄組測序(transcriptome sequencing,RNA-Seq)可精確獲得某一物種在特定條件下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達狀況。利用高通量測序計算mRNA表達量,結(jié)合生物信息分析可高效獲得性狀相關基因的表達模式與功能差異[14-15]。Zheng等[3]對安格斯牛和中國西門塔爾牛的糞便和背最長肌進行多組學分析發(fā)現(xiàn),安格斯牛的腸道微生物多樣性明顯高于中國西門塔爾牛,中國西門塔爾牛蛋白上調(diào)的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)主要參與免疫和炎癥反應,而安格斯牛蛋白上調(diào)的DEGs主要參與肌肉系統(tǒng)和肌原纖維的調(diào)節(jié),且該研究鑒定出了17個與肌肉和脂肪代謝相關的基因,包括肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)、肌球蛋白輕鏈磷酸化快肌(myosin light chain, phosphorylatable, fast skeletal muscle,MYLPF)、快速骨骼肌鈣蛋白T3(troponin T3, fast skeletal type,TNNT3)和脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)/FABP4等。Zhang等[16]對云嶺牛和中國西門塔爾牛的背肌轉(zhuǎn)錄組檢測出1 347個DEGs,且被差異調(diào)節(jié)的主要代謝途徑是脂肪分解和糖代謝。Ueda等[17]通過RNA-Seq鑒定出與日本和牛皮下和IMF形成的8個關鍵基因,包括羧肽酶E(carboxypeptidase E,CPE)、生腱蛋白C(tenascin C,TNC)、轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin,TAGLN)、Ⅳ型膠原α5(collagen type IV α5,COL4A5)、半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(cysteine and glycine-rich protein 2,CSP2)、PDZ和LIM域3(PDZ and LIM domain 3,PDLIM3)、磷酸酶1調(diào)節(jié)抑制因子14A亞基(phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 14A,PPP1R14A)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶調(diào)節(jié)因子2(regulator of calcineurin 2,RCAN2)。本試驗對寧夏地區(qū)西門塔爾和安格斯肉牛的背最長肌肉質(zhì)特性進行了對比研究及RNA-Seq,結(jié)合生物信息鑒定出可能影響IMF沉積的DEGs,并對其表達特性進行分析,為闡明肉牛IMF沉積的調(diào)控機制和改善肉品質(zhì)提供一定的理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

選用來自寧夏永寧某養(yǎng)殖場親緣關系和月齡相近、飼糧結(jié)構相同以及飼養(yǎng)管理條件一致的西門塔爾和安格斯公牛各3頭,平均體重為(700±10) kg,組間差異不顯著(P>0.05)。

試驗牛于2022年5月統(tǒng)一屠宰,采集胴體第12根肋骨處背最長肌樣品。取500 g樣品于4 ℃熟化24 h,用于熟肉率和系水力(參考NY/T 1333—2007方法)、剪切力(參考NY/T 1180—2006方法)以及氨基酸(參考GB 5009.124—2016方法)和脂肪酸(參考GB 5009.168—2016方法)含量的測定;另取500 g樣品于-20 ℃保存,用于蛋白質(zhì)和IMF含量的測定(剔除表面筋膜和脂肪);采集5 g左右樣品組織于專用固定液保存,用于肌纖維組織特性的測定[蘇木精-伊紅(HE)染色];取1 cm3左右樣品錫紙包裹投入液氮于-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.2 RNA的提取與建庫測序

采用TRIzol(Invitrogen,美國)試劑盒從背最長肌樣品中提取RNA樣本,通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,美國)檢測RNA樣本的完整性和純度。篩選出符合28S rRNA∶18S rRNA≥1.0且RNA完整度(RIN)≥7條件的樣本,通過Oligo(dt)磁珠吸附法構建mRNA文庫,庫檢合格后,不同文庫按照有效濃度及目標上機數(shù)據(jù)量的需求進行Illumina NovaSeq 6000測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

對測序獲取的原始數(shù)據(jù)篩選過濾后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean reads),利用HISAT2 2.0.5軟件與牛(Bostaurus)的參考基因組比對(參考基因組版本為USDA ARS-UCD1.2)[18]。采用FeatureCounts 1.5.0統(tǒng)計每個基因的每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads,FPKM),再結(jié)合StringTie 1.3.3b對基因進行定量[19]。采用DESeq2 1.20.0軟件進行2個肉牛品種之間的差異基因表達分析[20],顯著差異表達閾值為校正后的P值(Padj)<0.05及|log2[差異倍數(shù)(fold change,FC)]|>1,對DEGs進行主成分分析(PCA),并可視化每個個體的基因表達譜。

1.4 DEGs富集分析

采用clusterProfile 3.8.1 R語言包對DEGs集進行基因本體(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析[21],均以Padj<0.05作為顯著性富集的閾值,根據(jù)DEGs的顯著性水平和肌纖維、脂質(zhì)發(fā)育關聯(lián)注釋信息篩選出與IMF沉積相關的主控基因和調(diào)控通路。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析

為驗證RNA測序數(shù)據(jù),采用RT-qPCR檢測DEGs。背最長肌組織分離的總RNA樣品采用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa,日本)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,去除基因組DNA。采用SYBR Green試劑盒(QIAGEN,美國)進行RT-qPCR分析。將所選DEGs的表達水平與內(nèi)參基因β-肌動蛋白(β-actin)進行歸一化處理。PCR反應條件為:95 ℃反應10 min,40個循環(huán),95 ℃反應15 s,60 ℃反應60 s。采用2-ΔΔCt法計算DEGs的相對表達量。所有供試基因引物信息見表1。

表1 引物信息

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中的獨立樣品t檢驗進行差異顯著性分析,結(jié)果用“平均值±標準差”表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 西門塔爾牛和安格斯牛肉品質(zhì)及肌纖維特性分析

由表2可知,安格斯牛IMF含量和系水力極顯著高于西門塔爾牛(P<0.01),肌纖維直徑顯著低于西門塔爾牛(P<0.05);安格斯牛肌肉粗蛋白質(zhì)含量、熟肉率和肌纖維密度都高于西門塔爾牛,但差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉氨基酸和脂肪酸含量分析

由表3可知,試驗測定了非必需氨基酸(non essential amino acid,NEAA)和必需氨基酸(essential amino acid,EAA)各8種,2個品種牛肌肉的氨基酸組成成分一致,但含量存在差異。在NEAA中,安格斯牛肌肉酪氨酸含量極顯著高于西門塔爾牛(P<0.01),肌肉精氨酸含量極顯著低于西門塔爾牛(P<0.01)。在EAA中,2個品種牛肌肉各氨基酸含量差異均不顯著(P>0.05)。2個品種牛肌肉NEAA和EAA的總含量差異均不顯著(P>0.05),且EAA/TAA值均接近40%(理想值),即2個品種牛肌肉蛋白質(zhì)含量豐富。

肌肉中的脂肪酸可分為SFA、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。由表4可知,2個品種牛分別檢測到4種SFA、3種MUFA和4種PUFA,且各分類中的脂肪酸含量差異均不顯著(P>0.05),但西門塔爾牛肌肉SFA總含量高于安格斯牛,肌肉MUFA總含量低于安格斯牛,且肌肉PUFA含量2個品種接近,脂肪酸組成整體差異不大。

表2 西門塔爾牛和安格斯牛肉品質(zhì)及肌纖維特性分析

表3 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉氨基酸含量分析

表4 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉脂肪酸含量分析

2.3 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉RNA-Seq結(jié)果分析

由表5可知,采用Illumina NovaSeq 6000平臺對西門塔爾牛和安格斯牛背最長肌進行RNA-Seq,結(jié)果顯示,每組3個重復平均共產(chǎn)生45 677 571條cleanreads,150bp clean reads的堿基質(zhì)量值≥30的堿基所占百分比(Q30)平均值為93.96%,而每個樣品的平均鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)含量為51.02%,表明測序數(shù)據(jù)的結(jié)果可靠,質(zhì)量穩(wěn)定。此外,每個樣本約96%被定位到參考基因組,有93%左右被定位到唯一參考基因組的基因區(qū)域。

表5 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉RNA-Seq結(jié)果分析

2.4 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs分析

由圖1可知,通過盒形圖展示西門塔爾牛和安格斯牛之間基因表達值FPKM分布的對比情況發(fā)現(xiàn),西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs的表達模式相似。PCA結(jié)果(圖2)表明,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別為42.88%和20.57%。由圖3可知,安格斯牛3個重復樣本聚合緊密,重復性較好;而西門塔爾牛組內(nèi)分散,重復性較差,但2個品種之間比較分散,說明所用樣本分組合理。由圖4可知,與安格斯牛相比,西門塔爾牛共有1 214個候選基因在肌肉組織中差異表達,其中上調(diào)基因736個,下調(diào)基因478個。

圖1 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉基因

圖2 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉FPKM PCA結(jié)果

2.5 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs GO功能富集分析

DEGs注釋到GO數(shù)據(jù)庫中共顯著富集在了43個GO條目,在生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)分類中,包含的亞類分別為20、15和8個。從每個分類中各選取最顯著的前10個(分子功能為8個)條目繪制柱狀圖(圖5)。在生物過程分類中,參與生物合成和代謝的DEGs最多,數(shù)量分別為103和121個;在細胞組分分類中,細胞質(zhì)部分和細胞內(nèi)無膜細胞器富集的DEGs最多,數(shù)量分別為123和117個;在分子功能分類中,DEGs主要參與核糖體結(jié)構成分、結(jié)構分子活性和磷酸酯水解酶活性,數(shù)量分別為71、82和50個。

2.6 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs KEGG通路富集分析

從KEGG通路富集分析結(jié)果中,選取最顯著的20個注釋繪制散點圖(圖6),結(jié)合GeneCards在線查詢基因功能,進一步篩選與IMF沉積相關的DEGs,發(fā)現(xiàn)其主要富集在了心肌收縮(cardiac muscle contraction)、非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease)和逆行內(nèi)源性大麻素信號(retrograde endocannabinoid signaling)通路中,數(shù)量分別為42和47個;同時,共篩選出3個可能與IMF沉積相關的DEGs。與安格斯牛相比,西門塔爾牛肌肉淀粉樣前體蛋白(APP)為下調(diào)基因,肌肉原肌球蛋白2(TPM2)和鈣電壓門控通道亞基α1 S(CACNA1S)為上調(diào)基因,這3個調(diào)控基因的關鍵信息見表6。

2.7 RT-qPCR驗證結(jié)果

由圖7可知,在2種肉牛品種背最長肌中,安格斯牛肌肉CACNA1SRNA-Seq表達量極顯著高于西門塔爾牛(P<0.01),肌肉TPM2 RNA-Seq表達量也顯著高于西門塔爾牛(P<0.05),表明這2個基因?qū)MF沉積有促進作用;而肌肉APPRNA-Seq表達量在2種牛之間差異不顯著(P>0.05)。RT-qPCR驗證結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果相一致。

3 討 論

牛肉IMF含量與肉質(zhì)的細嫩多汁和口感風味等特性密切相關[22]。通常來說,IMF與肌肉嫩度[23-25]、系水力[26]、多汁性[27]以及肌纖維密度[28]呈正相關,與剪切力[29]和肌纖維直徑[28]呈負相關。本試驗測定肉質(zhì)相關性狀發(fā)現(xiàn),安格斯牛的IMF含量和系水力極顯著高于西門塔爾牛,肌纖維直徑顯著低于西門塔爾牛,肌肉粗蛋白質(zhì)含量、熟肉率和肌纖維密度都高于西門塔爾牛,而剪切力低于西門塔爾牛。這與上述IMF與肉品質(zhì)的相關性規(guī)律一致,也與趙偉明等[30]和韓信嶸[2]研究發(fā)現(xiàn)安格斯牛IMF含量高、肉品質(zhì)好的結(jié)果一致。此外,2個品種肉牛肌肉氨基酸組成的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩者EAA/TAA值都接近40%理想值,表明肌肉中都具有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。不過,與西門塔爾牛相比,安格斯牛肌肉的SFA總含量較低,而肌肉的MUFA總含量較高,但差異均不顯著,且兩者的PUFA總含量接近,總體而言,2個品種肌肉脂肪酸組成差異不大。通常來說,過高的肌肉SFA含量不利于人體健康,將會提升血液膽固醇水平[31],而不飽和脂肪酸不僅可以阻止動脈硬化[32],還能預防高血脂和冠心病的發(fā)生[33]。Chambaz等[4]在背最長肌平均IMF含量為3.25%的條件下,比較安格斯、西門塔爾、夏羅萊和利木贊閹牛的肉質(zhì)和大理石花紋特性發(fā)現(xiàn),安格斯牛的脂肪含量得分最高,IMF沉積最好,同時安格斯和利木贊牛比西門塔爾牛肉質(zhì)更嫩,這進一步說明了安格斯牛肉的優(yōu)秀品質(zhì)。為了進一步確定影響這些表型差異的候選基因和通路,本試驗采用Illumina NovaSeq 6000平臺對安格斯和西門塔爾2個肉牛品種的背最長肌組織進行RNA-Seq,并通過對DEGs GO功能和KEGG通路進行富集分析,鑒定出與IMF沉積有關的功能基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),一些DEGs參與了脂肪形成的生物過程,一些DEGs參與了脂肪組織發(fā)育的重要信號通路,結(jié)合GeneCards和RT-qPCR對相關功能基因進一步驗證篩選,得出了APP、TPM2和CACNA1S這3個基因,可為肉牛的脂肪沉積機制研究提供參考依據(jù)。

圖3 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs熱圖及聚類分析

圖4 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs火山圖

APP是一類具有胞外N端區(qū)、跨膜結(jié)構域和胞質(zhì)C端尾短的大蛋白分子[34]。APP與阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)斑塊相關,已知存在于大腦突觸和成人神經(jīng)肌肉接頭中[35],還存在于小鼠骨骼肌和培養(yǎng)的肌源細胞中,成年小鼠骨骼肌中APPmRNA下調(diào),會抑制脂肪細胞的成脂分化[36-37]。此外,Wu等[38]研究發(fā)現(xiàn),當APP在小鼠肌肉中過度表達時,會引起肌無力和萎縮,表明APP低表達有利于肌肉及脂肪的適度沉積;通過熒光素酶報告基因檢測證明,APP是miR-101-1的潛在靶基因,而miR-101-1是一種廣泛表達的微小RNA(miRNA),主要在牛骨骼肌中富集,其豐度在胎牛、犢牛和成年牛的骨骼肌中存在差異;在C2C12成肌細胞細胞系分化過程中,內(nèi)源性miR-101-1會上調(diào),轉(zhuǎn)染miR-101-1會抑制C2C12成肌細胞分化,同時顯著降低肌原分化(myogenic differentiation,MyOD)、肌細胞生成素(myogenin,MyOG)和肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MyHC)的mRNA表達。APP與肉質(zhì)性狀有強相關,可作為豬肉剪切力和嫩度的數(shù)量性狀位點(QTL)[39]。而Lee等[40]在人體脂肪組織中研究發(fā)現(xiàn),APP參與肥胖相關胰島素抵抗和脂肪組織炎癥,在脂肪組織和肥胖群體中均高表達,其表達水平與脂肪沉積水平呈正相關,這與本試驗結(jié)果呈相反趨勢,可能與研究對象不同有關,其脂肪組織的細胞組成及成脂機制存在較大差異,具體原因需進一步研究。

圖5 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs GO功能富集分析

CACNA1S是編碼骨骼肌細胞中緩慢失活的L型電壓依賴性鈣通道的5個亞基之一,基因突變與骨骼肌代謝生長和脂肪堆積相關[41]。骨骼肌電壓傳感器Cav1.1也是一個電壓依賴性鈣離子(Ca2+)通道,允許少量Ca2+內(nèi)流進入哺乳動物骨骼肌纖維[42]。Georgiou等[43]研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了一條通路Cav1.1→鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ(CaMKⅡ)→一氧化氮和酶(NOS),能調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36在細胞內(nèi)的分布從而改變脂肪酸代謝。阻斷這一通路途徑可減少線粒體β氧化和能量消耗,促進肌纖維密度增大,由此說明CACNA1S能通過影響肌肉線粒體功能調(diào)節(jié)骨骼肌的能量消耗降低,從而導致IMF的沉積。Xue等[44]研究發(fā)現(xiàn),CACNA1S還涉及胰島素分泌、抵抗和信號通路相關的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡,通過調(diào)控長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的變化和甲基化影響能量代謝、信號通路和細胞增殖相關過程,是脂質(zhì)代謝的上游調(diào)控途徑,還與其他靶基因共同調(diào)控肌內(nèi)沉積過程。Ma等[45]研究結(jié)果也證實了上述結(jié)果,CACNA1S在啟動子區(qū)發(fā)生甲基化,與修飾基因表達呈負相關。Xue等[44]和Ma等[45]分別在蒙古羊和牦牛中均發(fā)現(xiàn)CACNA1S在啟動子區(qū)發(fā)生甲基化,參與脂質(zhì)代謝的上游調(diào)控途徑,調(diào)控動物肌肉的發(fā)育和肉質(zhì)。方曉敏等[46]推測CACNA1S是一個適合作為影響豬肉品質(zhì)性狀QTL的候選基因。有研究發(fā)現(xiàn),基本螺旋-環(huán)-螺旋芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白樣1(BMAL1)通過反向定位c-erbA-1α(reverse orientation the c-erbA-1alpha,REV-ERBα)控制CACNA1S表達來調(diào)節(jié)鈣信號,從而決定肌肉合成代謝或分解狀態(tài)的信號通路,可能是肌肉活動的分子傳感器[47]。

圖6 西門塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs前20 KEGG通路富集氣泡圖

表6 IMF沉積相關DEGs

TPM2編碼β-原肌球蛋白,是肌動蛋白纖維結(jié)合蛋白家族的一員,主要表達在慢速Ⅰ型肌纖維中,該基因的突變可改變其他肌原肌球蛋白蛋白的表達。TPM2在肌肉和非肌肉細胞中與肌動蛋白纖維結(jié)合,與肌鈣蛋白復合物一起,在脊椎動物橫紋肌收縮的鈣依賴調(diào)節(jié)中起核心作用[48]。Cho等[49]通過RNA和蛋白定量驗證了原肌球蛋白家族成員在韓牛、閹牛和公牛的肌內(nèi)脂肪組織(intramuscular adipose tissue,IMAT)和大血管脂肪組織(macrovascular adipose tissue,MAT)中參與肌肉發(fā)育密切相關的調(diào)控通路,與奶?；蜷幣Ｏ啾?IMAT中TPM2 mRNA和蛋白表達水平均較低,表明它們與大理石花紋評分和質(zhì)量等級呈正相關。本試驗中,DEGs富集注釋結(jié)果顯示,TPM2與肌原纖維、收縮纖維部分和肌動蛋白細胞骨架結(jié)構的KEGG通路相關,這與之前的研究結(jié)果[50-51]也一致,這為TPM2直接或間接參與脂肪沉積和脂肪酸代謝提供了證據(jù)。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示差異不顯著(P>0.05)。

在本研究中,在RT-qPCR驗證DEGs表達結(jié)果中,安格斯牛肌肉CACNA1S和TPM2 RT-qPCR相對表達量顯著高于西門塔爾牛,表明其對IMF沉積有促進作用,且與RNA-Seq的結(jié)果趨勢一致;而2種肉牛之間肌肉APP表達量差異不顯著,但相比于西門塔爾牛,安格斯牛肌肉APP表達量呈降低趨勢,表明其對脂肪沉積有負調(diào)控作用,這與RNA-Seq結(jié)果也是一致的,這也進一步支持了APP、CACNA1S和TPM2能夠參與調(diào)節(jié)IMF沉積關鍵通路,具有調(diào)節(jié)脂肪細胞分化和脂肪酸新陳代謝的分子功能的結(jié)論。

4 結(jié) 論

安格斯牛IMF沉積能力較強,肉品質(zhì)較好。RNA-Seq共篩選出了3個(APP、CACNA1S和TPM2)與肉牛IMF沉積相關的候選基因,這為研究肉牛IMF沉積調(diào)控機制提供了參考。